Name: a droplet-based microfluidic approach and microsphere-pcr amplification for single-stranded dna amplicons
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00
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Este estudio es apoyado por un proyecto titulado "programa investigación cooperativa de agricultura ciencia y tecnología desarrollo (proyecto no. PJ0011642) "financiado por la dirección de Desarrollo Rural, República de Corea. Esta investigación fue apoyada también en parte por una subvención (NRF-2017R1A2B4012253) del programa de investigación en ciencia básica a través de la Fundación Nacional de investigación (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y planeación de futuro, República de Corea. Esta investigación también fue apoyada por una beca (N0000717) del programa de educación creativa y convergencia Industrial financiado por el Ministerio de comercio, industria y energía, República de Corea.

1. fabricación de una plataforma de microfluídica PDMS
<ol><li>Prepare 20 mL de líquido prepolímero PDMS mezclando polímero base y catalizador en una proporción de volumen de 10:1. Vierta 10 mL de líquido PDMS en un molde de SU-8 preparado sobre una oblea de silicio en la parte superior de la red de microfluidos. Para la parte plana del fondo, vierta el mismo volumen de líquido PDMS en la oblea de silicio sin estructura de molde. Nota: La red de microfluidos es diseñada en un programa CAD y luego se convier...

<ol>
	<li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method.">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li><li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays.">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li><li>Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+RNA+polymerase-promoter+interaction+by+using+ssDNA-dsDNA+probe+on+a+surface+addressable+microarray.">Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray.</a> Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).</li><li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+(AIRP).">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li><li>Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Xenopus+laevis+mitochondrial+single-stranded+DNA-binding+protein+on+primer-template+binding+and+3'--&gt;5'+exonuclease+activity+of+DNA+polymerase+gamma.">Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'--&gt;5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).</li><li>Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Flow+Synthesis+of+Co-Polymerizable+Oligo-Microspheres+and+Application+in+ssDNA+Amplification.">On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification.</a> PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).</li><li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+dispersions+using+&amp;#34;flow+focusing&amp;#34;+in+microchannels.">Formation of dispersions using &amp;#34;flow focusing&amp;#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li><li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+formation+via+squeezing+mechanism+in+a+microfluidic+flow-focusing+device.">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers &amp; Fluids. 100, 218-226 (2014).</li><li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices.">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li><li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+bonding+by+means+of+a+portable,+low-cost+corona+system.">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li><li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics.">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li><li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios.">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).</li><li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers.">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li></ol>

Contaminantes de dsDNA son una cuestión importante en la amplificación de ssDNA. Sigue siendo difícil minimizar la amplificación de dsDNA de amplificación PCR asimétrico convencional15. Además, aunque mejoras técnicas para la generación de ssDNA nos han permitido aumentar la eficiencia de producción de muestras, aislamiento de ssDNA es todavía problemática debido a sus altos costos y rendimientos de depuración incompleta.
PCR asimétrico es uno de los méto...

ADN monocatenario (ssDNA) ha sido ampliamente considerado como un elemento de reconocimiento molecular (MRE) debido a sus propiedades intrínsecas para hibridación de ADN-DNA1,2. El desarrollo de sistemas sintéticos ssDNA puede conducir a aplicaciones biológicas como ADN microarrays3, oligotherapeutics, diagnóstico y detección molecular integrado basado en interacciones complementarias4,5.
Hasta la fecha, las partículas de polímero de micrómetro-escala han demostrado con éxito utilizando dispositivos microfluídicos. Varias técnicas de microfluidos han demostrado para ser potentes para la producción de microesferas muy homogéneas en un flujo continuo en el entorno de microchannel6,7.
En el estudio de Lee et al. se informó de 8, una plataforma de microfluídica basada en gotas para la síntesis de microfluídica de amplificación microesfera de oligo y ssDNA copolymerizable. La plataforma de microfluidos consiste en dos capas PDMS (polidimetilsiloxano): una parte superior con una red de canal de microfluidos para la generación de la microesfera y un fondo plano parte. Éstos consisten en tres tipos de canales fluídicos PDMS: 1) un flujo enfoque canal para la generación de gotas, 2) un canal serpenteante para la mezcla de dos soluciones y 3) un canal de polimerización secuencial para la solidificación de la microesfera. Una vez que se introducen dos flujos inmiscibles en un solo canal fluídico de PDMS, los flujos pueden ser forzados a través de la estructura del orificio estrecho. Los comportamientos de flujo tales como la geometría del canal, caudal y la viscosidad afectan el tamaño y la morfología de la microesfera. Por lo tanto, la corriente líquida principal puede dividirse en microescala monospheres9,10.
Aquí, se proporciona un protocolo detallado de microesfera-PCR para la amplificación de ssDNA. En primer lugar, se describe un proceso de diseño de dispositivos microfluídicos basada en gotas. A continuación, se explica la manera en que la poliacrilamida microesferas pueden ser funcionalizadas con plantilla de ADN al azar de manera complementaria. Por último, se muestra un protocolo de microesfera-PCR para amplificar ssDNA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>liquid polydimethylsiloxane, PDMS</td>
			<td>Dow Corning Inc.</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide:bis solution (19:1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Components of Copolymerizable oligo-microsphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate, APS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Hardener of acrylamide:bis solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine, TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Catalyst of ammonium persulfate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td>Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>synthesized</td>
			<td>Table 3. Sequence information&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA acrydite labeled probe</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>synthesized</td>
			<td>Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>&#160;T1016</td>
			<td>Components of TE buffer, pH buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex taq</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR001A</td>
			<td>ssDNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>eclipse 80i</td>
			<td>Caculating number of microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>ssDNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held Corona Treater</td>
			<td>Electro-Technic</td>
			<td>BD-20AC Laboratory Corona Treater</td>
			<td>Hydrophilic surface treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>As one</td>
			<td>HI-1000</td>
			<td>heating plate for curing of liquid PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>kd Scientific</td>
			<td>78-1100</td>
			<td>Uniform flow of Solution I and Solution II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressor</td>
			<td>Kohands</td>
			<td>KC-250A</td>
			<td>Flow control of Solution III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Caculating number of microspheres</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a droplet-based microfluidic approach and microsphere-pcr amplification for single-stranded dna amplicons

Microfluídica basada en gotita permite la producción confiable de microesferas homogéneas en el canal microfluídico, controlado tamaño y morfología de la microesfera obtenida. Una microesfera copolymerized con una sonda de ADN acrydite se fabricó con éxito. Diferentes métodos como PCR, digestión de exonucleasa y aislamiento en bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina asimétrica pueden utilizarse para sintetizar ADN monocatenario (ssDNA). Sin embargo, estos métodos no utilizan eficientemente grandes cantidades de ssDNA altamente purificado. Aquí, describimos un protocolo de PCR microesfera detallando cómo ssDNA puede ser eficientemente amplificado y separado de dsDNA simplemente transfiriendo de un tubo de reacción de PCR. La amplificación de ssDNA puede aplicarse como potencial reactivo de los microarrays de DNA y DNA-SELEX (evolución sistemática de los ligandos por el enriquecimiento exponencial) procesos.

La plataforma fabricado microfluídicos poliméricos basados en la gota consiste en dos capas PDMS (Figura 1a). Se utilizan tres tipos de redes de canales de microfluidos para generar microesferas: geometría 1) el enfoque de flujo como se muestra en la Figura 1b, 2) un canal serpenteante para mezclar solución I solución II y 3) un canal de polimerización para microesfera solidificación. La altura de todos los canales fue 60 ...

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A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Este trabajo proporciona un método para la fabricación de plataformas de microfluídica basada en la gota y la aplicación de microesferas de poliacrilamida para la amplificación por PCR de la microesfera. El método de microesfera-PCR hace posible obtener amplicones de ADN monocatenario sin la separación del ADN de doble hebra.

Una gotita-enfoque basado en microfluidos y amplificación por PCR de microesfera para amplicones de ADN

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la técnica combinatoria del sistema microfluídico y el campo de la biotecnología molecular, como los dispositivos microfluídicos y el método de pcR de asimetría. Las principales ventajas de esta técnica son la generación eficiente de microesferas altamente homogeneizadas y la producción de ADN de una sola cadena sin ningún paso de separación adicional. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico o la terapia de diversas enfermedades.Debido a que la generación de ADN de una sola cadena es clave para los ensayos ap-ta-mo-sis, se puede utilizar para la detección y el tratamiento. Aunque este método puede proporcionar información sobre el sistema microfluídico tridimensional en MEMS, también se puede aplicar a otros sistemas utilizados para la detección y el tratamiento de la enfermedad. Generalmente, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades para controlar adecuadamente los fluidos de fluir en la dirección inversa.La demostración visual de este método es fundamental para observar la formación de la microesfera en la geometría de enfoque de flujo y la solidificación de las microesferas generadas. En primer lugar, prepare 20 mililitros de prepolimero LÍQUIDO PDMS mezclando polímero base y catalizador en una proporción de 10 a uno. Vierta 10 mililitros de los PDMS líquidos en un molde SU-8 preparado sobre una oblea de silicio para la parte superior de la red microfluídica.Para la parte plana inferior, vierta el mismo volumen de PDMS líquido en la oblea de silicio sin una estructura de molde. Coloque dos obleas de silicio recubiertas con prepolimero LÍQUIDO PDMS en una placa caliente y cure a 75 grados Centígrados durante 30 minutos. Después de esto, despegue manualmente la capa PDMS curada del molde SU-8.Alinee una herramienta de perforación de orificios redondos de 1,5 milímetros de diámetro con el puerto de aceite de la red microfluídica replicada para interconectar canales de flujo a escala de micrones con las muestras de macrofluta. A continuación, perforar manualmente el orificio pasante. Después de repetir el proceso de punzonado tres veces, realice el tratamiento de la superficie hidrófila en las capas PDMS superior e inferior utilizando un tratamiento de corona portátil durante varios segundos por muestra.Apile dos capas PDMS tratadas con plasma y caliente a 90 grados Centígrados durante 30 minutos en una placa de cocción para el proceso de unión de PDMS a PDMS. Vortex y centrifugar brevemente una sonda estándar con etiqueta de acririto de ADN de una sola cadena y una solución de stock de acrilamida bis de 19 a uno. Prepare la solución uno mezclando 25 microlitros de 40% de solución de acrilamida bis, 10 microlitros de ADN de una sola cadena, 10 microlitros de tampón 5X TBE y cinco microlitros de agua.Preparar la solución dos con 50 microlitros de 20% de persulfato de amonio. Prepare dos jeringas llenas individualmente con solución uno y solución dos y colóquelas en la bomba de jeringa para introducir flujos de solución en la plataforma microfluídica. Preparar aceite mineral mezclado con 0.4%TEMED para la solidificación superficial de la microesfera.Después de llenar una botella de vidrio con el aceite mineral, inserte dos tubos en los puertos neumáticos y fluidos en la tapa de la botella de vidrio como depósito microfluídico. Conecte los tubos entre la botella de vidrio y el puerto de aceite en el dispositivo microfluídico. Conecte los tubos a los dos puertos de solución del dispositivo microfluídico para suministrar las dos soluciones de las bombas de jeringa.A continuación, inserte los tubos en el puerto de salida para transferir la microesfera generada en el vaso de precipitados. A continuación, ajuste el caudal de la bomba de jeringa a 0,4 a 0,7 mililitros por hora. Ajuste la presión de aire comprimido del compresor utilizando un regulador.Coloque un vaso de precipitados de vidrio con una barra de agitación magnética en una placa de cocción y ajuste la velocidad de rotación. Operar la bomba de la jeringa y suministrar el aire comprimido generado por un compresor externo en la botella de vidrio utilizando el control de encendido-apagado de una válvula electromagnética. Usando un microscopio digital, observe la formación de microesferas en la geometría de enfoque de flujo y la solidificación de microesferas generadas en el vaso de precipitados de vidrio.Observar la formación de microesferas es uno de los pasos más críticos porque es un proceso importante en este estudio para producir microesferas y sistema microfluídico. Después de esto, transfiera 100 microlitros de las microesferas a un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, retire el sobrenadante a través de una suave centrifugación y pipeteo.Resuspender la sonda de cortesía modificada cianina-3 utilizando 100 microlitros de 1X Tampón TE con el fin de lograr una concentración final de 100 micromolares. A continuación, añada 100 micromolares de cianina-3 modificada por sonda complementaria a un tubo estéril de microterfurecitro de 1,5 mililitros que contenga microesferas copolymerizadas AP. Toque el tubo varias veces para mezclar e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora.Después de la incubación, deseche el sobrenadante y retire el tampón residual a través del pipeteo. A continuación, enjuague tres veces con 500 microlitros de tampón TE. Coloque las microesferas en un portaobjetos de vidrio de 75 por 50 milímetros y cúbralos con papel de aluminio antes de la toma de imágenes.Obtenga aproximadamente 25 microesferas a través del conteo microscópico utilizando un microscopio de luz con aumento de 40X. Después de esto, combine todos los reactivos como se describe en el protocolo de texto. Coloque las muestras en un termociclador e inicie la PCR asimétrica en las condiciones adecuadas.La colección de un sobrenadante después de la PCR asimétrica es uno de los pasos más críticos porque es un proceso importante para generar ADN de una sola cadena con microesfera. Después de la amplificación, agregue ocho microlitros de búfer de carga 6X a cada muestra. Cargue 15 microlitros de cada muestra en un gel de 2% de agarosa.A continuación, realice la electroforesis a 100 voltios durante 35 minutos en el búfer 1X TAE. Coloque las microesferas hibridas en un soporte y conecte el soporte a la etapa de un microscopio confocal. Seleccione el láser y enciéndalo en el control láser.Seleccione la lente objetivo en el control del microscopio. A continuación, seleccione el filtro deseado para cianina-3 y canal en el control de configuración. Por último, inicie el experimento y observe la muestra.La plataforma microfluídica polimérica fabricada basada en gotas consta de dos capas PDMS. Se utilizan tres tipos de redes de canales microfluídicos para generar microesferas, que son geometría de enfoque de flujo, un canal de serpentina para mezclar soluciones uno y dos, y un canal de polimerización para la solidificación de microesferas. Se utilizó un sistema de control neumático basado en laboratorio para el flujo continuo del aceite mineral y dos bombas de jeringa para el flujo de solución para generar microesferas en la plataforma microfluídica.Si las microesferas están correctamente funcionalizadas con la sonda de ADN de arydite de cinco primos, deben dar lugar a la cobertura de la actividad fluorescente en la superficie durante el experimento de hibridación como se muestra en estas imágenes fluorescentes. Si la copolimerización no se produce correctamente, la imagen de la microesfera óptica exhibiría contaminación interna dentro de las microesferas. Manipular la superficie 3D de las microesferas con una sonda oligodesarma de ADN es un proceso mucho más rápido y una plataforma de síntesis de microesfera en flujo puede proporcionar una herramienta para la amplificación y purificación de ADN de una sola cadena.El AP inicialmente copolymerizado de cinco primos proporciona un extremo hidroxilo de tres primos para la polimerización del ADN después de recocido a su plantilla complementaria. En el experimento asimétrico de PCR se observaron contaminantes de ADN de doble cadena. El ADN de una sola cadena resultante acumulado a partir de la PCR de microesfera se demostró en comparación con los marcadores de tamaño sintético a través del análisis de electroforesis de gel.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el conocimiento previo de los protocolos y ajustes que son comúnmente necesarios para optimizar los experimentos de PCR son necesarios para obtener el ciclo de amplificación, la temperatura de recocido y la secuencia de la sonda en este método. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del diagnóstico y la terapia conectaran dos regiones de la biotecnología molecular y la biomedicina. No olvide que trabajar con solución de acrilamida puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como usar guantes y abrigos de laboratorio durante la realización de este procedimiento.

Research

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