Name: preparing developing peripheral olfactory tissue for molecular and immunohistochemical analysis in drosophila
Uploaded: 2018-06-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila at JoVE.com

이 연구는 즐겼다 C. 볼 칸 (뎁-1457690)에 국립 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

다음 프로토콜은 듀크 대학 연구 윤리 위원회에 의해 설립 된 윤리 지침과 일치.
1. 조직 준비와 초파리 melanogaster 번데기의 개발 준비
<ol><li>첫째, 얼마나 많은 파리 해 부 할 것입니다 확인 합니다. RT-PCR 및 RNAseq, prepupal, 8 h APF, 40 h APF, 및 성인 단계에서 필요한는 개인에서 100-200 더듬이 디스크와 안테나를 수집 합니다. Immunohistochemistry, 10-20 개인을 해 부.</li>
	<li>해 부 ?...

<ol>
	<li>Barish, S., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+olfactory+receptor+neuron+specification+in+Drosophila.">Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).</li><li>Pan, J. W., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+development+and+evolution+of+the+insect+olfactory+system.">Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system.</a> Cell and Developmental Biology. 2, 130 (2013).</li><li>Ramdya, P., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+olfactory+systems+on+the+fly.">Evolving olfactory systems on the fly.</a> Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).</li><li>Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience:+a+history+lesson+for+the+future.">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li><li>Knecht, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+combinations+of+variant+ionotropic+glutamate+receptors+mediate+thermosensation+and+hygrosensation+in+Drosophila.">Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila.</a> eLife. 5, 44-60 (2016).</li><li>Enjin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+sensing+in+Drosophila.">Humidity sensing in Drosophila.</a> Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).</li><li>Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+endogenous+rotund+expression+and+function+in+developing+Drosophila.+olfactory+system+using+CRISPR-Cas9-mediated+protein+tagging.">Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).</li><li>Hueston, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modulatory+proteins+and+olfactory+receptor+signaling+in+the+refinement+and+maintenance+of+fruitless+expression+in+olfactory+receptor+neurons.">Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons.</a> PLoS Biology. 14 (4), 1002443 (2016).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+rules+of+precursor+specification+underlying+olfactory+neuron+diversity.">Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity.</a> Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+conserved+gene+regulatory+network+module+governing+olfactory+neuron+diversity.">A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity.</a> PLoS Genetics. 12 (1), 1005780 (2016).</li><li>Pan, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+transcriptional+parallelism+and+variation+in+the+developing+olfactory+system+of+Drosophila+species.">Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8804 (2017).</li><li>Pan, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+behavioral+and+transcriptional+variation+underlying+CO2+sensory+neuron+function+and+development+in+Drosophila.">Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila.</a> Fly. 11 (4), 239-252 (2017).</li><li>Stern, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transgenic+reagents+for+Drosophila+simulans,+D.+mauritiana,+D.+yakuba,+D.+santomea,+and+D.+virilis.">Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).</li></ol>

이 프로토콜은 실험실 초파리 에 걸쳐이 프로그램의 비교 분석으로 초파리 의 후 각 조직 개발에서 유전과 transcriptional 프로그램을 식별 하는 데 관심이 대 한 유용한 리소스 종입니다. 다른 발달 단계에서 시스템 수준 transcriptional 프로필 미래 연구를 위한 뇌관으로 필요한 경우 특히 유용 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 단계 및 개발에 사용 될 터미널 차별화를 모방 하는 사전에서...

발달 신경 생물학, 시스템 신경 과학으로 신경 생리학, 행동 연구, 그리고 행동 진화1,2,3, 초파리 의 후 각 시스템은 널리 사용 되는 시스템 4. 초파리 의 후 각 조직 집 수압 및 온도 감각 신경1,,56외 휘발성 화학 신호를 감지 하는 후 각 수용 체 신경 (ORNs). 이 원고의 전반적인 목표는 무대 초파리 종의 번데기 및 성인 후 각 조직 개발 해 부 하는 방법을 보여 줍니다. 이 기술에 대 한 근거 또한 vivo에서 조직 기술 라벨 샘플 RNAseq 등 정량적 RT-PCR, 주변 후 각 시스템의 분자 및 발달 분석에 대 한 다른 번데기 단계에서 생성 하는 . 이 기술은 특정 세포 유형에 대 한 모든 유전자 변형 시 약 하지 않은 비-초파리 melanogaster 종 개발 성인 후 각 시스템에 transcriptional 프로필의 역학을 식별 하기 위해 특히 유용할 수 있습니다. 표시 하 고 분석입니다. 이 원고, 더듬이 디스크와 번데기 및 성인 초파리 종에서 안테나를 해 부하는 방법을 보여 줍니다. 첫째, 우리 개발 준비 및 종의 노화에 대 한 puparium 형성 (APF, 흰색 pupae 또는 prepupae)의 0 h 초파리 를 식별 하는 방법을 보여 줍니다. 다음, 우리에 게 보여 더듬이 디스크와 제 3 더듬이 세그먼트; 해 부 특히, 눈 디스크 및 RNAseq 또는 RT PCRs에 필요한 조직 순도 대 한 두 번째 더듬이 세그먼트에서 그들을 분리 하는 방법. 미리 무늬 더듬이 디스크 (prepupae)에 해당 하는 단계 D. melanogaster 약이 프로토콜에서 설명에서 일어나는 더듬이에서 선택 디스크 (8 h APF), ORNs (40 h APF)에 대 한 터미널 차별화의 시작 하 고 성인 안테나입니다. 마지막으로, 우리 성인 안테나 메서드를 사용 하 여 고립에서 그리고 vivo에서 immunohistochemistry 양적 RT-PCR에 대 한 예제는 줄. 이 메서드는 RNA/DNA 분석 및 immunohistochemistry 초파리 종에서 주변 후 각 조직 개발에 대 한 샘플을 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1180px;" width="1180">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">10X Phosphate-buffered Saline</td>
			<td style="width:236px;">Gibco</td>
			<td style="width:241px;">70011-044</td>
			<td style="width:432px;">Dilute to 1X in RNase free water</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CO2 tank</td>
			<td>Air Gas</td>
			<td>CD R200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two sharp forceps (Dumont #55)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td>RNA isolation solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small bucket with ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P20 and P200 micropipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.7 mL Microfuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchase nuclease free for best results</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 mL PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Triton X-100</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T1105</td>
			<td>Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2&#34; petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">55mm filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td>Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 C incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">deionized H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchase nuclease free or treat with DEPC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroWell Mini Trays with lids</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>438733</td>
			<td>Lids can be used to make silicone dissection pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>MBL international corpor</td>
			<td>PM005</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti RAT CD2</td>
			<td>AbD seroTec</td>
			<td>MCA154RHDL</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ADL195 (anti lamin, mouse)</td>
			<td>Dev studies hydoma ban</td>
			<td>ADL195-s</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor&#174; 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-166-003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td>
			<td>CALBIOCHEM</td>
			<td>648463</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lab Rotator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease Free Water</td>
			<td>Growcells.com</td>
			<td>NUPW-0125</td>
			<td>Water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82003-822</td>
			<td>For cleaning dissection supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superscript II</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td>Reverse Transcriptase&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAshredder (50)</td>
			<td>RNA extraction</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79654</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oligo(dT)12-18 Primer</td>
			<td>RT</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>18418012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)</td>
			<td>RNA extraction</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74204</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04913850001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER&#160;</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>Roche</td>
			<td>06402712001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729692001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0541S</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing developing peripheral olfactory tissue for molecular and immunohistochemical analysis in drosophila

초파리 의 후 각 시스템 발달 신경 생물학, 시스템 신경 과학으로 신경 생리학, 행동과 행동 진화에 널리 사용 되는 시스템이입니다. 초파리 의 후 각 조직 집 수압 및 온도 감각 신경 이외에 휘발성 화학 신호를 감지 하는 후 각 수용 체 신경 (ORNs). 이 프로토콜에서 우리는 성인 초파리 종의 주변 후 각 조직 개발의 해 부를 설명 합니다. 우리는 처음 무대 초파리 애벌레, 중순에 번데기 단계와 성인에서 안테나의 해 부에 의해 따라 초기 번데기 단계에서 더듬이 디스크의 해 부를 이어서 나이 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 또한 어디 준비 qRT-PCR, RNAseq, 또는 immunohistochemistry RNA 추출 등 분자 기법에 활용할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 적용할 수 있습니다 또한 다른 초파리 종 종의 번데기 개발 시간, 결정 하 고 각 단계는 적절 한 노화에 대 한 계산 됩니다.

해 부 개발 후 각 조직의 RNA 추출 뒤에 RT-PCR 유전자 발현을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또는 immunohistochemistry 프로토콜을 통해 식이 패턴, 그리고 하위 세포질 유전자의 지역화를 확인 하기 위해 취할 수 있습니다. 관심입니다. 이 섹션에서 우리는 어느 프로토콜에서 대표적인 결과 제시. 그림 1 은 대표적인 양적 RT-PCR 야생-타입 성인 안테나에...

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Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

여기, 우리는 무대와 초파리 종에서 후 각 조직 개발 해 부 프로토콜을 제시. 있으 나 해 부 조직 immunohistochemistry 또는 제자리에서 같은 비보에 분석 뿐만 아니라 양적 RT-PCR (반전 전사-연쇄 반응) 또는 시퀀싱 (RNAseq), RNA와 같은 분자 분석에 대 한 나중에 사용할 수 있습니다. 교 잡입니다.

주변 후 각 조직에 대 한 개발 준비 분자와 초파리 의 Immunohistochemical 분석

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

대사 분석을위한 미토콘드리아 농축 분획의 제조<em&gt; 초파리</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

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게놈을 편집 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 효율적인 전략

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

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배양 된 초파리 계란 챔버의 시간 경과 영화를 사용하여 로컬 세포 및 조직 저울에서 Actomyosin 역학분석

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

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녹고, 경작, 그리고 초파리 셀 라인 Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

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푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...