Name: split green fluorescent protein system to visualize effectors delivered from bacteria during infection
Uploaded: 2018-05-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection at JoVE.com

هذا البحث كان يدعمها "برنامج بحوث العلوم الأساسية" عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تمول وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (جبهة الخلاص الوطني-2018R1A2A1A05019892) إلى العاصمة ومن منحة مقدمة من مركز تربية الجزيئية النباتية ( بمبك) للبرنامج 21 Biogreen الجيل القادم من "إدارة التنمية الريفية" (PJ013201) إلى الجيش الشعبي. ونشكر مركز التصوير من المركز الوطني للقياس "الإدارة البيئية" لتوفير مجهر [كنفوكل] لتصوير فيلم.

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في درجة حرارة الغرفة، ما لم ينص على خلاف ذلك.
1-إعداد المواد النباتية (4 أسابيع)
<ol><li>إعداد للنباتات بينثاميانا أ.<ol>
<li>بذر بذور بينثاميانا أ 2 على سطح التربة من كل وعاء وتغطي صينية بقبة بلاستيكية وتسمح للبذور على الإنبات في 25 درجة مئوية ...

<ol>
	<li>Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+stomata+in+plant+innate+immunity+and+foliar+bacterial+diseases.">Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases.</a> Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126 (5), 969-980 (2006).</li><li>Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-Pathogen+Effectors:+Cellular+Probes+Interfering+with+Plant+Defenses+in+Spatial+and+Temporal+Manners.">Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners.</a> Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).</li><li>Buttner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behind+the+lines-actions+of+bacterial+type+III+effector+proteins+in+plant+cells.">Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells.</a> FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).</li><li>Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Yersinia+type+III+secretion+system:+traffic+control.">Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control.</a> Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).</li><li>Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hrpC+and+hrpRS+operons+of+Pseudomonas+syringae+pathovars+syringae,+tomato,+and+glycinea+and+analysis+of+the+ability+of+hrpF,+hrpG,+hrcC,+hrpT,+and+hrpV+mutants+to+elicit+the+hypersensitive+response+and+disease+in+plants.">Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants.</a> J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).</li><li>Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+targeting+of+plant+cellular+systems+by+injected+type+III+effector+proteins.">The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).</li><li>Alfano, J. R., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+secretion+system+effector+proteins:+double+agents+in+bacterial+disease+and+plant+defense.">Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense.</a> Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).</li><li>Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Localization+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+Effector+Proteins+in+Plants.">Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants.</a> Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).</li><li>Kay, S., Bonas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Xanthomonas+type+III+effectors+manipulate+the+host+plant.">How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant.</a> Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).</li><li>Bassham, D. C., Raikhel, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cells+are+not+just+green+yeast.">Plant cells are not just green yeast.</a> Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).</li><li>Courbot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+quantitative+trait+locus+for+cadmium+tolerance+in+Arabidopsis+halleri+colocalizes+with+HMA4,+a+gene+encoding+a+heavy+metal+ATPase.">A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase.</a> Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).</li><li>Geisler, M., Murphy, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+of+auxin+transport:+the+role+of+p-glycoproteins+in+plant+development.">The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development.</a> FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).</li><li>Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+SifA+effector+protein+requires+its+membrane-anchoring+C-terminal+hexapeptide+for+its+biological+function.">Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function.</a> J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).</li><li>Reinicke, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Salmonella+typhimurium+effector+protein+SifA+is+modified+by+host+cell+prenylation+and+S-acylation+machinery.">A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery.</a> J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).</li><li>Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversification+of+a+Salmonella+virulence+protein+function+by+ubiquitin-dependent+differential+localization.">Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization.</a> Cell. 137 (2), 283-294 (2009).</li><li>Fernandez-Alvarez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+O-mannosylated+virulence+factors+in+Ustilago+maydis.">Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002563 (2012).</li><li>Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+themes+in+the+design+and+function+of+bacterial+effectors.">Common themes in the design and function of bacterial effectors.</a> Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).</li><li>Rig&#243;, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cs&#233;pl&#244;, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+protoplasts+as+useful+experimental+tool+to+study+localization+of+GFP-tagged+proteins+in+Arabidopsis+thaliana.">Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana.</a> Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59 (2008).</li><li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tagging+and+detection+with+engineered+self-assembling+fragments+of+green+fluorescent+protein.">Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).</li><li>Cabantous, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protein-protein+interaction+sensor+based+on+tripartite+split-GFP+association.">A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association.</a> Sci Rep. 3, 2854 (2013).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein.">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nat Commun. 7, 11046 (2016).</li><li>Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+type-III+secretion+reveals+dynamics+and+spatial+segregation+of+Salmonella+effectors.">Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors.</a> Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).</li><li>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Monitoring+of+Pseudomonas+syringae+Effectors+via+Type+III+Secretion+Using+Split+Fluorescent+Protein+Fragments.">Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments.</a> Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).</li><li>. Addgene Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org">https://www.addgene.org</a> (2018)</li><li>. Arabidopsis Biological Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://abrc.osu.edu">https://abrc.osu.edu</a> (2018)</li><li>Kvitko, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+in+the+repertoire+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+type+III+secretion+effector+genes+reveal+functional+overlap+among+effectors.">Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000388 (2009).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li><li>Kovach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+new+derivatives+of+the+broad-host-range+cloning+vector+pBBR1MCS,+carrying+different+antibiotic-resistance+cassettes.">Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.</a> Gene. 166 (1), 175-176 (1995).</li><li>Upadhyaya, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+type+III+secretion+assay+for+delivery+of+fungal+effector+proteins+into+wheat.">A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat.</a> Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+agrobacterium+using+the+freeze-thaw+method.">Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method.</a> CSH Protoc. 2006 (7), (2006).</li><li>Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana+RPM1+disease+resistance+gene+product+is+a+peripheral+plasma+membrane+protein+that+is+degraded+coincident+with+the+hypersensitive+response.">The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).</li><li>Nimchuk, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+fatty+acylation+drives+plasma+membrane+targeting+and+enhances+function+of+several+type+III+effector+proteins+from+Pseudomonas+syringae.">Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae.</a> Cell. 101 (4), 353-363 (2000).</li><li>Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+intracellular+innate+immune+receptor+Resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+maculicola+1+(RPM1)+is+activated+at,+and+functions+on,+the+plasma+membrane.">Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).</li><li>Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scalable+strategy+for+high-throughput+GFP+tagging+of+endogenous+human+proteins.">A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).</li><li>Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+Agrobacterium-delivered+VirE2+in+recipient+cells.">Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells.</a> Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+approaches+to+investigate+effector+translocation+into+host+cells+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).</li></ol>

يستخدم بروتوكول الموصوفة هنا لرصد الترجمة دقيقة من البروتينات المستجيب حقن الخلايا النباتية المضيف عند الإصابة بواسطة T3SS البكتيرية. سابقا، استخدم نظام التجارة والنقل الانقسام كأداة لدراسة الترجمة سوبسيلولار للبروتينات الثدييات23،36، والتعريب T3E السالم...

النباتات هي الكائنات الحية لاطئة التي تواجهها العديد من مسببات الأمراض الغازية بما في ذلك البكتيريا، والفطريات، والفيروسات والحشرات والديدان الخيطية طوال دورة حياتها. بين فيتوباثوجينس، تصيب الغرام مسببات الأمراض البكتيرية مثل Pseudomonas spp. ورالستونيا spp.، مصانعها المضيف عن طريق إدخال عن طريق الجروح أو الفتحات الطبيعية، مثل الثغور وهيداثودي1. لاستعمار النباتات المضيفة بنجاح، وقد تطورت مسببات الأمراض البكتيرية تطوير مجموعة متنوعة من عوامل الفوعة2. عندما تغزو البكتيريا نبات مضيف، أنها تضخ سلسلة من البروتينات الفوعة – المعروفة باسم المستجيبة — مباشرة في الخلايا النباتية لتعزيز تلك القدرة الإمراضية. قمع هذه المستجيبة أو تعدل الحصانة الفطرية النباتية، والتعامل مع العمليات الخلوية المضيف يؤدي إلى بقاء البكتيرية3.
أساسا استخدام البكتيريا المسببة للأمراض T3SS لتوصيل البروتينات المستجيب مباشرة إلى الخلايا المضيفة4. يشبه T3SS حقنه جزيئية مع إبرة مثل قناة الاتصال من هيكل بروتين سقالة عبر الأغشية البكتيرية الخارجية والداخلية للحقن من الخلية المضيفة5. إليه إفراز T3SS بوساطة المستجيب (T3E) هذا مصانة جيدا في مختلف مسببات الأمراض البكتيرية الغرام من المصنع، فضلا عن الإنسان. أحد مسببات الأمراض النباتية الممثل، P. syringae الكهروضوئية. الطماطم DC3000 المركز المسخ الذي عادة T3SS معيبة، قيدت نمو النباتات احتمالاً بسبب العجز هذا المسخ لقمع كامل الحصانة (عن طريق حقن بروتينات المستجيب) مصنع6. عند إزفاء إلى الخلايا المضيفة، تستهدف المستجيبة مختلف البروتينات المضيفة التي تعتبر مهمة لنظام الخلية المضيفة، بما في ذلك مصنع الدفاع الردود والنسخ الجيني وموت الخلية، بروتوزوم، والاتجار حويصلة وهرمون مسارات7 , 8 , 9 , 10-ولذلك، تتبع للتعريب الخلوية البروتينات المستجيب في الخلايا المضيفة هدفا جذاباً لفهم وظائفها فيما يتعلق بتعديل الحصانة النبات.
استخدمت معظم الدراسات الترجمة T3Es المتبعة-بوساطة overexpression مع بروتين الأسفار كبيرة في مصنع المضيف9. ومع ذلك، ثبت الأسلوب تعبير مغايرة للجينات التي يتم تقديمها في الأنواع الأخرى لتكون أحياناً غير وظيفية أو سوء مترجمة11،،من1213. وبالإضافة إلى ذلك، كشفت عدة دراسات أن المستجيبة البكتيرية الخضوع للتعديل لاستهداف السليم في المضيف الخلايا14،15،،من1617. ولذلك، أعرب عابر المستجيبة في سيتوسول مصنع الخلايا قد لا تكون متطابقة وظيفيا أو كمياً إلى المستجيبة التي يتم تسليمها من T3SS عند الممرض العدوى18. وعلاوة على ذلك، قد تعطل انصهار العلامات الفلورية كبيرة للبروتينات المستجيب المستجيب المناسب التسليم والتصور18،19. ولذلك، قد لا تعكس هذه النهج الاعتداء الدالة T3E التعريب الأصلي من المستجيبة يفرز T3SS تماما.
ويتألف من 11-الذين تقطعت بهم السبل β-البرميل أرفق حبلا مركزية التي تشمل chromophore20بروتين فلوري أخضر (التجارة والنقل). والدو et al. وأفادت نظام تقسيم رواية-التجارة والنقل التي تتكون من عنصر صغير (β بروتينات فلورية خضراء حبلا 11؛ GFP11) وجزء مكمل كبير (بروتينات فلورية خضراء حبلا β 1-10؛ GFP1-10)21. الشظايا لا فلوريس بحد ذاتها ولكن فلوريس على ارتباطهم الذاتي عندما تكون كل الأجزاء على مقربة من بعضها مع بعض. لتعظيم كفاءة قابلة للطي البروتين، وضعت متغيرات قابلة للطي قوية التجارة والنقل، أي، سفجفب، وسفجفبالأراضي الفلسطينية المحتلة، في وقت لاحق لتقسيم بروتينات فلورية خضراء نظام20،،من2122. في الآونة الأخيرة، واحد من الأحماض الأمينية تحور المتغيرات من sfGFP1-10الأرض الفلسطينية المحتلة-sfYFP1-10الأراضي الفلسطينية المحتلة و sfCFP1-10الأرض الفلسطينية المحتلة-التي يمكن إعادة تشكيل مع بلغة sfGFP11، وإظهار fluorescence السماوي والأصفر على التوالي، والذي تم إنشاؤه23 . وعلاوة على ذلك، يمكن تقسيم سفتشيري، مشتق مشري، إلى شظايا sfCherry1 10 و sfCherry11 بنفس الطريقة سفجفب23.
هذا النظام قد تم تكييفه لوسم وتعقب المستجيبة T3SS في خلايا هيلا أثناء الإصابة باستخدام المستجيبة من السالمونيلا24. بيد أنه كان سابقا لا الأمثل لنظام المضيف الممرض النبات الجرثومي. في الآونة الأخيرة، ونحن الأمثل نظام التجارة والنقل انقسام استناداً إلى sfGFP1-10 تحسينالأراضي الفلسطينية المحتلة لمراقبة توطين T3Es سلمت من P. syringae داخل الخلايا النباتية25سوبسيلولار. تيسيرا لدراسات الترجمة T3Es إلى الأقسام المختلفة سوبسيلولار في الخلايا النباتية، ومجموعة من المعدلة وراثيا التمويل نبات نباتات تم إنشاؤها للتعبير عنالأراضي الفلسطينية المحتلة في المقصورات المختلفة سوبسيلولار sfGFP1-10 25. وعلاوة على ذلك، والبلازميدات تحمل مجموعة متنوعة من عضية-استهدفت sfGFP1 10الأراضي الفلسطينية المحتلة المتبعة-كما تم إنشاؤها بوساطة overexpression عابرة وناقلات معلم sfGFP11 لإيصال المستجيب على أساس T3SS. يمكن الحصول على بذور مختلف خطوط نبات المعدلة وراثيا ووالبلازميدات للتعبير عن T3Es الفائدة من المصادر المذكورة في الجدول للمواد26،27.
في بروتوكول التالية، ويصف لنا نظام محسن لرصد ديناميات المستجيبة ألقاه البكتيريا في الخلايا المضيفة باستخدام نظام سفجفب سبليت. عدوى نباتات معربا عن sfGFP1 10الأراضي الفلسطينية المحتلة مع المعدلة وراثيا Pseudomonas يحمل بلازميد المؤتلف sfGFP11 النتائج في عملية تسليم للمستجيب معلم sfGFP11 من Pseudomonas في الخلية المضيفة. ونتيجة لذلك، هذه البروتينات يتم تشكيلها وترانسلوكاتي إلى compartment(s) مستهدفة محددة المستجيب. Pseudomonas syringae الكهروضوئية. الطماطم سلالة CUCPB5500 التي يتم حذف 18 المستجيبة، واستخدمت لأنه أظهر هذه السلالة منخفضة أو لا موت الخلية في التمويل أ و بينثاميانا أق28. ومع ذلك، كافة المواد والخطوات الموضحة هنا يمكن استبدال أو تعديلها لتكييف منظومة سفجفب سبليت للتحقيق من الأسئلة البيولوجية أو التحسين في الظروف المختبرية معينة أخرى.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidopsis transgenic lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &#38; Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYTO-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NU-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PT-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MT-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &#38; Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYTO-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NU-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PT-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MT-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-sfCherry1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-sfYFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYTO-sfCFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system</td>
			<td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &#38; Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBK-GW-1-2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98250</td>
			<td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBK-GW-1-4</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98251</td>
			<td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBK-GW-2-2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98252</td>
			<td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBK-GW-2-4</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98253</td>
			<td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBG-GW-1-2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98254</td>
			<td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBG-GW-1-4</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98255</td>
			<td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBG-GW-2-2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98256</td>
			<td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBG-GW-2-4</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98257</td>
			<td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens GV3101</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant germination media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 2.165g/L Murashige &#38; Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium including vitamins</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0222</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave.&#160; Allow solution to cool to 55 &#176;C, and add antibiotic if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro agar</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>King&#39;s B media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 &#176;C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1551128 USP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G1345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol-Glutamate (MG) liquid media </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G0707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NIST200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infiltration buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 &#181;M acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1503</td>
			<td>Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Prepare 150 mM stock in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope equipments/materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>710 laser scanning confocal system</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio observer Z1 inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

split green fluorescent protein system to visualize effectors delivered from bacteria during infection

تفرز البكتيريا، واحدة من أهم وكلاء المسببة للأمراض النباتية المختلفة، مجموعة من البروتينات المستجيب في الخلية النباتية المضيف لتخريب مصنع الجهاز المناعي. أثناء الإصابة بتسليم هيولى المستجيبة إلى سيتوسول المضيف عن طريق نوع نظام إفراز الثالث (T3SS). بعد الولادة في الخلية النباتية، يستهدف effector(s) compartment(s) محددة لتعديل عمليات الخلية المضيفة للبقاء على قيد الحياة والنسخ المتماثل لمسببات المرض. على الرغم من أن هناك بعض الأبحاث في التعريب سوبسيلولار المستجيب البروتينات في الخلايا المضيفة لفهم وظيفتها في القدرة الإمراضية باستخدام البروتينات الفلورية، التحقيق في ديناميات المستجيبة حقن مباشرة من البكتيريا وقد تم الطعن نظراً لعدم التوافق بين T3SS والبروتينات الفلورية.
هنا، يمكننا وصف أسلوبنا الأخيرة سوبيرفولدير الأمثل تقسيم نظام البروتينات الفلورية الخضراء (سفجفبالأراضي الفلسطينية المحتلة) لتصور توطين المستجيبة تسليمها عبر T3SS البكتيرية في الخلية المضيفة. SfGFP11 (11th β-حبلا من سفجفب)-يمكن تجميع كلمات المستجيب ويفرز عن طريق T3SS مع بادئة (1-10ال β-حبلا من سفجفب) عضية محددة تستهدفالأراضي الفلسطينية المحتلة sfGFP1-10 للانبعاثات fluorescence في الموقع. يوفر هذا البروتوكول إجراء لتصور إشارة الأسفار المعاد تشكيلها سفجفب مع بروتين المستجيب من Pseudomonas syringae في عضية خاصة في النباتات نبات و بينثاميانا نيكوتيانا .

تتألف من أحد عشر بيتا خيوط بنية بيتا للبرميل للتجارة والنقل ويمكن تقسيمها إلى أجزاء اثنين وحبلاال 1-10 (GFP1-10الأراضي الفلسطينية المحتلة) وحبلاال (GFP11) 11. على الرغم من أن أيا من الشظايا اثنين الفلورسنت بأنفسهم، سفجفب الذاتي تجميعها يمكن أن تنبعث منها في الأس?...

Watch this Scientific Journal Video about Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection at JoVE.com

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

تقسيم نظام البروتينات الفلورية الخضراء لتصور المستجيبة التي سلمت من البكتيريا أثناء الإصابة

الفلورسنت النهج القائم على البروتين لرصد المستجيبة التي تفرزها البكتيريا داخل الخلايا المضيفة صعبة. وهذا بسبب عدم التوافق بين نظام إفراز النوع الثالث والبروتينات الفلورية. وهنا، يستخدم نظام تقسيم أمثل للتجارة والنقل سوبيرفولدير للتصور المستجيبة التي تفرزها البكتيريا داخل الخلية النباتية المضيف.

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

التمهيدي لقطة فرعي : استرجاع المستهدفة تسلسل الحمض النووي من مصادر المتدهورة بالديون

We present a method of targeted DNA sequence retrieval from DNA sources which are heavily degraded and contaminated with microbial DNA, as is typical of ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

انقسام اليوبيكويتين الخميرة يستند الغشاء الهجين ثنائي (الأسطورة) النظام : أداة قوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

نقص Pms2 ، ERCC1 ، Ku86 ، CcOI عيوب في الميدان خلال التقدم إلى سرطان القولون

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

المفرد جزيء التصوير النقل النووية

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

البكتيرية تسليم المستجيبات رني : Transkingdom رني

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

رصد اليوبيكويتين-proteasome نشاط في الخلايا الحية باستخدام Degron (DGN)-زعزعة استقرار الأخضر نيون البروتين البروتين مراسل (GFP) على أساس

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

تصور البكتيريا في نيماتودا باستخدام المجهر الفلورسنت

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey (Petromyzon marinus)

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus

وهناك طريقة جديدة لتوضيح تصور الصفراوية الكبد الصفراء خلال التحول في البحر الجلكى ( Petromyzon مارينوس)

Biliary atresia is a rare disease of infancy, with an estimated 1 in 15,000 frequency in the southeast United States, but more common in East Asian ...