Name: a droplet-based microfluidic approach and microsphere-pcr amplification for single-stranded dna amplicons
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons at JoVE.com

Denna studie stöds av ett projekt med titeln ”kooperativa forskningsprogram för jordbruk Science & teknikutveckling (projekt nr. PJ0011642) ”finansieras av landsbygdens utveckling Administration, Sydkorea. Denna forskning stöds också delvis av bidrag (NRF-2017R1A2B4012253) av den grundläggande vetenskap forskningsprogram genom den nationella Research Foundation (NRF) finansieras av ministeriet för vetenskap, IKT & framtida planering, Sydkorea. Denna forskning stöddes också av bidrag (N0000717) av programmet utbildning för Creative och industriella konvergens finansieras av ministeriet för handel, industri och energi, Sydkorea.

1. tillverkning av en PDMS mikroflödessystem plattform
<ol><li>Förbered 20 mL flytande PDMS prepolymer genom att blanda bas polymer och katalysator i volymförhållandet 10:1. Häll 10 mL av vätskan PDMS på en förberedd SU-8 mögel på en silicon wafer för den övre delen av mikrofabricerade nätverket. För platta nedtill, Häll flytande PDMS samma volym på kisel rånet utan en mögel struktur. Obs: Mikroflödessystem nätverket är designat i ett CAD-program och sedan omvandlas till en photomasken för att ...

<ol>
	<li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method.">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li><li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays.">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li><li>Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+RNA+polymerase-promoter+interaction+by+using+ssDNA-dsDNA+probe+on+a+surface+addressable+microarray.">Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray.</a> Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).</li><li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+(AIRP).">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li><li>Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Xenopus+laevis+mitochondrial+single-stranded+DNA-binding+protein+on+primer-template+binding+and+3'--&gt;5'+exonuclease+activity+of+DNA+polymerase+gamma.">Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'--&gt;5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).</li><li>Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-demand+one-step+synthesis+of+monodisperse+functional+polymeric+microspheres+with+droplet+microfluidics.">On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics.</a> Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).</li><li>Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-Integrated+Glass+Capillary+Device+for+Preparing+Small-Sized+Water-in-Oil-in-Water+Emulsion+Droplets.">Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets.</a> Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Flow+Synthesis+of+Co-Polymerizable+Oligo-Microspheres+and+Application+in+ssDNA+Amplification.">On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification.</a> PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).</li><li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+dispersions+using+&amp;#34;flow+focusing&amp;#34;+in+microchannels.">Formation of dispersions using &amp;#34;flow focusing&amp;#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li><li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+formation+via+squeezing+mechanism+in+a+microfluidic+flow-focusing+device.">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers &amp; Fluids. 100, 218-226 (2014).</li><li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices.">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li><li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+bonding+by+means+of+a+portable,+low-cost+corona+system.">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li><li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics.">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li><li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios.">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).</li><li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers.">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li></ol>

Föroreningar av dsDNA är en huvudfråga i ssDNA förstärkning. Det är fortfarande svårt att minimera dsDNA amplifiering i konventionella asymmetrisk PCR-amplifiering15. Dessutom, även om tekniska förbättringar för att generera ssDNA möjliggjort för oss att öka effektiviteten i provkapaciteten, är ssDNA isolering fortfarande problematiskt på grund av dess höga kostnader och ofullständig rening avkastning.
Asymmetrisk PCR är en av de mest utmanande metode...

Enkelsträngat DNA (ssDNA) och det har ansetts som en molekylär igenkänning element (MRE) i stor utsträckning på grund av dess inneboende egenskaper för DNA-DNA hybridisering1,2. Utvecklingen av ssDNA syntetiska system kan leda till biologiska applikationer såsom DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnostik och integrerad molekylär avkänning baserat på kompletterande interaktioner4,5.
Hittills har har mikrometer-skala polymer partiklar framgångsrikt visat använder mikroflödessystem enheter. Flera mikroflödessystem tekniker har visat sig vara kraftfull för att producera mycket homogen mikrosfärer på kontinuerligt flöde i microchannel miljö6,7.
I studien av Lee et al. 8, en droplet-baserade mikroflödessystem plattform för mikroflödessystem syntesen av copolymerizable oligo-microsphere och ssDNA förstärkning rapporterades. Mikroflödessystem plattformen består av två PDMS (Polydimetylsiloxan) lager: en övre del med en mikroflödessystem channel-nätverk för att generera microsphere och en botten platta delen. Dessa består av tre typer av PDMS fluidic kanaler: 1) ett flöde med fokus kanal för droplet generation, 2) en serpentin kanal för att blanda två lösningar och 3) en sekventiell polymerisation kanal för microsphere stel. När två icke blandbara flöden införs i en enda PDMS fluidic kanal, kan flöden tvingas genom smala öppning strukturen. Flöde beteenden såsom kanal geometri, flöde och viskositet påverka storlek och morfologi av microsphere. Den största flytande strömmen kan därför delas in i hur provtagningsutrustningen skall monospheres9,10.
Här ges en detaljerad microsphere-PCR-protokoll för förstärkning av ssDNA. Först beskrivs en droplet-baserade mikroflödessystem enhet designprocess. Sedan, på sätt i vilken polyakrylamid mikrosfärer kan vara functionalized med slumpmässiga DNA mall på ett kompletterande sätt förklaras. Slutligen visas ett microsphere-PCR-protokoll för förstärkande ssDNA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>liquid polydimethylsiloxane, PDMS</td>
			<td>Dow Corning Inc.</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Components of chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide:bis solution (19:1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td>Components of Copolymerizable oligo-microsphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate, APS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Hardener of acrylamide:bis solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine, TEMED</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Catalyst of ammonium persulfate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td>Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>synthesized</td>
			<td>Table 3. Sequence information&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA acrydite labeled probe</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>synthesized</td>
			<td>Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>&#160;T1016</td>
			<td>Components of TE buffer, pH buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex taq</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR001A</td>
			<td>ssDNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>eclipse 80i</td>
			<td>Caculating number of microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>ssDNA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held Corona Treater</td>
			<td>Electro-Technic</td>
			<td>BD-20AC Laboratory Corona Treater</td>
			<td>Hydrophilic surface treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>As one</td>
			<td>HI-1000</td>
			<td>heating plate for curing of liquid PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>kd Scientific</td>
			<td>78-1100</td>
			<td>Uniform flow of Solution I and Solution II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressor</td>
			<td>Kohands</td>
			<td>KC-250A</td>
			<td>Flow control of Solution III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Caculating number of microspheres</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a droplet-based microfluidic approach and microsphere-pcr amplification for single-stranded dna amplicons

Droplet-baserade mikrofluidik möjliggör tillförlitlig produktion av homogena mikrosfärer i ultrakalla kanalen, som ger kontrollerad storlek och morfologi av den erhållna microsphere. Ett microsphere copolymerized med en acrydite-DNA sond var framgångsrikt fabricerade. Olika metoder såsom asymmetrisk PCR, exonuclease matsmältning och isolering på streptividin-belagda magnetiska pärlor kan användas att syntetisera enkelsträngat DNA (ssDNA). Men kan inte dessa metoder effektivt använda stora mängder högrenade ssDNA. Här beskriver vi ett microsphere-PCR-protokoll som beskriver hur ssDNA kan effektivt förstärks och separerade från dsDNA genom pipettering från en PCR-reaktion tube. Förstärkning av ssDNA kan tillämpas som potentiella reagens för DNA microarray och DNA-SELEX (systematisk utveckling av ligander av exponentiell anrikning) processer.

Fabricerade polymera droplet-baserade mikroflödessystem plattformen består av två PDMS lager (figur 1a). Tre sorters mikroflödessystem kanal nätverk används för att generera mikrosfärer: 1) flöde-fokus geometri som visas i figur 1boch 2) en serpentin kanal för att blanda lösningen jag och lösning II (3) en polymerisation kanal för microsphere solidifiering. Höjden på alla kanaler var 60 μm. Kanal längd för bland...

Watch this Scientific Journal Video about A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons at JoVE.com

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Detta arbete ger en metod för tillverkning av droplet-baserade mikroflödessystem plattformar och tillämpningen av polyakrylamid mikrosfärer för microsphere-PCR amplifiering. Microsphere-PCR-metoden gör det möjligt att erhålla enkelsträngat DNA amplikoner utan att separera dubbelsträngat DNA.

En Droplet-baserade mikroflödessystem strategi och Microsphere-PCR-amplifiering för enkelsträngat DNA amplikoner

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i det mikrofluidiska systemets kombinatoriska teknik och det molekylära bioteknikområdet, såsom mikrofluidiska enheter och asymmetri-PCR-metod. De främsta fördelarna med denna teknik är effektiv generering av mycket homogeniserade mikrosfärer och produktion av enkelsträngat DNA utan några ytterligare separationssteg. Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot diagnos eller terapi av olika sjukdomar.Eftersom generering av ensträngs-DNA är nyckeln till ap-ta-mo-sis-analyser kan den användas för detektion och behandling. Även om denna metod kan ge insikt i tredimensionella mikrofluidiska system i MEMS, kan det också tillämpas på andra system som används för upptäckt och behandling av sjukdom. Generellt, individer nya till denna metod kommer att kämpa för att korrekt kontrollera vätskor från att flöda i den omvända riktningen.Visuell demonstration av denna metod är avgörande för att observera mikrosfärbildningen i flödes-fokuseringsgeometrin och solidifiering av genererade mikrosfärer. Först förbereda 20 milliliter flytande PDMS pre-polymer genom att blanda bas polymer och katalysator i en 10-till-ett förhållande. Häll 10 milliliter av vätskan PDMS på en beredd SU-8 mögel på en kisel wafer för den övre delen av det mikrofluidiska nätverket.För botten platt del, häll samma volym av flytande PDMS på kisel wafer utan en mögelstruktur. Placera två kiselplattor belagda med flytande PDMS-förpolymer på en förvärmd värmeplatta och bota vid 75 grader Celsius i 30 minuter. Efter detta, manuellt skala bort härdad PDMS lager från SU-8 mögel.Rikta in ett 1,5 millimeters diameter runt hålstansverktyg till oljeporten på det replikerade mikrofluidiska nätverket för interfacing mikron-skala flödeskanaler med makro-fluid prover. Sedan manuellt stansa ut genom-hålet. Efter att ha upprepat stansningsprocessen tre gånger, utför hydrofil ytbehandling på både de övre och nedre PDMS-lagren med hjälp av en handhållen koronabehandlare i flera sekunder per prov.Stapla två plasmabehandlade PDMS-lager och värme vid 90 grader Celsius i 30 minuter på en värmeplatta för PDMS-till-PDMS-bindningsprocessen. Vortex och kort centrifugera en standard enkelsträngad DNA-akrylat-märkt sond och en 19-till-en akrylamid bis stamlösning. Bered lösning ett genom att blanda 25 mikroliter av 40%akrylamid bis lösning, 10 mikroliter av enkelsträngat DNA, 10 mikroliter av 5X TBE buffert, och fem mikroliter vatten.Bered lösning två med 50 mikroliter på 20%ammoniumpersulfat. Förbered två sprutor individuellt fyllda med lösning ett och lösning två och montera dem på sprutpumpen för att införa lösningsflöden i den mikrofluidiska plattformen. Förbered mineralolja blandad med 0,4%TEMED för ytsnjutifiering av mikrosfären.Efter att ha fyllt en glasflaska med mineraloljan, sätt två rör till pneumatiska och vätskeportar i glasflaskans lock som en mikrofluidisk reservoar. Anslut rör mellan glasflaskan och oljeporten i den mikrofluidiska enheten. Anslut rören till de två lösningsportarna i den mikrofluidiska enheten för att kunna försörja de två lösningarna från sprutpumparna.Sätt sedan in rören i uttagsporten för att kunna överföra den genererade mikrosfären i bägaren. Därefter ställer du in flödeshastigheten för sprutpumpen på 0,4 till 0,7 milliliter per timme. Justera kompressorns tryckluftstryck med hjälp av en regulator.Placera en glasbägare med magnetröra bar på en kokplatta och ställ rotationshastigheten. Manövrera sprutpumpen och förse den tryckluft som genereras av en extern kompressor in i glasflaskan med hjälp av on-off-styrningen av en elektromagnetisk ventil. Med hjälp av ett digitalt mikroskop, observera bildandet av mikrosfärer i flödes-fokuseringsgeometri och solidifiering av genererade mikrosfärer i glasbägaren.Att observera bildandet av mikrosfärer är ett av de mest kritiska stegen eftersom det är en stor process i denna studie för att producera mikrosfärer och mikrofluidiskt system. Efter detta överför du 100 mikroliter av mikrosfärerna till ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör. Ta sedan bort supernatanten genom skonsam centrifugering och pipettering.Resuspend den kostnadsfria sond-modifierade cyanin-3 med 100 mikroliter av 1X TE buffert för att uppnå en slutlig koncentration av 100 mikromolar. Därefter lägger 100 mikromolar av kompletterande sond-modifierade cyanin-3 till en steril 1,5 milliliter mikro-centrifugrör som innehåller AP-copolymeriserade mikrosfärer. Tryck på tuben några gånger för att blanda och inkubera i rumstemperatur i mörker i en timme.Efter inkubation, kassera supernatanten och avlägsna restbufferten genom pipettering. Skölj sedan tre gånger med 500 mikroliter TE-buffert. Placera mikrosfärerna på en 75-by-50 millimeter glasrutschkana och täck med aluminiumfolie före avbildning.Erhåll cirka 25 mikrosfärer genom mikroskopisk räkning med hjälp av ett ljusmikroskop med 40X förstoring. Efter detta kombinerar du alla reagenser enligt beskrivningen i textprotokollet. Placera proverna i en termocyklare och starta den asymmetriska PCR under lämpliga förhållanden.Insamlingen av en supernatant efter asymmetrisk PCR är ett av de mest kritiska steg eftersom det är en viktig process för att generera ensträngs-DNA med mikrosfär. Efter förstärkning, tillsätt åtta mikroliter av 6X lastning buffert till varje prov. Ladda 15 mikroliter av varje prov i 2%agarosgel.Utför sedan elektrofores vid 100 volt under 35 minuter i 1X TAE-buffert. Placera de hybridiserade mikrosfärerna i en hållare och fäst hållaren på ett konfokalmikroskops stadium. Välj lasern och slå på den i laserkontrollen.Välj objektivet i mikroskopkontrollen. Välj sedan önskat filter för cyanin-3 och kanal i konfigurationskontrollen. Slutligen starta experimentet och observera provet.Den tillverkade polymera droppbaserade mikrofluidiska plattformen består av två PDMS-lager. Tre sorters mikrofluidiska kanalnätverk används för att generera mikrosfärer, som är flödes-fokuseringsgeometri, en serpentinkanal för blandning av lösningar ett och två, och en polymerisationskanal för mikrosfärens stelning. Ett labbaserat pneumatiskt styrsystem för kontinuerligt flöde av mineraloljan och två sprutpumpar för lösningsflödet användes för att generera mikrosfärer i mikrofluidic-plattformen.Om mikrosfärerna är korrekt funktionaliserade med fem-prime akrylt DNA-sonden, bör de resultera i täckning av fluorescerande aktivitet på ytan under hybridisering experiment som visas i dessa fluorescerande bilder. Om copolymerisering inte sker korrekt, skulle den optiska mikrosfärbilden uppvisa inre kontaminering inuti mikrosfärerna. Att manipulera mikrosfärernas 3D-yta med en DNA-oligo-sond är en mycket snabbare process och en mikrosfärsyntesplattform på flöde kan ge ett verktyg för enkelsträngad DNA-förstärkning och rening.Den initialt copolymerized fem-prime AP ger en tre-prime hydroxyl slutet för DNA-polymerisation efter glödgning till dess kompletterande mall. Dubbelsträngade DNA-föroreningar observerades i det asymmetriska PCR-experimentet. Den resulterande enkelsträngade DNA ackumuleras från microsphere PCR visades genom jämförelse med den syntetiska storlek markörer genom gel elektrofores analys.Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att förkunskaper om protokoll och justeringar som är allmänt nödvändiga för att optimera PCR experiment krävs för att erhålla förstärkningscykeln, glödgning temperatur och sond sekvens i denna metod. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom diagnos och terapi till att koppla samman två regioner inom molekylär bioteknik och biomedicin. Glöm inte att arbeta med akrylamid lösning kan vara farligt och försiktighetsåtgärder såsom att bära handskar och labbrockar bör alltid vidtas när du utför denna procedur.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

En mikroflödessystem-baserad Hydrodynamisk fälla för enstaka partiklar

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Mikroflödessystem Blandare för att studera protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

En mikroflödessystem enheten för att studera flera olika stammar

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Hud tatueringar som ett nytt sätt för DNA-vaccin Leverans

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Mikrofluidisk tillverkning av polymera och biohybridfibrer med fördesignad storlek och form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

En mikroflödesbaserad Elektro Biochip för Label-fritt DNA hybridisering Analys

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

En mikroflödes Chip för ICPMS Sample Introduktion

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En mikroflödessystem plattform för hög genomströmning Single-cell isolering och kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-steg varierande höjd Fotolitografi för Ventilförsedda Multilayer Mikrofluidikanordningar

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikroflödes Plattform med Multiplex elektronisk detektering för rumslig Spårning av partiklar

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...