Name: a droplet-based microfluidic approach and microsphere-pcr amplification for single-stranded dna amplicons
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons at JoVE.com

इस अध्ययन के हकदार एक परियोजना द्वारा समर्थित है "कृषि विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास के लिए सहकारी अनुसंधान कार्यक्रम (परियोजना सं. PJ0011642) "ग्रामीण विकास प्रशासन, कोरिया गणराज्य द्वारा वित्त पोषित । यह शोध भी आंशिक रूप से एक अनुदान (एनआरएफ-2017R1A2B4012253) बुनियादी विज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम के माध्यम से राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) विज्ञान, आईसीटी और भविष्य की योजना बना, कोरिया गणराज्य के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित द्वारा समर्थित किया गया था । यह शोध भी व्यापार, उद्योग और ऊर्जा, कोरिया गणराज्य के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित रचनात्मक और औद्योगिक अभिसरण के लिए शिक्षा कार्यक्रम के एक अनुदान (N0000717) द्वारा समर्थित किया गया था ।

1. एक PDMS Microfluidic मंच का निर्माण
<ol><li>10:1 की मात्रा अनुपात में आधार बहुलक और उत्प्रेरक मिश्रण द्वारा तरल PDMS के 20 मिलीलीटर तैयार करें । microfluidic नेटवर्क के ऊपरी भाग के लिए एक सिलिकॉन वेफर पर एक तैयार एसयू-8 मोल्ड पर तरल PD...

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	<li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method.">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li><li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays.">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li><li>Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+RNA+polymerase-promoter+interaction+by+using+ssDNA-dsDNA+probe+on+a+surface+addressable+microarray.">Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray.</a> Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).</li><li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+(AIRP).">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li><li>Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Xenopus+laevis+mitochondrial+single-stranded+DNA-binding+protein+on+primer-template+binding+and+3'--&gt;5'+exonuclease+activity+of+DNA+polymerase+gamma.">Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'--&gt;5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).</li><li>Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-demand+one-step+synthesis+of+monodisperse+functional+polymeric+microspheres+with+droplet+microfluidics.">On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics.</a> Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).</li><li>Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-Integrated+Glass+Capillary+Device+for+Preparing+Small-Sized+Water-in-Oil-in-Water+Emulsion+Droplets.">Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets.</a> Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Flow+Synthesis+of+Co-Polymerizable+Oligo-Microspheres+and+Application+in+ssDNA+Amplification.">On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification.</a> PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).</li><li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+dispersions+using+&amp;#34;flow+focusing&amp;#34;+in+microchannels.">Formation of dispersions using &amp;#34;flow focusing&amp;#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li><li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+formation+via+squeezing+mechanism+in+a+microfluidic+flow-focusing+device.">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers &amp; Fluids. 100, 218-226 (2014).</li><li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices.">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li><li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+bonding+by+means+of+a+portable,+low-cost+corona+system.">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li><li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics.">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li><li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios.">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).</li><li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers.">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li></ol>

dsDNA का संदूषण ssDNA प्रवर्धन में एक प्रमुख मुद्दा है. यह पारंपरिक असममित पीसीआर प्रवर्धन15में dsDNA वर्धन को कम करने के लिए मुश्किल रहता है । इसके अलावा, हालांकि ssDNA पैदा करने के लिए तकनीकी सुधार हमें नमू...

एकल-कतरा डीएनए (ssDNA) को बड़े पैमाने पर एक आणविक मान्यता तत्व के रूप में माना गया है (MRE) डीएनए के लिए अपनी आंतरिक संपत्तियों के कारण-डीएनए संकरण1,2. ssDNA सिंथेटिक प्रणालियों के विकास जैसे डीएनए microarrays3, oligotherapeutics, निदान के रूप में जैविक अनुप्रयोगों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और एकीकृत आणविक संवेदन पूरक बातचीत के आधार पर4,5.
तिथि करने के लिए, माइक्रोमीटर पैमाने बहुलक कणों सफलतापूर्वक microfluidic उपकरणों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है । कई microfluidic तकनीक microchannel पर्यावरण6,7में निरंतर प्रवाह पर अत्यधिक समरूप microspheres उत्पादन के लिए शक्तिशाली साबित किया गया है ।
के अध्ययन में ली एट अल. 8, copolymerizable oligo के microfluidic संश्लेषण के लिए एक छोटी बूंद-आधारित microfluidic मंच-microsphere और ssDNA वर्धन की सूचना दी गई । microfluidic मंच दो PDMS (polydimethylsiloxane) परतों के होते हैं: microsphere और एक नीचे फ्लैट हिस्सा पैदा करने के लिए एक microfluidic चैनल नेटवर्क के साथ एक ऊपरी हिस्सा । ये PDMS द्रवित चैनलों के तीन प्रकार से मिलकर बनता है: 1) एक छोटी बूंद पीढ़ी के लिए चैनल ध्यान केंद्रित प्रवाह, 2) दो समाधान मिश्रण के लिए एक र्ें चैनल, और 3) microsphere solidification के लिए एक अनुक्रमिक बहुलकीकरण चैनल । एक बार दो immiscible प्रवाह एक एकल PDMS द्रवित चैनल में पेश कर रहे हैं, प्रवाह संकीर्ण छिद्र संरचना के माध्यम से मजबूर किया जा सकता है । इस तरह के चैनल ज्यामिति के रूप में प्रवाह व्यवहार, प्रवाह दर, और चिपचिपापन microsphere के आकार और आकृति विज्ञान को प्रभावित । इसलिए, मुख्य लिक्विड स्ट्रीम अतिसूक्ष्म monospheres9,10में विभाजित किया जा सकता है ।
यहां, ssDNA के प्रवर्धन के लिए एक विस्तृत microsphere-पीसीआर प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है । सबसे पहले, एक छोटी बूंद-आधारित microfluidic डिवाइस डिजाइन प्रक्रिया वर्णित है । फिर, जिस तरह से polyacrylamide microspheres यादृच्छिक डीएनए टेंपलेट के साथ एक पूरक तरीके में कार्यात्मक किया जा सकता है समझाया है । अंत में, ssDNA बढ़ाना के लिए एक microsphere-पीसीआर प्रोटोकॉल दिखाया गया है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>liquid polydimethylsiloxane, PDMS</td>
			<td>Dow Corning Inc.</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide:bis solution (19:1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Components of Copolymerizable oligo-microsphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate, APS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Hardener of acrylamide:bis solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine, TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Catalyst of ammonium persulfate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td>Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>synthesized</td>
			<td>Table 3. Sequence information&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA acrydite labeled probe</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>synthesized</td>
			<td>Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>&#160;T1016</td>
			<td>Components of TE buffer, pH buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex taq</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR001A</td>
			<td>ssDNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>eclipse 80i</td>
			<td>Caculating number of microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>ssDNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held Corona Treater</td>
			<td>Electro-Technic</td>
			<td>BD-20AC Laboratory Corona Treater</td>
			<td>Hydrophilic surface treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>As one</td>
			<td>HI-1000</td>
			<td>heating plate for curing of liquid PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>kd Scientific</td>
			<td>78-1100</td>
			<td>Uniform flow of Solution I and Solution II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressor</td>
			<td>Kohands</td>
			<td>KC-250A</td>
			<td>Flow control of Solution III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Caculating number of microspheres</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a droplet-based microfluidic approach and microsphere-pcr amplification for single-stranded dna amplicons

छोटी बूंद-आधारित microfluidics microfluidic चैनल में सजातीय microspheres के विश्वसनीय उत्पादन सक्षम, नियंत्रित आकार और प्राप्त microsphere की आकृति विज्ञान प्रदान करते हैं । एक acrydite-डीएनए जांच के साथ एक microsphere copolymerized सफलतापूर्वक गढ़े । ऐसे असममित पीसीआर, exonuclease पाचन, और streptavidin पर अलगाव-लेपित चुंबकीय मोतियों के रूप में विभिंन तरीकों को एकल-असहाय डीएनए संश्लेषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (ssDNA) । हालांकि, इन विधियों कुशलतापूर्वक अत्यधिक शुद्ध ssDNA की बड़ी मात्रा का उपयोग नहीं कर सकते । यहां, हम एक microsphere-पीसीआर विवरण कैसे ssDNA कुशलता से परिलक्षित किया जा सकता है और एक पीसीआर रिएक्शन ट्यूब से pipetting द्वारा बस dsDNA से अलग प्रोटोकॉल का वर्णन । ssDNA के प्रवर्धन डीएनए microarray और डीएनए के लिए संभावित रिएजेंट के रूप में लागू किया जा सकता है-SELEX (घातीय संवर्धन द्वारा लाइगैंडों के व्यवस्थित विकास) प्रक्रियाओं ।

गढ़े पॉलिमर छोटी बूंद आधारित microfluidic मंच दो PDMS परतों (आंकड़ा 1a) के होते हैं । microfluidic चैनल नेटवर्क के तीन प्रकार के microspheres पैदा करने के लिए उपयोग किया जाता है: 1) फ्लो-फोकस ज्यामिति के रूप में...

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A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

यह काम छोटी बूंद के निर्माण के लिए एक विधि-आधारित microfluidic प्लेटफार्मों और microsphere-पीसीआर प्रवर्धन के लिए polyacrylamide microspheres के आवेदन प्रदान करता है । microsphere-पीसीआर विधि दोहरे-असहाय डीएनए को अलग किए बिना एकल-असहाय डीएनए amplicons प्राप्त करने के लिए संभव बनाता है ।

एक छोटी बूंद आधारित Microfluidic दृष्टिकोण और Microsphere-एकल असहाय डीएनए के लिए पीसीआर प्रवर्धन Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Research

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