Name: a droplet-based microfluidic approach and microsphere-pcr amplification for single-stranded dna amplicons
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons at JoVE.com

Deze studie wordt ondersteund door een project getiteld "coöperatieve onderzoeksprogramma voor landbouw Science & Technology Development (Project nr. PJ0011642) "gefinancierd door de landelijke ontwikkeling administratie, Republiek Korea. Dit onderzoek werd ook deels gesteund door een subsidie (NRF-2017R1A2B4012253) van de fundamentele wetenschap Research Program door de National Research Foundation (NRF) gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT & toekomst Planning, Republiek Korea. Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie (N0000717) van het onderwijs-programma voor creatieve en industriële convergentie gefinancierd door het ministerie van handel, industrie en energie, Zuid-Korea.

1. fabricage van een PDMS Microfluidic Platform
<ol><li>Bereid 20 mL vloeibare PDMS prepolymeren door het mengen van de basis polymeer en katalysator in een volumeverhouding van 10:1. Giet 10 mL van de vloeistof PDMS op een schimmel SU-8 bereid op een silicium wafer voor het bovenste deel van het microfluidic netwerk. Voor het onderste gedeelte plat, giet u dezelfde hoeveelheid vloeibare PDMS op het silicium wafer zonder de structuur van een schimmel. Opmerking: Het microfluidic-netwerk is ontworpen in een CAD-progr...

<ol>
	<li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method.">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li><li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays.">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li><li>Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+RNA+polymerase-promoter+interaction+by+using+ssDNA-dsDNA+probe+on+a+surface+addressable+microarray.">Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray.</a> Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).</li><li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+(AIRP).">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li><li>Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Xenopus+laevis+mitochondrial+single-stranded+DNA-binding+protein+on+primer-template+binding+and+3'--&gt;5'+exonuclease+activity+of+DNA+polymerase+gamma.">Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'--&gt;5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).</li><li>Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-demand+one-step+synthesis+of+monodisperse+functional+polymeric+microspheres+with+droplet+microfluidics.">On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics.</a> Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).</li><li>Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-Integrated+Glass+Capillary+Device+for+Preparing+Small-Sized+Water-in-Oil-in-Water+Emulsion+Droplets.">Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets.</a> Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Flow+Synthesis+of+Co-Polymerizable+Oligo-Microspheres+and+Application+in+ssDNA+Amplification.">On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification.</a> PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).</li><li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+dispersions+using+&amp;#34;flow+focusing&amp;#34;+in+microchannels.">Formation of dispersions using &amp;#34;flow focusing&amp;#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li><li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+formation+via+squeezing+mechanism+in+a+microfluidic+flow-focusing+device.">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers &amp; Fluids. 100, 218-226 (2014).</li><li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices.">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li><li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+bonding+by+means+of+a+portable,+low-cost+corona+system.">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li><li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics.">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li><li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios.">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).</li><li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers.">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li></ol>

Verontreinigingen van dsDNA zijn een belangrijk thema in de versterking van de ssDNA. Blijft het moeilijk om te minimaliseren dsDNA versterking in conventionele asymmetrische PCR versterking15. Bovendien, hoewel technische verbeteringen voor het genereren van ssDNA we het verhogen van de efficiëntie van monsters worden verwerkt kunnen, is ssDNA isolatie nog steeds problematisch vanwege de hoge kosten en opbrengsten van de onvolledige zuivering.
Asymmetrische PCR is een...

Single-stranded DNA (ssDNA) heeft uitgebreid beschouwd als een element van de moleculaire erkenning (MRE) als gevolg van zijn intrinsieke eigenschappen voor DNA-DNA hybridisatie1,2. De ontwikkeling van ssDNA synthetische systemen kan leiden tot biologische toepassingen zoals DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnostiek en geïntegreerde moleculaire detectie op basis van aanvullende interacties4,5.
Tot op heden zijn micrometer-schaal polymeer deeltjes met succes aangetoond met behulp van microfluidic-apparaten. Verschillende technieken van de microfluidic hebben bewezen te krachtig voor het produceren van zeer homogene microsferen op continue stroom in de microchannel milieu6,7.
In de studie van Lee et al. 8, een druppel gebaseerde microfluidic platform voor de microfluidic synthese van copolymerizable oligo-microsfeer en ssDNA versterking werd gemeld. Het microfluidic platform bestaat uit twee lagen van het PDMS (Polydimethylsiloxaan): een bovenste deel met een microfluidic channel-netwerk voor het genereren van de microsfeer en een bodem plat deel. Deze bestaan uit drie soorten PDMS fluidic kanalen: 1) een stroom focussering kanaal voor druppel-generatie, 2) een serpentine kanaal voor het mengen van twee oplossingen, en 3) een sequentiële polymerisatie-kanaal voor microsfeer stollen. Zodra twee onmengbare stromen in een PDMS fluidic enkellijns worden binnengebracht, kunnen de stromen worden gedwongen door de smalle opening structuur. De stroom gedrag zoals kanaal geometrie, debiet en viscositeit van invloed op de grootte en morfologie van de microsfeer. Daarom is de belangrijkste vloeibare stroom kan worden onderverdeeld in microscale monospheres9,10.
Hier vindt u een gedetailleerde microsfeer-PCR protocol voor de amplificatie van ssDNA. Ten eerste wordt een druppel gebaseerde microfluidic apparaat ontwerpproces beschreven. Dan, de manier waarop in welke polyacrylamide microbolletjes met willekeurige DNA sjabloon kan worden matiemaatschappij op een complementaire manier wordt uitgelegd. Tot slot wordt een microsfeer-PCR protocol voor het versterken van de ssDNA weergegeven.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>liquid polydimethylsiloxane, PDMS</td>
			<td>Dow Corning Inc.</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide:bis solution (19:1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Components of Copolymerizable oligo-microsphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate, APS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Hardener of acrylamide:bis solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine, TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Catalyst of ammonium persulfate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td>Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>synthesized</td>
			<td>Table 3. Sequence information&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA acrydite labeled probe</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>synthesized</td>
			<td>Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>&#160;T1016</td>
			<td>Components of TE buffer, pH buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex taq</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR001A</td>
			<td>ssDNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>eclipse 80i</td>
			<td>Caculating number of microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>ssDNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held Corona Treater</td>
			<td>Electro-Technic</td>
			<td>BD-20AC Laboratory Corona Treater</td>
			<td>Hydrophilic surface treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>As one</td>
			<td>HI-1000</td>
			<td>heating plate for curing of liquid PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>kd Scientific</td>
			<td>78-1100</td>
			<td>Uniform flow of Solution I and Solution II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressor</td>
			<td>Kohands</td>
			<td>KC-250A</td>
			<td>Flow control of Solution III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Caculating number of microspheres</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a droplet-based microfluidic approach and microsphere-pcr amplification for single-stranded dna amplicons

Druppel gebaseerde microfluidics inschakelen de betrouwbare productie van homogene microbolletjes in het kanaal van de microfluidic, die gecontroleerde grootte en morfologie van de verkregen microsfeer. Een copolymerized met een acrydite-DNA-sonde microsfeer werd met succes vervaardigd. Verschillende methoden zoals asymmetrische PCR exonuclease spijsvertering en isolatie op daar beklede magnetische kralen kunnen worden gebruikt voor het synthetiseren van single-stranded DNA (ssDNA). Echter, deze methoden niet efficiënt gebruiken grote hoeveelheden van hoogst gezuiverde ssDNA. Hier beschrijven we een microsfeer-PCR protocol detailleren hoe ssDNA kunnen worden efficiënt versterkt en gescheiden van dsDNA gewoon door pipetteren van een PCR reactiebuis. De amplificatie van ssDNA kan worden toegepast als potentiële reagentia voor de microarray DNA en DNA-SELEX (systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking) processen.

Het verzonnen polymere druppel gebaseerde microfluidic platform bestaat uit twee lagen van het PDMS (Figuur 1a). Drie soorten microfluidic kanaal netwerken worden gebruikt voor het genereren van microsferen: 1) Flow-focusing geometrie zoals weergegeven in Figuur 1b, 2) een serpentine kanaal voor het mengen van oplossing ik en oplossing II en 3) een polymerisatie-kanaal voor microsfeer stollen. De hoogte van alle kanalen was 60 μ...

Watch this Scientific Journal Video about A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons at JoVE.com

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Dit werk biedt een methode voor de fabricage van microfluidic druppel gebaseerde platforms en de toepassing van polyacrylamide microsferen voor microsfeer-PCR versterking. De microsfeer-PCR-methode maakt het mogelijk om te verkrijgen van single-stranded DNA waarbij zonder te scheiden van de double-stranded DNA.

Een Droplet gebaseerde benadering van het Microfluidic en de microsfeer-PCR versterking voor Single-Stranded DNA waarbij

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de combinatorische techniek van het microfluïde systeem en het moleculaire biotechnologieveld, zoals microfluïde apparaten en asymmetrie-PCR-methode. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn het efficiënt genereren van sterk gehomogeniseerde microsferen en de productie van enkelstrengs DNA zonder extra scheidingsstappen. De implicaties van deze techniek breiden zich uit naar de diagnose of therapie van verschillende ziekten.Omdat het genereren van single-streng DNA de sleutel is voor ap-ta-mo-sis tests, kan het worden gebruikt voor detectie en behandeling. Hoewel deze methode inzicht kan geven in driedimensionaal microfluïdisch systeem in MEMS, kan het ook worden toegepast op andere systemen die worden gebruikt voor detectie en behandeling van ziekten. Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal moeite hebben om goed te controleren vloeistoffen uit stroomt in de omgekeerde richting.Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang om de microsfeervorming in de flow-focus geometrie en stolling van gegenereerde microsferen te observeren. Bereid eerst 20 milliliter vloeibaar PDMS-voorpomeer voor door basispolymeer en katalysator te mengen in een verhouding van 10 op één. Giet 10 milliliter van de vloeibare PDMS op een voorbereide SU-8 mal op een siliciumwafer voor het bovenste deel van het microfluïde netwerk.Voor het onderste vlakke deel, giet hetzelfde volume van vloeibare PDMS op het silicium wafer zonder een schimmelstructuur. Plaats twee siliciumwafers bedekt met vloeibare PDMS voorpomeer op een voorverwarmde kookplaat en genezen op 75 graden Celsius gedurende 30 minuten. Na deze, handmatig afpellen van de genezen PDMS laag van de SU-8 mal.Lijn een rond gatpons met een diameter van 1,5 millimeter uit op de oliepoort van het gerepliceerde microfluïde netwerk voor het interfacing van micron-schaal stroomkanalen met de macrovloeistoffenmonsters. Dan handmatig punch uit de door-gat. Na het herhalen van het ponsproces drie keer, uitvoeren hydrofiele oppervlakte behandeling op zowel de bovenste en onderste PDMS lagen met behulp van een handheld corona treater voor enkele seconden per monster.Stapel twee met plasma behandelde PDMS-lagen en verwarm gedurende 30 minuten op een kookplaat op een kookplaat voor het PDMS-naar-PDMS-bindingsproces. Vortex en kort centrifugeren een standaard single-stranded DNA acrydite-label sonde en een 19-op-een acrylamide bis voorraad oplossing. Bereid oplossing een door het mengen van 25 microliters van 40% acrylamide bis oplossing, 10 microliter van enkelstrengs DNA, 10 microliter van 5X TBE buffer, en vijf microliter water.Bereid oplossing twee met 50 microliter van 20% ammonium persulfaat. Bereid twee spuiten individueel gevuld met oplossing een en oplossing twee en monteer ze op de spuitpomp om oplossingsstromen in het microfluïde platform te introduceren. Bereid minerale olie gemengd met 0,4%TEMED voor oppervlaktevastheid van de microsfeer.Na het vullen van een glazen fles met de minerale olie, steek twee buizen aan de pneumatische en vloeibare poorten in de dop van de glazen fles als een microfluïde reservoir. Sluit buizen aan tussen de glazen fles en de oliepoort in het microfluidic apparaat. Sluit de buizen aan op de twee oplossingspoorten in het microfluïde apparaat om de twee oplossingen van de spuitpompen te leveren.Steek vervolgens de buizen in de uitlaatpoort om de gegenereerde microsfeer in het bekerglas over te brengen. Stel vervolgens de stroomsnelheid van de spuitpomp in op 0,4 tot 0,7 milliliter per uur. Pas de persluchtdruk van de compressor aan met behulp van een regelaar.Plaats een glazen beker met magnetische roerstaaf op een kookplaat en stel de rotatiesnelheid in. Bedien de spuitpomp en lever de perslucht die door een externe compressor wordt gegenereerd in de glazen fles met behulp van de aan-uit-controle van een elektromagnetische klep. Met behulp van een digitale microscoop, observeren de vorming van microsferen in de stroom-focus geometrie en stolling van gegenereerde microsferen in het glas bekerglas.Het observeren van de vorming van microsferen is een van de meest kritieke stappen, omdat het een belangrijk proces in deze studie om microsferen en microfluïde systeem te produceren. Breng hierna 100 microliter van de microsferen over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Verwijder vervolgens de supernatant door middel van zachte centrifuging en pipetting.Resuspend de gratis sonde-gemodificeerde cyanine-3 met behulp van 100 microliters van 1X TE buffer om een uiteindelijke concentratie van 100 micromolar te bereiken. Voeg vervolgens 100 micromolar van complementaire sonde-gemodificeerde cyanine-3 toe aan een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis met AP gecopolymeriseerde microsferen. Tik een paar keer op de buis om een uur lang te mengen en uit te broeden bij kamertemperatuur in het donker.Na incubatie, gooi de supernatant en verwijder de resterende buffer door pipetting. Spoel vervolgens drie keer met 500 microliters TE-buffer. Plaats de microsferen op een glazen schuif van 75 bij 50 millimeter en bedek met aluminiumfolie voorafgaand aan de beeldvorming.Verkrijg ongeveer 25 microsferen door microscopisch tellen met behulp van een lichtmicroscoop met 40x vergroting. Combineer hierna alle reagentia zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de monsters in een thermocycler en start de asymmetrische PCR onder de juiste omstandigheden.De verzameling van een supernatant na asymmetrische PCR is een van de meest kritieke stap, omdat het een belangrijk proces is voor het genereren van single-streng DNA met microsfeer. Voeg na versterking acht microliters van 6X-laadbuffer toe aan elk monster. Laad 15 microliter van elk monster in 2%agarose gel.Voer vervolgens elektroforese uit op 100 volt gedurende 35 minuten in 1X TAE buffer. Plaats de gehybride microsferen in een houder en bevestig de houder aan het stadium van een confocale microscoop. Selecteer de laser en zet deze in de laserbesturing in.Selecteer de objectieve lens in de microscoopbediening. Selecteer vervolgens het gewenste filter voor cyanine-3 en kanaal in het configuratiebesturingselement. Begin ten slotte met het experiment en observeer het monster.Het gefabriceerde polymeerdruppelgebaseerde microfluïde platform bestaat uit twee PDMS-lagen. Drie soorten microfluïde kanaalnetwerken worden gebruikt voor het genereren van microsferen, die flow-focus geometrie, een serpentine kanaal voor het mengen van oplossingen een en twee, en een polymerisatie kanaal voor microsfeer stolling. Een lab-gebaseerde pneumatische controlesysteem voor continue stroom van de minerale olie en twee spuit pompen voor de oplossing stroom werden gebruikt voor het genereren van microsferen in de microfluïde platform.Als de microsferen correct zijn gefunctionaliseerd met de vijf-prime acrydite DNA-sonde, moeten ze resulteren in dekking van fluorescerende activiteit op het oppervlak tijdens de hybridisatie experiment zoals getoond in deze fluorescerende beelden. Als copolymerisatie niet correct optreedt, zou het optische microsfeerbeeld interne verontreiniging in de microsferen vertonen. Het manipuleren van het 3D-oppervlak van microsferen met een DNA-oligo-sonde is een veel sneller proces en een on-flow microsfeersyntheseplatform kan een hulpmiddel bieden voor enkelstrengse DNA-versterking en -zuivering.De aanvankelijk gecopolymeriseerde vijf-priemgetal AP biedt een drie-prime hydroxyl einde voor DNA polymerisatie na annealing aan de complementaire sjabloon. Dubbelstrengs DNA-verontreinigingen werden waargenomen in het asymmetrische PCR-experiment. Het resulterende enkelstrengse DNA dat zich ophoopt uit microsfeer-PCR werd aangetoond in vergelijking met de synthetische groottemarkers door middel van gelelektroforeseanalyse.Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat voorkennis van protocollen en aanpassingen die vaak nodig zijn voor het optimaliseren van PCR-experimenten nodig zijn voor het verkrijgen van de versterkingscyclus, annealing temperatuur, en sonde sequentie in deze methode. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van diagnose en therapie om twee regio's in moleculaire biotechnologie en biogeneeskunde met elkaar te verbinden. Vergeet niet dat het werken met acrylamide oplossing kan gevaarlijk zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen en lab jassen moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

Een Microfluïdische-gebaseerde Hydrodynamische Trap voor Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Microfluïdische Mixers voor het bestuderen van eiwitten vouwen

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

Een microfluïdische apparaat voor het bestuderen van meerdere, afzonderlijke stammen

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Huid tatoeëren als een nieuwe benadering voor DNA-vaccin Levering

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Microfluïdische fabricage van polymere en biohybridevezels met vooraf ontworpen grootte en vorm

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

A-Microfluidic gebaseerd Elektrochemische Biochip voor-Label vrij DNA hybridisatie-analyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

Een Microfluïdische Chip voor ICPMS Sample Inleiding

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-stap Variabele Hoogte fotolithografie voor Valved Multilayer microfluïdische apparaten

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluïdische Platform met multiplexverzending elektronische detectie voor ruimtelijke Tracking van Deeltjes

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...