Name: a droplet-based microfluidic approach and microsphere-pcr amplification for single-stranded dna amplicons
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons at JoVE.com

Denne studien er støttet av et prosjekt kalt "kooperativ Research Program for landbruk vitenskap og teknologiutvikling (Project nr. PJ0011642) "finansiert av Rural Development administrasjonen, Sør-Korea. Denne forskningen ble delvis støttet av stipend (NRF-2017R1A2B4012253) av grunnleggende vitenskap forskningsprogrammet gjennom National Research Foundation (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtiden planlegging, Sør-Korea. Denne forskningen ble også støttet av stipend (N0000717) av programmet utdanning for Creative og industrielle konvergens finansiert av departementet for handel og industri energi, Sør-Korea.

1. fabrikasjon av en PDMS Microfluidic plattform
<ol><li>Forberede 20 mL væske PDMS prepolymer ved å blande polymer base og katalysator i Volumforholdet 10:1. Hell 10 mL væske PDMS på en forberedt SU-8 mold på en silicon wafer for øvre del av microfluidic nettverket. For flat nederst, hell samme volum av flytende PDMS på silisium kjeks uten en mold struktur. Merk: Microfluidic nettverket er designet i en CAD-programmet og deretter konverteres til et photomask for å dikte opp en mester bruke typisk klima og j...

<ol>
	<li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method.">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li><li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays.">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li><li>Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+RNA+polymerase-promoter+interaction+by+using+ssDNA-dsDNA+probe+on+a+surface+addressable+microarray.">Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray.</a> Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).</li><li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+(AIRP).">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li><li>Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Xenopus+laevis+mitochondrial+single-stranded+DNA-binding+protein+on+primer-template+binding+and+3'--&gt;5'+exonuclease+activity+of+DNA+polymerase+gamma.">Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'--&gt;5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).</li><li>Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-demand+one-step+synthesis+of+monodisperse+functional+polymeric+microspheres+with+droplet+microfluidics.">On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics.</a> Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).</li><li>Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-Integrated+Glass+Capillary+Device+for+Preparing+Small-Sized+Water-in-Oil-in-Water+Emulsion+Droplets.">Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets.</a> Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Flow+Synthesis+of+Co-Polymerizable+Oligo-Microspheres+and+Application+in+ssDNA+Amplification.">On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification.</a> PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).</li><li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+dispersions+using+&amp;#34;flow+focusing&amp;#34;+in+microchannels.">Formation of dispersions using &amp;#34;flow focusing&amp;#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li><li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+formation+via+squeezing+mechanism+in+a+microfluidic+flow-focusing+device.">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers &amp; Fluids. 100, 218-226 (2014).</li><li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices.">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li><li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+bonding+by+means+of+a+portable,+low-cost+corona+system.">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li><li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics.">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li><li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios.">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).</li><li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers.">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li></ol>

Forurensning av dsDNA er et stort problem i ssDNA forsterkning. Det er fortsatt vanskelig å minimere dsDNA forsterkning i konvensjonelle asymmetrisk PCR forsterkning15. Dessuten, selv om tekniske forbedringer for å generere ssDNA har aktivert til å øke effektiviteten av utvalg ytelse, er ssDNA isolasjon fortsatt problematisk på grunn av sin høye kostnader og ufullstendig rensing gir.
Asymmetrisk PCR er en av de mest utfordrende metodene under arbeid med ssDNA. Den...

Single-strandet DNA (ssDNA) har vært grundig vurdert som et molekylær anerkjennelse element (MRE) på grunn av dens iboende egenskaper for DNA-DNA hybridisering1,2. Utviklingen av ssDNA syntetiske systemer kan føre til biologiske programmer som DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnostikk og integrert molekylær sensing basert på supplerende interaksjoner4,5.
Hittil har mikrometer skala polymer partikler blitt vist med microfluidic enheter. Flere microfluidic teknikker har vist seg for å være kraftig for å produsere svært homogen mikrosfærer på kontinuerlig flyt i microchannel miljø6,7.
I studiet av Lee et al. 8, en dråpe-baserte microfluidic plattform for microfluidic syntese av copolymerizable oligo-microsphere og ssDNA forsterkning ble rapportert. Den microfluidic består av to PDMS (polydimethylsiloxane) lag: en øvre del med et microfluidic kanal nettverk for å generere microsphere og en bunn flatt del. Disse består av tre typer PDMS fluidic kanaler: 1) en flyt fokusere kanal for slippverktøy generasjon, 2) en serpentin kanal for å blande to løsninger og 3) en sekvensiell polymerisasjon kanal for microsphere størkning. Når to ikke blandbar flyter innføres i én PDMS fluidic kanal, kan strømmer bli tvunget gjennom smale orifice strukturen. Flyt atferd som kanal geometri, vannmengde og viskositet påvirke størrelsen på og morfologi av microsphere. Derfor kan main flytende stream deles inn i Mikroskala monospheres9,10.
Her tilbys en detaljert microsphere PCR-protokoll for forsterkningen på ssDNA. Først er en dråpe-baserte microfluidic enheten designprosessen beskrevet. Deretter er veien i hvilke polyakrylamid mikrosfærer kan være functionalized med tilfeldige DNA mal på en utfyllende måte forklart. Til slutt vises en microsphere PCR-protokoll for å forsterke ssDNA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>liquid polydimethylsiloxane, PDMS</td>
			<td>Dow Corning Inc.</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide:bis solution (19:1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Components of Copolymerizable oligo-microsphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate, APS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Hardener of acrylamide:bis solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine, TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Catalyst of ammonium persulfate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td>Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>synthesized</td>
			<td>Table 3. Sequence information&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA acrydite labeled probe</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>synthesized</td>
			<td>Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>&#160;T1016</td>
			<td>Components of TE buffer, pH buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex taq</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR001A</td>
			<td>ssDNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>eclipse 80i</td>
			<td>Caculating number of microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>ssDNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held Corona Treater</td>
			<td>Electro-Technic</td>
			<td>BD-20AC Laboratory Corona Treater</td>
			<td>Hydrophilic surface treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>As one</td>
			<td>HI-1000</td>
			<td>heating plate for curing of liquid PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>kd Scientific</td>
			<td>78-1100</td>
			<td>Uniform flow of Solution I and Solution II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressor</td>
			<td>Kohands</td>
			<td>KC-250A</td>
			<td>Flow control of Solution III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Caculating number of microspheres</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a droplet-based microfluidic approach and microsphere-pcr amplification for single-stranded dna amplicons

Slippverktøy-baserte microfluidics gjør at pålitelig produksjonen av homogen mikrosfærer i mikrovæskekanalen, kontrollert størrelse og morfologi av innhentet microsphere. En microsphere copolymerized med en acrydite-DNA sonde ble vellykket fabrikkert. Metoder som asymmetrisk PCR, exonuclease fordøyelsen og isolasjon på streptavidin-belagt magnetiske perler kan brukes å syntetisere single-strandet DNA (ssDNA). Men kan ikke disse metodene effektivt bruke store mengder høyrenset ssDNA. Her beskriver vi en microsphere PCR protokoll detaljering hvordan ssDNA kan være effektivt forsterket og atskilt fra dsDNA ved pipettering fra et PCR reaksjon rør. Forsterkningen på ssDNA kan brukes som potensielle reagenser for DNA microarray og DNA-SELEX (systematisk utviklingen av ligander av eksponentiell berikelse) prosesser.

Fabrikkert polymere slippverktøy-baserte microfluidic plattformen består av to PDMS lag (figur 1a). Tre typer microfluidic kanal nettverk brukes for å generere mikrosfærer: 1) flyt-fokus geometri som vist i figur 1b, 2) en serpentin kanal for å blande løsning jeg og løsning II og 3) en polymerisering kanal for microsphere herding. Høyden på alle kanaler var 60 μm. Hvor kanalen for miksing og polymerisasjon var 74.35 mm ...

Watch this Scientific Journal Video about A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons at JoVE.com

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Dette arbeidet gir en metode for fabrikasjon av droplet-baserte microfluidic plattformer og anvendelse av polyakrylamid mikrosfærer for microsphere PCR forsterkning. Microsphere PCR-metoden gjør det mulig å få enkelt-strandet DNA amplicons uten skille double-strandet DNA.

En dråpe Microfluidic tilnærming og Microsphere PCR forsterkning for Single-strandet DNA Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i kombinatorisk teknikk av mikrofluidisk system og molekylær bioteknologi feltet, for eksempel mikrofluidiske enheter og asymmetri PCR metode. De viktigste fordelene med denne teknikken er effektiv generering av svært homogeniserte mikrosfærer og produksjon av entrådet DNA uten ytterligere separasjonstrinn. Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot diagnose eller terapi av ulike sykdommer.Fordi generering av single-strand DNA er nøkkelen for ap-ta-mo-sis analyser, kan den brukes til deteksjon og behandling. Selv om denne metoden kan gi innsikt i tredimensjonalt mikrofluidisk system i MEMS, kan den også brukes på andre systemer som brukes til deteksjon og behandling av sykdom. Generelt vil personer som er nye på denne metoden, slite med å kontrollere væsker riktig fra å strømme i motsatt retning.Visuell demonstrasjon av denne metoden er avgjørende for å observere mikrosfæredannelsen i strømningsfokuseringsgeometrien og størkning av genererte mikrosfærer. Først forberede 20 milliliter flytende PDMS pre-polymer ved å blande base polymer og katalysator i et 10-til-en-forhold. Hell 10 milliliter av den flytende PDMS på en forberedt SU-8-form på en silisiumwafer for den øvre delen av det mikrofluidiske nettverket.For den nederste flate delen, hell samme volum av flytende PDMS på silisiumwafer uten en muggstruktur. Legg to silisiumwafers belagt med flytende PDMS pre-polymer på en forvarmet kokeplate og herd ved 75 grader Celsius i 30 minutter. Etter dette, manuelt skrelle av herdet PDMS lag fra SU-8 mold.Juster et rundt hullstanseverktøy med 1,5 millimeter diameter til oljeporten på det replikerte mikrofluidiske nettverket for grensesnitt av mikronskalastrømningskanaler med makrovæskeprøvene. Slå deretter ut gjennomhullet manuelt. Etter å ha gjentatt stanseprosessen tre ganger, utfør hydrofile overflatebehandling på både øvre og nedre PDMS-lag ved hjelp av en håndholdt koronabehandling i flere sekunder per prøve.Stable to plasmabehandlede PDMS-lag og varme ved 90 grader Celsius i 30 minutter på en kokeplate for PDMS-til-PDMS-bindingsprosessen. Vortex og kort sentrifuge en standard single-strandet DNA acrydite-merket sonde og en 19-til-en akrylamid bis lagerløsning. Forbered løsning en ved å blande 25 mikroliter med 40% akrylamidbisløsning, 10 mikroliter med enkelttrådet DNA, 10 mikroliter 5X TBE-buffer og fem mikroliter vann.Forbered løsning to med 50 mikroliter på 20% ammoniumpersulfat. Forbered to sprøyter individuelt fylt med løsning en og løsning to og monter dem på sprøytepumpen for å introdusere oppløsningsstrømmer inn i mikrofluidisk plattform. Forbered mineralolje blandet med 0,4% TEMED for overflatestørkning av mikrosfæren.Etter å ha fylt en glassflaske med mineraloljen, sett to rør inn i pneumatiske og flytende porter i hetten på glassflasken som et mikrofluidisk reservoar. Koble rørene mellom glassflasken og oljeporten i mikrofluidisk enhet. Koble rørene til de to løsningsportene i mikrofluidisk enhet for å levere de to løsningene fra sprøytepumpene.Sett deretter rørene inn i utløpsporten for å overføre den genererte mikrosfæren inn i begeret. Deretter setter du strømningshastigheten til sprøytepumpen til 0,4 til 0,7 milliliter per time. Juster kompressorens trykk ved hjelp av en regulator.Plasser et glassbeger med magnetisk rørestang på en kokeplate og still inn rotasjonshastigheten. Bruk sprøytepumpen og tilfør trykkluften som genereres av en ekstern kompressor inn i glassflasken ved hjelp av av-på-kontrollen av en elektromagnetisk ventil. Ved hjelp av et digitalt mikroskop, observere dannelsen av mikrosfærer i strømningsfokusering geometri og størkning av genererte mikrosfærer i glassbegeret.Å observere dannelsen av mikrosfærer er et av de mest kritiske trinnene fordi det er en viktig prosess i denne studien for å produsere mikrosfærer og mikrofluidisk system. Etter dette overfører du 100 mikroliter av mikrosfærene til et 1,5 milliliter mikrosentrifugerrør. Fjern deretter supernatanten gjennom skånsom sentrifugering og pipettering.Gjenoppusser den kostnadsfrie probemodifiserte cyanine-3 ved hjelp av 100 mikroliter 1X TE-buffer for å oppnå en endelig konsentrasjon på 100 mikromos. Deretter legger du til 100 mikromos av komplementær probemodifisert cyanin-3 til en steril 1,5 milliliter mikrosentrifugerrør som inneholder AP copolymerized mikrosfærer. Trykk på røret et par ganger for å blande og inkubere ved romtemperatur i mørket i en time.Etter inkubasjon, kast overnatanten og fjern restbufferen gjennom pipettering. Skyll deretter tre ganger med 500 mikroliter TE-buffer. Plasser mikrosfærene på et glasssklie på 75 ganger 50 millimeter og dekk med aluminiumsfolie før avbildning.Få ca 25 mikrosfærer gjennom mikroskopisk telling ved hjelp av et lett mikroskop med 40X forstørrelse. Etter dette kombinerer du alle reagenser som beskrevet i tekstprotokollen. Plasser prøvene i en termocycler og start den asymmetriske PCR under de aktuelle forholdene.Samlingen av en supernatant etter asymmetrisk PCR er et av de mest kritiske skrittene fordi det er en viktig prosess for å generere single-strand DNA med mikrosfære. Etter forsterkning legger du til åtte mikroliter med 6X-innlastingsbuffer i hver prøve. Legg 15 mikroliter av hver prøve i 2% agarose gel.Utfør deretter elektroforese ved 100 volt i 35 minutter i 1X TAE-buffer. Plasser de hybridiserte mikrosfærene i en holder og fest holderen til scenen av et konfokalt mikroskop. Velg laseren og slå den på i laserkontrollen.Velg objektivet i mikroskopkontrollen. Velg deretter ønsket filter for cyanine-3 og kanal i konfigurasjonskontrollen. Til slutt starter du eksperimentet og observerer prøven.Den fabrikkerte polymere dråpebaserte mikrofluidiske plattformen består av to PDMS-lag. Tre typer mikrofluidiske kanalnettverk brukes til å generere mikrosfærer, som er strømningsfokuserende geometri, en serpentinkanal for blandingsløsninger en og to, og en polymeriseringskanal for mikrosfærestørkning. Et laboratoriebasert pneumatisk kontrollsystem for kontinuerlig strømning av mineraloljen og to sprøytepumper for løsningsstrømmen ble brukt til å generere mikrosfærer i mikrofluidisk plattform.Hvis mikrosfærene er riktig funksjonalisert med den fem-prime acrydite DNA-sonden, bør de resultere i dekning av fluorescerende aktivitet på overflaten under hybridiseringseksperimentet som vist i disse fluorescerende bildene. Hvis komorisering ikke forekommer riktig, vil det optiske mikrosfærebildet vise intern forurensning inne i mikrosfærene. Manipulering av 3D-overflaten av mikrosfærer med en DNA oligo-sonde er en mye raskere prosess, og en mikrosfæresynteseplattform på strøm kan gi et verktøy for en stranded DNA-forsterkning og rensing.Den opprinnelig kopolymeriserte fem-prime AP gir en tre-prime hydroksyl ende for DNA polymerisering etter annealing til sin komplementære mal. Dobbelttrådet DNA-forurensninger ble observert i det asymmetriske PCR-eksperimentet. Det resulterende entrådet DNA akkumulert fra mikrosfære PCR ble demonstrert i forhold til syntetiske størrelse markører gjennom gel elektroforese analyse.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske at forkunnskaper om protokoller og justeringer som vanligvis er nødvendige for å optimalisere PCR-eksperimenter, er nødvendig for å oppnå forsterkningssyklusen, glødetemperaturen og sondesekvensen i denne metoden. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen diagnose og terapi for å koble to regioner i molekylær bioteknologi og biomedisin. Ikke glem at arbeid med akrylamidløsning kan være farlig, og forholdsregler som bruk av hansker og laboratoriefrakker bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Microfluidic Mixers for å studere Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

En Microfluidic enhet for Studerer Flere Tydelig Stammer

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Skin tatovering som en ny tilnærming for DNA vaksine levering

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Mikrofluidisk fabrikasjon av polymere og biohybridfibre med forhåndsdesignet størrelse og form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

En microfluidic basert Elektrokjemisk biochip for Label-free DNA Hybridisering Analyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

En mikrofluid Chip for ICPMS Sample Innledning

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En mikrofluid plattform for High-throughput encellede Isolering og kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-trinns variabel Høyde Fotolitografi for Valved Multilayer microfluidic enheter

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic Plattform med multiplekset Electronic Detection for Spatial Sporing av partikler

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...