Name: split green fluorescent protein system to visualize effectors delivered from bacteria during infection
Uploaded: 2018-05-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection at JoVE.com

Dit onderzoek werd gesteund door fundamentele wetenschap Research Program via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT en toekomstige Planning (NRF-2018R1A2A1A05019892) naar DC en door een subsidie van Plant Molecular Breeding Center) PMBC) van de volgende generatie Biogreen 21-programma van de landelijke ontwikkeling administratie (PJ013201) aan de EP. Wij danken het imaging center van het National Instrumentation Center for Environmental Management om een confocal microscoop voor het filmen.

Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld.
1. bereiding van plantaardige materialen (4 weken)
<ol><li>Voorbereiding voor het planten van de N. benthamiana<ol>
<li>2 zaaien van N. benthamiana op het bodemoppervlak van elke pot, bedek het dienblad met een kunststof koepel, en zaden ontkiemen in een 25 ° C, 60% vochtigheid groei kamer met een 16/8-h licht/donker fotoperiode cyclus toestaan.</li>
		<li>Na twee weken, uitzoeken en neg...

<ol>
	<li>Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+stomata+in+plant+innate+immunity+and+foliar+bacterial+diseases.">Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases.</a> Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126 (5), 969-980 (2006).</li><li>Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-Pathogen+Effectors:+Cellular+Probes+Interfering+with+Plant+Defenses+in+Spatial+and+Temporal+Manners.">Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners.</a> Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).</li><li>Buttner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behind+the+lines-actions+of+bacterial+type+III+effector+proteins+in+plant+cells.">Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells.</a> FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).</li><li>Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Yersinia+type+III+secretion+system:+traffic+control.">Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control.</a> Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).</li><li>Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hrpC+and+hrpRS+operons+of+Pseudomonas+syringae+pathovars+syringae,+tomato,+and+glycinea+and+analysis+of+the+ability+of+hrpF,+hrpG,+hrcC,+hrpT,+and+hrpV+mutants+to+elicit+the+hypersensitive+response+and+disease+in+plants.">Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants.</a> J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).</li><li>Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+targeting+of+plant+cellular+systems+by+injected+type+III+effector+proteins.">The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).</li><li>Alfano, J. R., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+secretion+system+effector+proteins:+double+agents+in+bacterial+disease+and+plant+defense.">Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense.</a> Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).</li><li>Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Localization+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+Effector+Proteins+in+Plants.">Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants.</a> Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).</li><li>Kay, S., Bonas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Xanthomonas+type+III+effectors+manipulate+the+host+plant.">How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant.</a> Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).</li><li>Bassham, D. C., Raikhel, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cells+are+not+just+green+yeast.">Plant cells are not just green yeast.</a> Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).</li><li>Courbot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+quantitative+trait+locus+for+cadmium+tolerance+in+Arabidopsis+halleri+colocalizes+with+HMA4,+a+gene+encoding+a+heavy+metal+ATPase.">A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase.</a> Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).</li><li>Geisler, M., Murphy, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+of+auxin+transport:+the+role+of+p-glycoproteins+in+plant+development.">The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development.</a> FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).</li><li>Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+SifA+effector+protein+requires+its+membrane-anchoring+C-terminal+hexapeptide+for+its+biological+function.">Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function.</a> J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).</li><li>Reinicke, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Salmonella+typhimurium+effector+protein+SifA+is+modified+by+host+cell+prenylation+and+S-acylation+machinery.">A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery.</a> J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).</li><li>Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversification+of+a+Salmonella+virulence+protein+function+by+ubiquitin-dependent+differential+localization.">Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization.</a> Cell. 137 (2), 283-294 (2009).</li><li>Fernandez-Alvarez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+O-mannosylated+virulence+factors+in+Ustilago+maydis.">Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002563 (2012).</li><li>Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+themes+in+the+design+and+function+of+bacterial+effectors.">Common themes in the design and function of bacterial effectors.</a> Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).</li><li>Rig&#243;, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cs&#233;pl&#244;, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+protoplasts+as+useful+experimental+tool+to+study+localization+of+GFP-tagged+proteins+in+Arabidopsis+thaliana.">Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana.</a> Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59 (2008).</li><li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tagging+and+detection+with+engineered+self-assembling+fragments+of+green+fluorescent+protein.">Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).</li><li>Cabantous, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protein-protein+interaction+sensor+based+on+tripartite+split-GFP+association.">A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association.</a> Sci Rep. 3, 2854 (2013).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein.">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nat Commun. 7, 11046 (2016).</li><li>Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+type-III+secretion+reveals+dynamics+and+spatial+segregation+of+Salmonella+effectors.">Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors.</a> Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).</li><li>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Monitoring+of+Pseudomonas+syringae+Effectors+via+Type+III+Secretion+Using+Split+Fluorescent+Protein+Fragments.">Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments.</a> Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).</li><li>. Addgene Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org">https://www.addgene.org</a> (2018)</li><li>. Arabidopsis Biological Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://abrc.osu.edu">https://abrc.osu.edu</a> (2018)</li><li>Kvitko, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+in+the+repertoire+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+type+III+secretion+effector+genes+reveal+functional+overlap+among+effectors.">Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000388 (2009).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li><li>Kovach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+new+derivatives+of+the+broad-host-range+cloning+vector+pBBR1MCS,+carrying+different+antibiotic-resistance+cassettes.">Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.</a> Gene. 166 (1), 175-176 (1995).</li><li>Upadhyaya, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+type+III+secretion+assay+for+delivery+of+fungal+effector+proteins+into+wheat.">A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat.</a> Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+agrobacterium+using+the+freeze-thaw+method.">Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method.</a> CSH Protoc. 2006 (7), (2006).</li><li>Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana+RPM1+disease+resistance+gene+product+is+a+peripheral+plasma+membrane+protein+that+is+degraded+coincident+with+the+hypersensitive+response.">The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).</li><li>Nimchuk, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+fatty+acylation+drives+plasma+membrane+targeting+and+enhances+function+of+several+type+III+effector+proteins+from+Pseudomonas+syringae.">Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae.</a> Cell. 101 (4), 353-363 (2000).</li><li>Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+intracellular+innate+immune+receptor+Resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+maculicola+1+(RPM1)+is+activated+at,+and+functions+on,+the+plasma+membrane.">Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).</li><li>Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scalable+strategy+for+high-throughput+GFP+tagging+of+endogenous+human+proteins.">A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).</li><li>Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+Agrobacterium-delivered+VirE2+in+recipient+cells.">Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells.</a> Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+approaches+to+investigate+effector+translocation+into+host+cells+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).</li></ol>

Het protocol hier beschreven wordt gebruikt voor het toezicht op de nauwkeurige lokalisatie van de eiwitten van de effector geïnjecteerd door de bacteriële T3SS in de gastheercel plant na infectie. Eerder, het split GFP systeem werd gebruikt als een instrument om te studeren de subcellular localisatie van zoogdieren eiwitten23,36, Salmonella T3E lokalisatie en Agrobacterium VirE2 bezorging via de T4SS in de plantaardige cellen<sup class="xref"...

Planten zijn sessiele organismen die talrijke invasie ziekteverwekkers zoals bacteriën, schimmels, virussen, insecten en nematoden gedurende hun hele levenscyclus optreden. Onder de planteziekteverwekkers, infecteren de gram-negatieve bacteriële pathogenen zoals Pseudomonas spp. en Ralstonia spp., hun waardplanten door te voeren door middel van wonden of natuurlijke openingen, zoals de stoma en de Waterporie1. Om met succes koloniseren gastheerplanten, zijn bacteriële pathogenen geëvolueerd om een verscheidenheid van virulentie factoren2. Wanneer bacteriën een waardplant binnenvallen, zij een reeks van virulentie eiwitten injecteren — bekend als effectoren — rechtstreeks in de plantencellen te bevorderen hun pathogeniteit. Deze effectoren onderdrukken of het moduleren van de plant aangeboren immuniteit en manipuleren van de host cellulaire processen om te leiden tot bacteriële survival3.
Pathogene bacteriën maken hoofdzakelijk gebruik van een T3SS om effector eiwitten leveren rechtstreeks in gastheer cellen4. De T3SS lijkt op een moleculaire injectiespuit met een naald-achtige kanaal verbinding maakt vanaf een steiger eiwitstructuur via de binnenste en de buitenste bacteriële membranen op de site van de injectie van de ontvangende cel5. Dit T3SS-gemedieerde effector (T3E) secretie mechanisme is zowel goed geconserveerde in verschillende gram-negatieve bacteriële pathogenen van de plant als menselijk. Één van de representatieve plant pathogenen, de P. syringae pv. Tomaat DC3000 hrcC mutant die heeft meestal een defecte T3SS, heeft de groei van planten die waarschijnlijk te wijten aan het onvermogen van deze mutant volledig onderdrukken de plant immuniteit (door het injecteren van effector eiwitten)6beperkt. Bij translocatie in de cellen van de gastheer richten effectoren verschillende host eiwitten die belangrijk voor het hostsysteem cel zijn, met inbegrip van plant verdediging reacties, gene transcriptie celdood, proteasoom, blaasje mensenhandel en hormoon trajecten7 , 8 , 9 , 10. Daarom, bijhouden van de cellulaire lokalisatie van de effector eiwitten in de cellen van de gastheer is een aantrekkelijk doelwit te begrijpen hun taken met betrekking tot de modulatie van de immuniteit van de plant.
De meeste van de studies van de lokalisatie van de T3Es hebben Agrobacterium -gemedieerde overexpressie met een grote fluorescentie-eiwit in de plant host9werkzaam. Echter is de methode heterologe expressie voor genen die worden ingevoerd in andere soorten gebleken te zijn mis gelokaliseerde of af en toe niet-functionele11,12,13. Verschillende studies bleek bovendien dat bacteriële effectoren wijziging voor juiste targeting in de ontvangende cellen14,15,16,17ondergaat. Daarom uitgedrukt Transient effectoren in het cytosol van de plant cellen mogelijk niet functioneel of kwantitatief identiek aan de effectoren die worden geleverd door de T3SS op pathogen infectie18. Bovendien, de fusie van grote fluorescerende labels aan effector eiwitten kan het verstoren van de juiste effector levering en visualisatie18,19. Daarom kunnen deze benaderingen te assay de T3E functie niet volledig overeen met de inheemse lokalisatie van de T3SS-uitgescheiden effectoren.
Een groen fluorescente proteïne (GFP) bestaat uit een 11-stranded β-vat bijvoeging van een centraal onderdeel waarin een chromofore20. Waldo et al. een nieuwe split-GFP-systeem dat uit een klein onderdeel bestaat gemeld (GFP β onderdeel 11; GFP11) en een grote aanvullende fragment (GFP β deel 1-10; GFP1-10)21. De fragmenten niet zelf lichten maar lichten op hun zelfstandige vereniging wanneer beide fragmenten in de directe nabijheid met elkaar zijn. Voor de optimalisatie van de opvouwbare efficiëntie van eiwit, werden robuuste opvouwbare varianten van het GFP, dat wil zeggen, sfGFP en sfGFPOPT, later ontwikkeld voor de split GFP systeem20,21,22. Onlangs, één aminozuur gemuteerd varianten van sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT en sfCFP1-10OPT- dat kan reconstrueren met een fragment van de sfGFP11, en Toon geel en cyaan fluorescentie respectievelijk werden gegenereerde23 . Bovendien, sfCherry, een afgeleide van mCherry, kan worden opgesplitst in sfCherry1-10 en sfCherry11 fragmenten op dezelfde wijze als sfGFP23.
Dit systeem is aangepast label en bijhouden van de effectoren van de T3SS in HeLa cellen tijdens de infectie met behulp van de effectoren van Salmonella24. Echter, het was eerder niet geoptimaliseerd voor het hostsysteem plant-bacteriële pathogenen. Onlangs, geoptimaliseerd we het split GFP systeem op basis van de verbeterde sfGFP1-10OPT te controleren de subcellular localisatie van de T3Es verlost van P. syringae in plantaardige cellen25. Ter vergemakkelijking van de studies van de lokalisatie van de T3Es naar verschillende subcellular compartimenten in de plantencellen, een set van transgene Arabidopsis thaliana werden planten gegenereerd om uit te drukken van sfGFP1-10OPT in de diverse compartimenten van subcellular 25. Bovendien, de uitvoering van een verscheidenheid van plasmiden organel-gerichte sfGFP1-10OPT voor de Agrobacterium-gemedieerde voorbijgaande overexpressie en de sfGFP11-gelabeld vectoren voor de T3SS gebaseerde effector levering ook werden gegenereerd. De zaden van verschillende transgene Arabidopsis lijnen en de plasmiden wil de T3Es van belang kunnen worden verkregen uit bronnen die zijn vermeld in de Tabel van materialen26,27.
In het volgende protocol beschrijven we een geoptimaliseerde systeem voor het controleren van de dynamiek van de effectoren geleverd door bacteriën in de cellen van de gastheer met behulp van de split sfGFP-systeem. Infectie van planten uiting van sfGFP1-10OPT met transgene Pseudomonas uitvoering van recombinante sfGFP11 plasmide resulteert in een levering van de sfGFP11-gelabeld effector van Pseudomonas in de gastheercel. Daarom deze eiwitten worden gereconstitueerd en translocate aan de specifieke effector doel compartment(s). De Pseudomonas syringae pv. tomaat CUCPB5500 stam waarin 18 effectoren zijn verwijderd, werd gebruikt omdat deze soort toonde weinig of geen celdood in zowel A. thaliana en N. benthamianas28. Alle materialen en stappen die hier worden beschreven kan echter worden vervangen of gewijzigd om aan te passen van het systeem van de split-sfGFP voor onderzoek van andere biologische vragen of optimalisatie in de gegeven laboratoriumomstandigheden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidopsis transgenic lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &#38; Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYTO-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NU-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PT-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MT-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &#38; Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYTO-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NU-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PT-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MT-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-sfCherry1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-sfYFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYTO-sfCFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system</td>
			<td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &#38; Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBK-GW-1-2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98250</td>
			<td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBK-GW-1-4</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98251</td>
			<td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBK-GW-2-2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98252</td>
			<td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBK-GW-2-4</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98253</td>
			<td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBG-GW-1-2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98254</td>
			<td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBG-GW-1-4</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98255</td>
			<td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBG-GW-2-2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98256</td>
			<td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBG-GW-2-4</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98257</td>
			<td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens GV3101</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant germination media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 2.165g/L Murashige &#38; Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium including vitamins</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0222</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave.&#160; Allow solution to cool to 55 &#176;C, and add antibiotic if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro agar</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>King&#39;s B media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 &#176;C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1551128 USP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G1345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol-Glutamate (MG) liquid media </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G0707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NIST200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infiltration buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 &#181;M acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1503</td>
			<td>Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Prepare 150 mM stock in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope equipments/materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>710 laser scanning confocal system</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio observer Z1 inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

split green fluorescent protein system to visualize effectors delivered from bacteria during infection

Bacteriën, een van de belangrijkste oorzakelijke agens van diverse plantenziektes, afscheiden een aantal effector eiwitten in de plant gastheercel te ondermijnen van het immuunsysteem van de plant. Tijdens de infectie cytoplasmatische effectoren afgeleverd bij het cytosol host via een type III secretie systeem (T3SS). Na de levering in de cel van de plant, de effector(s) is gericht op de specifieke compartment(s) om te moduleren host cel processen voor overleving en replicatie van het pathogene agens. Hoewel er al wat onderzoek op de subcellular localisatie van effector eiwitten in de cellen van de gastheer om hun functie in pathogeniteit te begrijpen met behulp van fluorescente proteïnen, onderzoek van de dynamiek van de effectoren direct ingespoten van bacteriën heeft zijn uitdagend als gevolg van de incompatibiliteit tussen de T3SS en de fluorescente proteïnen.
Hier beschrijven we onze recente methode van een geoptimaliseerde split superfolder groen fluorescent proteïne systeem (sfGFPOPT) te visualiseren van de lokalisatie van de effectoren geleverd via de bacteriële T3SS in de gastheercel. De sfGFP11 (11th β-onderdeel van sfGFP)-tagged effector uitgescheiden via het T3SS kan worden gemonteerd met een specifieke organel gericht sfGFP1-10OPT (1-10th β-onderdeel van sfGFP) voorloop fluorescentie uitstoot op de site. Dit protocol wordt een procedure beschreven om te visualiseren het gereconstitueerde sfGFP fluorescentie signaal met een effector eiwit van Pseudomonas syringae in een bepaalde organel in het Arabidopsis en Nicotiana benthamiana planten.

De structuur van de β-vat van GFP bestaat uit elf β strengen en kan worden onderverdeeld in twee fragmenten, de 1-10th strand (GFP1-10OPT) en het onderdeelth (GFP11) 11. Hoewel geen van de twee fragmenten fluorescerende zelf, kan zelf geassembleerde sfGFP de fluorescentie uitstoten wanneer de twee fragmenten aanwezig zijn in de nabijheid (figuur 1A). In dit systeem, de sfGFP1-10OPT-uiting van Arabidopsis ...

Watch this Scientific Journal Video about Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection at JoVE.com

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie

Fluorescerende eiwit gebaseerde benaderingen te controleren effectoren uitgescheiden door bacteriën in de cellen van de gastheer zijn uitdagend. Dit is te wijten aan de incompatibiliteit tussen fluorescente proteïnen en het type III secretie systeem. Hier, wordt een geoptimaliseerde split superfolder GFP-systeem gebruikt voor visualisatie van effectoren uitgescheiden door bacteriën in de fabriek van de gastheercel.

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

Primer Uitbreiding Capture: Gerichte Sequence Retrieval uit zwaar vervuild DNA Bronnen

We present a method of targeted DNA sequence retrieval from DNA sources which are heavily degraded and contaminated with microbial DNA, as is typical of ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitine membraanfilters op Yeast Two-Hybrid (mythe) Systeem: een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van eiwit-eiwit interacties

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

Gebrekkige PMS2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Gebreken Tijdens Progressie naar Colon Cancer

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Single-molecule beeldvorming van de nucleaire transporten

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

Bacteriële Levering van RNAi effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Monitoring van ubiquitine-proteasoom activiteit in levende cellen door een Degron (dgn)-gedestabiliseerd Green Fluorescent Protein (GFP)-gebaseerde Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Het visualiseren van Bacteriën in Nematoden met behulp van fluorescentie microscopie

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening naar Ubiquitin en Ubiquitin-achtig systeem regulatoren van biologische pathways identificeren in gekweekte zoogdiercellen

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey (Petromyzon marinus)

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus

Een nieuwe Verduidelijking methode om Visualiseer Biliary Degeneratie Tijdens Lever Metamorfose in Sea Lamprey ( Petromyzon marinus)

Biliary atresia is a rare disease of infancy, with an estimated 1 in 15,000 frequency in the southeast United States, but more common in East Asian ...