Name: a droplet-based microfluidic approach and microsphere-pcr amplification for single-stranded dna amplicons
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons at JoVE.com

Denne undersøgelse er understøttet af et projekt med titlen "kooperativ forskningsprogram for landbrug Science & Technology Development (projekt nr. PJ0011642) "finansieret af landdistrikternes udvikling Administration, Republikken Korea. Denne forskning blev også delvist støttet af en bevilling (NRF-2017R1A2B4012253) af den grundlæggende videnskab forskningsprogram gennem National Research Foundation (NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab, IKT & fremtid planlægning, Republikken Korea. Denne forskning blev også støttet af tilskud (N0000717) af programmet uddannelse for kreative og industrielle konvergens finansieret af Ministeriet for handel, industri og energi, Republikken Korea.

1. fabrikation af en PDMS mikrofluid Platform
<ol><li>Forberede 20 mL flydende PDMS prepolymer ved at blande base polymer og katalysator i en volumen-forholdet på 10:1. Hæld 10 mL væske PDMS på en rede SU-8 mug på en silicium wafer for den øvre del af mikrofluid netværk. Den nederste flade del, hæld flydende PDMS samme rumfang på silicium wafer uden en skimmel struktur. Bemærk: Mikrofluid netværk er designet i et CAD-program og derefter konverteres til et photomask for at fabrikere en master ved hjælp af...

<ol>
	<li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method.">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li><li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays.">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li><li>Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+RNA+polymerase-promoter+interaction+by+using+ssDNA-dsDNA+probe+on+a+surface+addressable+microarray.">Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray.</a> Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).</li><li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+(AIRP).">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li><li>Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Xenopus+laevis+mitochondrial+single-stranded+DNA-binding+protein+on+primer-template+binding+and+3'--&gt;5'+exonuclease+activity+of+DNA+polymerase+gamma.">Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'--&gt;5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).</li><li>Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-demand+one-step+synthesis+of+monodisperse+functional+polymeric+microspheres+with+droplet+microfluidics.">On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics.</a> Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).</li><li>Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-Integrated+Glass+Capillary+Device+for+Preparing+Small-Sized+Water-in-Oil-in-Water+Emulsion+Droplets.">Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets.</a> Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Flow+Synthesis+of+Co-Polymerizable+Oligo-Microspheres+and+Application+in+ssDNA+Amplification.">On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification.</a> PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).</li><li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+dispersions+using+&amp;#34;flow+focusing&amp;#34;+in+microchannels.">Formation of dispersions using &amp;#34;flow focusing&amp;#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li><li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+formation+via+squeezing+mechanism+in+a+microfluidic+flow-focusing+device.">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers &amp; Fluids. 100, 218-226 (2014).</li><li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices.">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li><li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+bonding+by+means+of+a+portable,+low-cost+corona+system.">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li><li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics.">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li><li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios.">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).</li><li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers.">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li></ol>

Kontaminanter i dsDNA er et stort problem i ssDNA forstærkning. Det er fortsat vanskeligt at minimere dsDNA forstærkning i konventionelle asymmetriske PCR forstærkning15. Desuden, selv om tekniske forbedringer for at generere ssDNA har gjort det muligt for os at øge effektiviteten af prøven overførselshastighed, er ssDNA isolation stadig problematisk på grund af sin høje omkostninger og ufuldstændige rensning udbytter.
Asymmetriske PCR er en af de mest udfordre...

Enkeltstrenget DNA (ssDNA) er blevet grundigt overvejet som en molekylær anerkendelse element (MRE) på grund af dets iboende egenskaber for DNA-DNA hybridisering1,2. Udviklingen af ssDNA syntetisk systemer kan føre til biologiske applikationer såsom DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnostik og integreret Molekylær sensing baseret på supplerende interaktioner4,5.
Til dato, har mikrometer skala polymer partikler med held påvist ved hjælp af mikrofluid enheder. Flere mikrofluid teknikker har vist sig for at være effektive til at producere meget homogen mikrokugler på kontinuerlig flow i microchannel miljø6,7.
I studiet af Lee et al. 8, en droplet-baserede mikrofluid platform for mikrofluid syntese af copolymerizable oligo-microsphere og ssDNA forstærkning blev rapporteret. Mikrofluid platform består af to PDMS (Polydimethylsiloxan) lag: en øvre del med en mikrofluid kanal netværk til at generere microsphere og en bunden flad del. Disse består af tre slags PDMS fluidic kanaler: 1) en flow med fokus kanal for slipværktøj generation, 2) en serpentine kanal til at blande to løsninger og 3) en sekventiel polymerisering kanal for microsphere størkning. Når to ikke-blandbare strømme er indført i en enkelt PDMS fluidic kanal, kan strømme tvinges gennem den smalle åbning struktur. Strømmen adfærd som kanal geometri, strømningshastighed og viskositet påvirke størrelse og morfologi af microsphere. Derfor, den største flydende strøm kan opdeles i mikroskala monospheres9,10.
Her er en detaljeret microsphere-PCR-protokol fastsatte forstærkning af ssDNA. Først, en droplet-baserede mikrofluid enhed designproces er beskrevet. Derefter, den måde, i hvilke polyacrylamid mikrokugler kan være functionalized med tilfældig DNA skabelon i en supplerende måde er forklaret. Endelig er en microsphere-PCR-protokol for uddybning af ssDNA vist.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>liquid polydimethylsiloxane, PDMS</td>
			<td>Dow Corning Inc.</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide:bis solution (19:1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Components of Copolymerizable oligo-microsphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate, APS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Hardener of acrylamide:bis solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine, TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Catalyst of ammonium persulfate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td>Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>synthesized</td>
			<td>Table 3. Sequence information&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA acrydite labeled probe</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>synthesized</td>
			<td>Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>&#160;T1016</td>
			<td>Components of TE buffer, pH buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex taq</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR001A</td>
			<td>ssDNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>eclipse 80i</td>
			<td>Caculating number of microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>ssDNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held Corona Treater</td>
			<td>Electro-Technic</td>
			<td>BD-20AC Laboratory Corona Treater</td>
			<td>Hydrophilic surface treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>As one</td>
			<td>HI-1000</td>
			<td>heating plate for curing of liquid PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>kd Scientific</td>
			<td>78-1100</td>
			<td>Uniform flow of Solution I and Solution II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressor</td>
			<td>Kohands</td>
			<td>KC-250A</td>
			<td>Flow control of Solution III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Caculating number of microspheres</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a droplet-based microfluidic approach and microsphere-pcr amplification for single-stranded dna amplicons

Droplet-baserede mikrofluidik aktiverer pålidelig produktion af homogene mikrokugler i den mikrofluid kanal, giver kontrolleret størrelse og morfologi af den opnåede microsphere. En copolymeriseret med et acrydite-DNA-sonder microsphere blev fabrikeret. Forskellige metoder som asymmetriske PCR, exonuclease fordøjelse og isolation på streptavidin-belagt magnetiske perler kan bruges til at syntetisere enkeltstrenget DNA (ssDNA). Disse metoder kan ikke effektivt bruger store mængder af højt oprenset ssDNA. Her, beskriver vi en microsphere-PCR-protokol beskriver hvordan ssDNA kan være effektivt forstærkes og adskilt fra dsDNA simpelthen af pipettering fra en PCR reaktion tube. Forstærkning af ssDNA kan anvendes som potentielle reagenser for DNA microarray og DNA-SELEX (systematisk udvikling af ligander af eksponentielle berigelse) processer.

Opdigtet polymere droplet-baserede mikrofluid platform består af to PDMS lag (figur 1a). Tre slags mikrofluid kanal netværk bruges til at generere mikrokugler: 1) strøm-fokusere geometri som vist i figur 1b, 2) en serpentine kanal for blandingsopløsning og løsning II og 3) polymerisering kanal for microsphere størkning. Højden af alle kanaler var 60 μm. Kanal længde til at blande og polymerisation var 74.35 og 94.45 mm, ...

Watch this Scientific Journal Video about A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons at JoVE.com

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Dette værk indeholder en metode til fremstilling af droplet-baserede mikrofluid platforme og anvendelsen af polyacrylamid mikrokugler for microsphere-PCR-amplifikation. Microsphere-PCR-metoden gør det muligt at opnå enkeltstrenget DNA amplikoner uden adskillelse dobbelt-strenget DNA.

En dråbe mikrofluid tilgang og Microsphere-PCR-amplifikation til enkeltstrenget DNA amplikoner

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i kombinatorial teknik af mikrofluidic system og molekylær bioteknologi felt, såsom mikrofluidic enheder og asymmetri PCR metode. De største fordele ved denne teknik er effektiv generering af stærkt homogeniserede mikrosfærer og produktion af enkeltstrenget DNA uden yderligere adskillelsestrin. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod diagnosticering eller behandling af forskellige sygdomme.Fordi generering af enkelt-streng DNA er nøglen til ap-ta-mo-sis assays, det kan bruges til påvisning og behandling. Selv om denne metode kan give indsigt i tre-dimensionelle mikrofluidic system i MEMS, det kan også anvendes til andre systemer, der anvendes til påvisning og behandling af sygdom. Generelt, personer nye til denne metode vil kæmpe for at ordentligt kontrollere væsker fra flyder i den modsatte retning.Visuel demonstration af denne metode er afgørende for at observere microsphere dannelse i flow-fokusering geometri og størkning af genererede mikrosfærer. Først forberede 20 milliliter flydende PDMS pre-polymer ved at blande base polymer og katalysator i en 10-til-en forhold. Hæld 10 milliliter af den flydende PDMS på en forberedt SU-8 skimmel på en silicium wafer til den øverste del af mikrofluidic netværk.For den nederste flade del, hæld den samme mængde flydende PDMS på silicium wafer uden en støbeform struktur. Placer to silicium vafler belagt med flydende PDMS for polymer på en forvarmet kogeplade og helbrede ved 75 grader Celsius i 30 minutter. Efter dette, manuelt skalle den hærdede PDMS lag fra SU-8 skimmel.Juster et 1,5 millimeter diameterrundehulsfæsningsværktøj til olieporten på det replikerede mikrofluidiske netværk til sammenkobling af mikronskalaflowkanaler med makrovæskeprøverne. Derefter manuelt punch ud gennem-hullet. Efter at have gentaget stansningsprocessen tre gange, udføre hydrofile overfladebehandling på både øvre og nederste PDMS lag ved hjælp af en håndholdt corona treater i flere sekunder pr prøve.Stak to plasmabehandlede PDMS-lag og varme ved 90 grader Celsius i 30 minutter på en kogeplade til PDMS-til-PDMS-bindingsprocessen. Vortex og kortvarigt centrifuge en standard enkeltstrenget DNA-acrydit-mærket sonde og en 19-til-en acrylamid bis bestand løsning. Forbered opløsning en ved at blande 25 mikroliter af 40% acrylamid bis opløsning, 10 mikroliter af enkeltstrenget DNA, 10 mikroliter af 5X TBE buffer, og fem mikroliter vand.Forbered opløsning to med 50 mikroliter på 20% ammoniumpersulfat. Forbered to sprøjter, der er individuelt fyldt med opløsning et og løsning to, og monter dem på sprøjtepumpen for at indføre opløsningsstrømme i mikrofluidisk platform. Forbered mineralsk olie blandet med 0,4% TEMED til overfladestørkning af mikrosfæren.Efter påfyldning af en glasflaske med mineralsk olie, indsætte to rør til pneumatiske og flydende porte i hætten af glasflasken som en microfluidic reservoir. Forbind rør mellem glasflasken og olieporten i mikrofluidic-enheden. Tilslut rørene til de to opløsningsporte i mikrofluidic-enheden for at levere de to opløsninger fra sprøjtepumperne.Sæt derefter rørene i udløbsporten for at overføre den genererede mikrosfære ind i bægeret. Dernæst indstilles strømningshastigheden af sprøjtepumpen til 0,4 til 0,7 milliliter i timen. Juster kompressorens tryklufttryk ved hjælp af en regulator.Anlå et glasbæger med magnetisk rørebjælke på en kogeplade, og indstil rotationshastigheden. Betjen sprøjtepumpen, og tilfør trykluften, der genereres af en ekstern kompressor, ind i glasflasken ved hjælp af on-off-styringen af en elektromagnetisk ventil. Ved hjælp af et digitalt mikroskop skal du observere dannelsen af mikrosfærer i den flowfokuserende geometri og størkning af genererede mikrosfærer i glasbægeret.Observation af dannelsen af mikrosfærer er en af de mest kritiske skridt, fordi det er en stor proces i denne undersøgelse til at producere mikrosfærer og mikrofluidic system. Derefter overføres 100 mikroliter af mikrosfærerne til et mikrocentrifugerør på 1,5 milliliter. Fjern derefter supernatanten ved hjælp af skånsom centrifugering og pipettering.Opslæm den gratis sonde-modificerede cyanine-3 ved hjælp af 100 mikroliter af 1X TE buffer for at opnå en endelig koncentration på 100 mikromolar. Dernæst tilsættes 100 mikromolar af komplementær sonde-modificeret cyanine-3 til en steril 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør, der indeholder AP copolymerized mikrosfærer. Bank på røret et par gange for at blande og inkubere ved stuetemperatur i mørke i en time.Efter inkubation kasseres supernatanten, og restbufferen fjernes gennem pipettering. Skyl derefter tre gange med 500 mikroliter TE-buffer. Placer mikrosfærer på en 75-by-50 millimeter glas dias og dække med aluminiumsfolie før billeddannelse.Der opnås ca. 25 mikrosfærer gennem mikroskopisk optælling ved hjælp af et lysmikroskop med 40X forstørrelse. Derefter skal du kombinere alle reagenser som beskrevet i tekstprotokollen. Prøverne sættes i en termocykator, og den asymmetriske PCR startes under de rette forhold.Indsamlingen af en supernatant efter asymmetrisk PCR er et af de mest kritiske skridt, fordi det er en stor proces til generering af enkelt-streng DNA med mikrosfære. Efter forstærkning skal du tilføje otte mikroliter 6X-belastningsbuffer til hver prøve. Der indlæses 15 mikroliter af hver prøve i 2% agarosegel.Derefter udføre elektroforese ved 100 volt i 35 minutter i 1X TAE buffer. De hybridiserede mikrosfærer sættes i en holder, og holderen fastgøres til et konfokal mikroskop. Vælg laseren, og tænd den i laserstyringen.Vælg mållinsen i mikroskopkontrolelementet. Vælg derefter det ønskede filter for cyanine-3 og kanal i konfigurationskontrolelementet. Til sidst skal du starte forsøget og observere prøven.Den fabrikerede polymere dråbebaserede mikrofluidiske platform består af to PDMS-lag. Tre former for microfluidic kanal netværk bruges til at generere mikrosfærer, som er flow-fokusering geometri, en serpentin kanal til blanding løsninger en og to, og en polymerisering kanal for mikrosfæren størkning. Et laboratoriebaseret pneumatisk kontrolsystem til kontinuerlig strøm af mineralolien og to sprøjtepumper til løsningsflowet blev brugt til at generere mikrosfærer i mikrofluidisk platform.Hvis mikrosfærerne er korrekt funktionaliseret med den fem-prime akrydit DNA-sonde, bør de resultere i dækning af fluorescerende aktivitet på overfladen under hybridisering eksperiment som vist i disse fluorescerende billeder. Hvis copolymerization ikke forekommer korrekt, ville den optiske microsphere billede udviser intern forurening inde i mikrosfærer. Manipulation af 3D-overfladen af mikrosfærer med en DNA oligo-sonde er en meget hurtigere proces og en on-flow microsphere syntese platform kan give et værktøj til enkeltstrenget DNA forstærkning og rensning.Den oprindeligt copolymerized fem-prime AP giver en tre-prime hydroxyl ende for DNA polymerisering efter udglødning til sin supplerende skabelon. Dobbeltstrengede DNA-forurenende stoffer blev observeret i det asymmetriske PCR-eksperiment. Den resulterende enkeltstrengede DNA akkumuleret fra microsphere PCR blev påvist i forhold til den syntetiske størrelse markører gennem gel elektroforese analyse.Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske, at forudgående kendskab til protokoller og justeringer, der er almindeligt nødvendige for at optimere PCR eksperimenter er nødvendige for at opnå forstærkning cyklus, glødende temperatur, og sonde sekvens i denne metode. Efter sin udvikling banede denne teknik vejen for forskere inden for diagnose og terapi til at forbinde to regioner i molekylær bioteknologi og biomedicin. Glem ikke, at arbejde med acrylamid løsning kan være farligt og forholdsregler såsom iført handsker og lab frakker bør altid tages, mens du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Mikrofluidenheder Blandere til at studere proteinfoldning

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

En mikrofluid enhed for at studere flere forskellige stammer

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Hud tatovering som en ny tilgang til DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Mikrofluidisk fremstilling af polymere og biohybridfibre med foruddefineret størrelse og form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

En Mikrofluid baseret Elektrokemisk Bioflis efter etiket-fri DNA-hybridisering Analyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

En Mikrofluid Chip for ICPMS Sample Introduktion

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En Mikrofluid platform for High-throughput Single-celle Isolering og Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-trins Variabel Højde Fotolitografi for med ventiler Multilayer mikrofluidenheder

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikrofluid Platform med Multiplexed Elektronisk Detection for fysisk sporing af partikler

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...