Name: a droplet-based microfluidic approach and microsphere-pcr amplification for single-stranded dna amplicons
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00
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Questo studio è supportato da un progetto intitolato "programma di ricerca cooperativa per agricoltura Science & Technology Development (progetto n ° PJ0011642) "finanziato dal governo di sviluppo rurale, Repubblica di Corea. Questa ricerca è stata sostenuta in parte anche da una sovvenzione (NRF-2017R1A2B4012253) del programma di ricerca scienza base attraverso la Fondazione di ricerca nazionale (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT & futuro pianificazione, Repubblica di Corea. Questa ricerca è stata anche sostenuta da una sovvenzione (N0000717) del programma di educazione per creativi e convergenza industriale finanziato dal Ministero del commercio, industria ed energia, Repubblica di Corea.

1. realizzazione di una piattaforma di Microfluidic PDMS
<ol><li>Preparare 20 mL di liquido prepolimero PDMS con polimero di base e catalizzatore in un rapporto di volume di 10:1. Versare 10 mL del liquido PDMS su uno stampo SU-8 preparato su un wafer di silicio per la parte superiore della rete microfluidica. Per la parte inferiore piatta, versare lo stesso volume di liquido PDMS sul wafer di silicio senza una struttura di stampo. Nota: La rete di microfluidica è progettata in un programma CAD e poi convertita in ...

<ol>
	<li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method.">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li><li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays.">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li><li>Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+RNA+polymerase-promoter+interaction+by+using+ssDNA-dsDNA+probe+on+a+surface+addressable+microarray.">Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray.</a> Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).</li><li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+(AIRP).">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li><li>Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Flow+Synthesis+of+Co-Polymerizable+Oligo-Microspheres+and+Application+in+ssDNA+Amplification.">On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification.</a> PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).</li><li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+dispersions+using+&amp;#34;flow+focusing&amp;#34;+in+microchannels.">Formation of dispersions using &amp;#34;flow focusing&amp;#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li><li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+formation+via+squeezing+mechanism+in+a+microfluidic+flow-focusing+device.">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers &amp; Fluids. 100, 218-226 (2014).</li><li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices.">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li><li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+bonding+by+means+of+a+portable,+low-cost+corona+system.">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li><li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics.">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li><li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios.">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).</li><li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers.">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li></ol>

Contaminanti di dsDNA sono un problema importante in ssDNA amplificazione. Rimane difficile minimizzare dsDNA amplificazione in convenzionale di amplificazione in PCR asimmetrica15. Inoltre, anche se miglioramenti tecnici per la generazione di ssDNA hanno permesso di aumentare l'efficienza di rendimento del campione, ssDNA isolamento è ancora problematico a causa di suoi alti costi e rendimenti di depurazione incompleta.
PCR asimmetrica è uno dei più impegnativi meto...

DNA a singola elica (ssDNA) è stato ampiamente considerato come un elemento di riconoscimento molecolare (MRE) grazie alle sue proprietà intrinseche per l'ibridazione DNA-DNA1,2. Lo sviluppo di sistemi sintetici ssDNA può portare ad applicazioni biologiche quali DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnostica e molecolare di rilevamento integrato basato su interazioni complementari4,5.
Fin qui, le particelle di polimero di scala micrometrica sono state dimostrate con successo utilizzando dispositivi microfluidici. Diverse tecniche di microfluidica hanno dimostrati di essere potente per la produzione di microsfere altamente omogenee il flusso continuo in ambiente microchannel6,7.
Nello studio di Lee et al. 8, una piattaforma di microfluidica gocciolina-basato per la sintesi di microfluidica di amplificazione oligo-microsfere e ssDNA qui è stato segnalato. La piattaforma microfluidica è costituito da due strati PDMS (polidimetilsilossano): una parte superiore con una rete di canali microfluidici per la generazione di microsfere e un fondo piatto a parte. Questi consistono di tre tipi di canali fluidici PDMS: 1) un flusso di canale per la generazione di goccia, 2) un canale serpeggiante per la miscelazione di due soluzioni e 3) un canale di polimerizzazione sequenziale per solidificazione di microsfere di messa a fuoco. Una volta due flussi immiscibili vengono introdotti in un singolo canale fluidico PDMS, i flussi possono essere forzati attraverso la struttura di orifizio stretto. I comportamenti di flusso come geometria del canale, portata e viscosità influiscono sulla dimensione e la morfologia delle microsfere. Pertanto, il principale flusso di liquido può essere diviso in Microscala monospheres9,10.
Qui, viene fornito un protocollo dettagliato microsfera-PCR per l'amplificazione di ssDNA. In primo luogo, un processo di progettazione di dispositivi microfluidici basati su goccia è descritto. Quindi, è spiegato il modo in cui poliacrilammide microsfere possono essere funzionalizzate con modello casuale di DNA in maniera complementare. Infine, un protocollo di microsfere-PCR per amplificare ssDNA è mostrato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>liquid polydimethylsiloxane, PDMS</td>
			<td>Dow Corning Inc.</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide:bis solution (19:1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Components of Copolymerizable oligo-microsphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate, APS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Hardener of acrylamide:bis solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine, TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Catalyst of ammonium persulfate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td>Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>synthesized</td>
			<td>Table 3. Sequence information&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA acrydite labeled probe</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>synthesized</td>
			<td>Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>&#160;T1016</td>
			<td>Components of TE buffer, pH buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex taq</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR001A</td>
			<td>ssDNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>eclipse 80i</td>
			<td>Caculating number of microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>ssDNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held Corona Treater</td>
			<td>Electro-Technic</td>
			<td>BD-20AC Laboratory Corona Treater</td>
			<td>Hydrophilic surface treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>As one</td>
			<td>HI-1000</td>
			<td>heating plate for curing of liquid PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>kd Scientific</td>
			<td>78-1100</td>
			<td>Uniform flow of Solution I and Solution II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressor</td>
			<td>Kohands</td>
			<td>KC-250A</td>
			<td>Flow control of Solution III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Caculating number of microspheres</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a droplet-based microfluidic approach and microsphere-pcr amplification for single-stranded dna amplicons

Basato su goccia microfluidica consentono la produzione affidabile di microsfere omogenee nel canale di microfluidica, fornendo controllata, dimensioni e morfologia delle microsfere ottenute. Una microsfera copolimerizzato con una sonda di DNA coprocoltura con successo è stato fabbricato. Diversi metodi quali la PCR asimmetrica, digestione esonucleasi e isolamento su biglie magnetiche rivestite con streptavidina possono essere utilizzati per sintetizzare DNA a singola elica (ssDNA). Tuttavia, questi metodi non possono utilizzare in modo efficiente grandi quantità di altamente purificato ssDNA. Qui, descriviamo un protocollo di PCR di microsfere dettagliare come ssDNA può essere amplificato in modo efficiente e separato da dsDNA semplicemente pipettando da una provetta di reazione di PCR. L'amplificazione di ssDNA può essere applicato come potenziali reagenti per i microarray del DNA e DNA-SELEX (sistematica evoluzione di ligandi di arricchimento esponenziale) processi.

La piattaforma di fabbricato polimerici microfluidici basati su gocciolina è costituito da due strati PDMS (Figura 1a). Vengono utilizzati tre tipi di reti di canali microfluidici per la generazione di microsfere: geometria 1) flusso di messa a fuoco, come mostrato in Figura 1b, 2) un canale serpeggiante per miscelare la soluzione io e soluzione II e 3) un canale di polimerizzazione per microsfere solidificazione. L'altezza di t...

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A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Questo lavoro fornisce un metodo per la realizzazione di piattaforme microfluidici basati su gocciolina e l'applicazione di microsfere di poliacrilammide per l'amplificazione di PCR di microsfere. Il metodo di microsfere-PCR permette di ottenere single-stranded DNA ampliconi senza separare DNA double-stranded.

Un approccio basato su goccia di microfluidica e microsfere-PCR amplificazione per ampliconi di DNA Single-Stranded

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella tecnica combinatoria del sistema microfluidico e nel campo della biotecnologia molecolare, come i dispositivi microfluidici e il metodo PCR dell'asimmetria. I principali vantaggi di questa tecnica sono la generazione efficiente di microsfere altamente omogeneizzate e la produzione di DNA monofoto senza ulteriori fasi di separazione. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la diagnosi o la terapia di varie malattie.Poiché la generazione di DNA a singolo filamento è fondamentale per i test ap-ta-mo-sis, può essere utilizzata per il rilevamento e il trattamento. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul sistema microfluidico tridimensionale nel MEMS, può anche essere applicato ad altri sistemi utilizzati per il rilevamento e il trattamento delle malattie. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a controllare correttamente i fluidi dal fluire nella direzione inversa.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per osservare la formazione della microsfera nella geometria di messa a fuoco del flusso e la solidificazione delle microsfere generate. In primo luogo, preparare 20 millilitri di prepoli polimero PDMS liquido mescolando polimero di base e catalizzatore in un rapporto 10 a uno. Versare 10 millilitri del PDMS liquido su uno stampo SU-8 preparato su un wafer di silicio per la parte superiore della rete microfluidica.Per la parte piatta inferiore, versare lo stesso volume di PDMS liquido sul wafer di silicio senza una struttura di stampo. Posizionare due wafer di silicio rivestiti con prepoli polimero PDMS liquido su una piastra calda preriscaldata e polimerizzare a 75 gradi Celsius per 30 minuti. In seguito, rimuovere manualmente lo strato PDMS stagionato dallo stampo SU-8.Allineare uno strumento di foratura rotonda di 1,5 millimetri di diametro alla porta dell'olio sulla rete microfluidica replicata per interfacciare i canali di flusso su scala micron con i campioni di macroflussi. Quindi perforare manualmente il foro passante. Dopo aver ripetuto il processo di punzonatura tre volte, eseguire il trattamento superficiale idrofilo sia sugli strati PDMS superiori che inferiori utilizzando un trattamento corona portatile per diversi secondi per campione.Impilare due strati PDMS trattati al plasma e riscaldare a 90 gradi Celsius per 30 minuti su una piastra calda per il processo di incollaggio pdms-to-PDMS. Vortice e centrifugare brevemente una sonda standard con etichetta acridite di DNA a singolo filamento e una soluzione di acrilammide bis da 19 a uno. Preparare la soluzione uno mescolando 25 microlitri di soluzione di acrilammide bis al 40%, 10 microlitri di DNA a singolo filamento, 10 microlitri di tampone TBE 5X e cinque microlitri di acqua.Preparare la soluzione due con 50 microlitri di persolfuro di ammonio al 20%. Preparare due siringhe riempite singolarmente con la soluzione uno e la soluzione due e montarle sulla pompa della siringa per introdurre flussi di soluzione nella piattaforma microfluidico. Preparare l'olio minerale miscelato con 0,4%TEMED per la solidificazione superficiale della microsfera.Dopo aver riempito una bottiglia di vetro con l'olio minerale, inserire due tubi nelle porte pneumatiche e fluide nel tappo della bottiglia di vetro come serbatoio microfluidico. Collegare i tubi tra la bottiglia di vetro e la porta dell'olio nel dispositivo microfluidico. Collegare i tubi alle due porte di soluzione nel dispositivo microfluidico per fornire le due soluzioni dalle pompe per siringhe.Quindi inserire i tubi nella porta di uscita per trasferire la microsfera generata nel becher. Quindi, impostare la portata della pompa della siringa su 0,4 a 0,7 millilitri all'ora. Regolare la pressione dell'aria compressa del compressore utilizzando un regolatore.Posizionare un bicchiere di vetro con barra di agitazione magnetica su una piastra calda e impostare la velocità di rotazione. Azionare la pompa della siringa e fornire l'aria compressa generata da un compressore esterno nella bottiglia di vetro utilizzando il controllo on-off di una valvola elettromagnetica. Utilizzando un microscopio digitale, osservare la formazione di microsfere nella geometria di messa a fuoco del flusso e la solidificazione delle microsfere generate nel becher di vetro.Osservare la formazione di microsfere è uno dei passaggi più critici perché è un processo importante in questo studio per produrre microsfere e sistema microfluidico. In seguito, trasferire 100 microlitri delle microsfere in un tubo di micro-centrifuga da 1,5 millilitri. Quindi rimuovere il supernatante attraverso una delicata centrifugazione e pipettazione.Resuspend la cianina-3 modificata dalla sonda gratuita utilizzando 100 microlitri di tampone 1X TE al fine di ottenere una concentrazione finale di 100 micromolari. Successivamente, aggiungere 100 micromolari di cianina-3 complementare modificata dalla sonda a un tubo sterile di micro-centrifuga da 1,5 millilitri contenente microsfere copolmerizzate AP. Toccare il tubo alcune volte per mescolare e incubare a temperatura ambiente al buio per un'ora.Dopo l'incubazione, scartare il supernatante e rimuovere il tampone residuo attraverso la pipettazione. Quindi risciacquare tre volte con 500 microlitri di tampone TE. Posizionare le microsfere su uno scivolo di vetro da 75 per 50 millimetri e coprire con un foglio di alluminio prima dell'imaging.Ottenere circa 25 microsfere attraverso il conteggio microscopico utilizzando un microscopio luminoso con ingrandimento 40X. In seguito, combinare tutti i reagenti come descritto nel protocollo di testo. Posizionare i campioni in un termociclo e avviare la PCR asimmetrica nelle condizioni appropriate.La raccolta di un supernatante dopo pcr asimmetrica è uno dei passi più critici perché è un processo importante per generare DNA a singolo filamento con microsfera. Dopo l'amplificazione, aggiungere otto microlitri di buffer di caricamento 6X a ciascun campione. Caricare 15 microlitri di ciascun campione in gel di agarosio al 2%.Quindi eseguire l'elettroforesi a 100 volt per 35 minuti in tampone 1X TAE. Posizionare le microsfere ibride in un supporto e attaccare il supporto allo stadio di un microscopio confocale. Selezionare il laser e accenderlo nel controllo laser.Selezionare l'obiettivo nel controllo del microscopio. Selezionare quindi il filtro desiderato per la cianina-3 e il canale nel controllo di configurazione. Infine, avviare l'esperimento e osservare il campione.La piattaforma microfluidica a goccia polimerica fabbricata è costituita da due strati PDMS. Tre tipi di reti di canali microfluidici sono usati per generare microsfere, che sono la geometria di messa a fuoco del flusso, un canale serpentino per le soluzioni di miscelazione uno e due e un canale di polimerizzazione per la solidificazione della microsfera. Un sistema di controllo pneumatico basato sul laboratorio per il flusso continuo dell'olio minerale e due pompe per siringhe per il flusso della soluzione sono stati utilizzati per generare microsfere nella piattaforma microfluidico.Se le microsfere sono correttamente funzionalizzate con la sonda acridite a cinque primi, dovrebbero portare alla copertura dell'attività fluorescente sulla superficie durante l'esperimento di ibridazione come mostrato in queste immagini fluorescenti. Se la copolimerizzazione non si verifica correttamente, l'immagine della microsfera ottica mostrerebbe una contaminazione interna all'interno delle microsfere. Manipolare la superficie 3D delle microsfere con una sonda oligo-dna è un processo molto più veloce e una piattaforma di sintesi della microsfera a flusso può fornire uno strumento per l'amplificazione e la purificazione del DNA a singolo filamento.L'AP a cinque primi inizialmente copolimerizzato fornisce un'estremità idrossile a tre primi per la polimerizzazione del DNA dopo la ricottura al suo modello complementare. Nell'esperimento asimmetrico pcr sono stati osservati contaminanti di DNA a doppio filamento. Il DNA a singolo filamento risultante accumulato dalla PCR a microsfera è stato dimostrato rispetto ai marcatori di dimensione sintetica attraverso l'analisi dell'elettroforesi in gel.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la conoscenza preliminare dei protocolli e delle regolazioni comunemente necessari per ottimizzare gli esperimenti PCR è necessaria per ottenere il ciclo di amplificazione, la temperatura di ricottura e la sequenza di sonda in questo metodo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della diagnosi e della terapia per collegare due regioni nella biotecnologia molecolare e nella biomedicina. Non dimenticare che lavorare con la soluzione di acrilammide può essere pericoloso e precauzioni come indossare guanti e camici da laboratorio dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

Research

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