Name: split green fluorescent protein system to visualize effectors delivered from bacteria during infection
Uploaded: 2018-05-24T14:30:00
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Diese Forschung wurde durch grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) finanziert vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und zukünftigen Raumentwicklung (NRF-2018R1A2A1A05019892), DC und durch einen Zuschuss aus Plant Molecular Breeding Center (unterstützt. PMBC) der nächsten Generation Biogreen 21 Programm der ländlichen Entwicklung Verwaltung (PJ013201), EP Wir danken dem Bildgebungszentrum Instrumentierung Nationalzentrum für das Umweltmanagement zu einem confocal Mikroskop für Dreharbeiten zur Verfügung zu stellen.

Hinweis: Alle Schritte sind bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
1. Vorbereitung von pflanzlichen Stoffen (4 Wochen)
<ol><li>Vorbereitung auf die N. Benthamiana Pflanzen<ol>
<li>2 säen von N. Benthamiana auf der Bodenoberfläche von jedem Pot, das Fach mit einer Plastikhaube abdecken und lassen Samen zum Keimen in einem 25 ° C, 60 % Luftfeuchtigkeit Wachstum Kammer mit einem 16/8-h hell/dunkel Photoperiode Zyklus.</li>
		<li>Nach zwei Wochen he...

<ol>
	<li>Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+stomata+in+plant+innate+immunity+and+foliar+bacterial+diseases.">Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases.</a> Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126 (5), 969-980 (2006).</li><li>Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-Pathogen+Effectors:+Cellular+Probes+Interfering+with+Plant+Defenses+in+Spatial+and+Temporal+Manners.">Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners.</a> Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).</li><li>Buttner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behind+the+lines-actions+of+bacterial+type+III+effector+proteins+in+plant+cells.">Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells.</a> FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).</li><li>Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+tagging+and+detection+with+engineered+self-assembling+fragments+of+green+fluorescent+protein.">Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).</li><li>Cabantous, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protein-protein+interaction+sensor+based+on+tripartite+split-GFP+association.">A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association.</a> Sci Rep. 3, 2854 (2013).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein.">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nat Commun. 7, 11046 (2016).</li><li>Van Engelenburg, S. 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Addgene Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org">https://www.addgene.org</a> (2018)</li><li>. Arabidopsis Biological Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://abrc.osu.edu">https://abrc.osu.edu</a> (2018)</li><li>Kvitko, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+in+the+repertoire+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+type+III+secretion+effector+genes+reveal+functional+overlap+among+effectors.">Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000388 (2009).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li><li>Kovach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+new+derivatives+of+the+broad-host-range+cloning+vector+pBBR1MCS,+carrying+different+antibiotic-resistance+cassettes.">Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.</a> Gene. 166 (1), 175-176 (1995).</li><li>Upadhyaya, N. 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H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+intracellular+innate+immune+receptor+Resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+maculicola+1+(RPM1)+is+activated+at,+and+functions+on,+the+plasma+membrane.">Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).</li><li>Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scalable+strategy+for+high-throughput+GFP+tagging+of+endogenous+human+proteins.">A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).</li><li>Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+Agrobacterium-delivered+VirE2+in+recipient+cells.">Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells.</a> Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+approaches+to+investigate+effector+translocation+into+host+cells+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).</li></ol>

Das hier beschriebene Protokoll dient zur Überwachung der genauen Lokalisierung der Effektor-Proteine der Wirtszelle Pflanze bei Infektion durch die bakterielle T3SS injiziert. Zuvor, Split-GFP-System diente als ein Werkzeug zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierung von Säugetieren Proteine23,36, Salmonellen T3E Lokalisierung und Agrobacterium VirE2 Lieferung durch das T4SS in der Pflanzenzellen37. Um dieses Sys...

Pflanzen sind festsitzende Organismen, die zahlreiche eindringende Krankheitserreger wie Bakterien, Pilze, Viren, Insekten und Nematoden während ihres gesamten Lebenszyklus zu begegnen. Unter den phytopathogene Gramnegative bakterielle Krankheitserreger wie Pseudomonas spp. und Ralstonia spp., infizieren ihre Wirtspflanzen durch Eingabe durch Wunden oder natürliche Öffnungen, z. B. die Spaltöffnungen und Hydathode1. Um erfolgreich Wirtspflanzen besiedeln, haben bakterielle Krankheitserreger entwickelt, um eine Vielzahl von Virulenz Faktoren2entwickeln. Wenn Bakterien eine Wirtspflanze eindringen, sie injizieren eine Reihe von Virulenz Proteinen – bekannt als Effektoren – direkt in die Pflanzenzellen ihre Pathogenität zu fördern. Diese Effektoren unterdrücken oder modulieren die Pflanze angeborene Immunität und zelluläre Hostprozesse um bakterielle überleben3führen zu manipulieren.
Pathogene Bakterien verwenden hauptsächlich eine T3SS Effektor-Proteine direkt in Host Zellen4liefern. Das T3SS ähnelt eine molekularen Spritze mit einem nadelartigen Kanal Anschluss von einem Gerüst-Protein-Struktur über die innere und die äußere bakterielle Membranen an der Injektionsstelle des Host Zelle5. Dieser T3SS-vermittelte Effektor (T3E) Sekretion Mechanismus ist gut erhaltenen in verschiedenen Gramnegative bakterielle Erreger der Anlage als auch menschliche. Eines der repräsentativen Pflanzenpathogene, p. Syringae pv. Tomaten DC3000 HrcC Mutant hat in der Regel eine defekte T3SS beschränkt hat Wachstum bei Pflanzen wahrscheinlich aufgrund der Unfähigkeit dieser Mutante, die Pflanze Immunität (durch die Injektion von Effektor-Proteine)6vollständig zu unterdrücken. Bei der Translokation in den Wirtszellen Ziel Effektoren verschiedene Host-Proteine, die wichtig für das Hostsystem Zelle, einschließlich Anlage Verteidigung Antworten, Gentranskription Zelltod, Proteasom, Vesikel Menschenhandel und Hormon Wege7 , 8 , 9 , 10. Verfolgung von der zellulären Lokalisation der Effektor-Proteine in den Wirtszellen deshalb ein attraktives Ziel, ihre Funktionen in Bezug auf die Modulation der Pflanze Immunität zu verstehen.
Die meisten Studien, Lokalisierung von den T3Es haben Agrobakterium -vermittelten Überexpression mit einem großen Fluoreszenz-Protein in der Host-Anlage9beschäftigt. Jedoch die heterologen Expression-Methode nach Genen, die bei anderen Spezies eingeführt werden nachweislich falsch lokalisierten oder gelegentlich nicht-funktionale11,12,13Jahre alt sein. Darüber hinaus ergab mehrere Studien, dass bakterielle Effektoren Modifikation für eine korrekte Ausrichtung in den Host Zellen14,15,16,17unterziehen. Daher äußerte vorübergehend Effektoren in das Zytosol der Anlage können Zellen nicht quantitativ oder funktional identisch mit den Effektoren, die durch die T3SS auf Erreger Infektion18geliefert werden. Darüber hinaus kann die Fusion von großen fluoreszierende Tags Effektorproteine richtige Effektor Lieferung und Visualisierung18,19stören. Daher können diese Ansätze für die T3E Funktion assay nicht voll die native Lokalisierung des T3SS abgesondert Effektoren widerspiegeln.
Ein grünes fluoreszierendes Protein (GFP) besteht aus einer 11-Stranded β-Fass umschließt ein Leitbündel, die ein Chromophor20enthält. Waldo Et al. berichtet eine neuartige Split-GFP-System, das eine kleine Komponente besteht (GFP β Aktionsbereich 11; GFP11) und ein großes ergänzende Fragment (GFP β Strang 1-10; GFP1-10)21. Die Fragmente nicht fluoreszieren selbst aber auf ihre selbstassoziation fluoreszieren, wenn beide Fragmente in der Nähe miteinander sind. Für die Optimierung der Protein Falten Effizienz wurden robuste faltbare Varianten der GFP, d. h., SfGFP und SfGFPOPT, anschließend für die Split GFP System20,21,22entwickelt. Vor kurzem, einzelne Aminosäure mutierte Varianten des sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT und sfCFP1-10OPT-, die mit sfGFP11 Fragment und Show gelb und Cyan Fluoreszenz bzw. rekonstruieren können, waren generierten23 . Darüber hinaus SfCherry, ein Derivat des mCherry, kann aufgeteilt werden in sfCherry1-10 und sfCherry11 Fragmente in der gleichen Weise wie SfGFP23.
Dieses System wurde angepasst zu kennzeichnen und verfolgen die T3SS Effektoren in HeLa-Zellen während der Infektion mit den Effektoren von Salmonellen24. Jedoch war es bisher nicht für das Hostsystem Pflanze-bakterielle Erreger optimiert. Vor kurzem haben wir optimiert Split GFP-System basierend auf die verbesserte sfGFP1-10OPT , die subzelluläre Lokalisation der T3Es von p. Syringae in pflanzlichen Zellen25geliefert zu überwachen. Zur Erleichterung der Lokalisierungs-Arbeiten des T3Es zu verschiedenen subzelluläre Kompartimente in den Pflanzenzellen, eine Reihe von transgenen Arabidopsis Thaliana wurden Pflanzen erzeugt, um sfGFP1-10OPT in die verschiedenen subzelluläre Kompartimente express 25. Darüber hinaus Plasmide tragen eine Vielzahl von Organell-sfGFP1-10OPT für gezielt Agrobakterium-vermittelten transiente Überexpression und die sfGFP11-Tags Vektoren für die Lieferung des T3SS-basierte Effektor auch erzeugt wurden. Die Samen der verschiedenen transgenen Arabidopsis -Linien und die Plasmide, die T3Es von Interesse auszudrücken erhalten Sie bei Quellen, die in der Tabelle der Materialien26,27erwähnt.
In das folgende Protokoll beschreiben wir ein optimales System zur Überwachung der Dynamik von Effektoren von Bakterien in den Wirtszellen mit Split-SfGFP-System geliefert. Infektion von Pflanzen, sfGFP1-10OPT mit transgenen Pseudomonas tragen rekombinante sfGFP11 Plasmid führt zu einer Lieferung von der sfGFP11-Tags Effektor von Pseudomonas in der Wirtszelle. Infolgedessen diese Proteine sind wieder hergestellt und zu bestimmten Effektor Ziel Kompartiments translozieren. Pseudomonas Syringae pv. Tomaten Verwendet wurde CUCPB5500-Stamm, die in dem 18 Effektoren gelöscht werden, weil diese Sorte niedrige oder keine Zelltod in A. Thaliana und N. Benthamianas28zeigte. Jedoch können alle Materialien und hier beschriebenen Schritten ersetzt oder geändert, um Split-SfGFP-System zur Untersuchung von anderen biologischen Fragen oder Optimierung unter bestimmten Laborbedingungen anzupassen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidopsis transgenic lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &#38; Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYTO-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NU-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PT-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MT-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &#38; Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYTO-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NU-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PT-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MT-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-sfCherry1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-sfYFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYTO-sfCFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system</td>
			<td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &#38; Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBK-GW-1-2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98250</td>
			<td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBK-GW-1-4</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98251</td>
			<td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBK-GW-2-2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98252</td>
			<td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBK-GW-2-4</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98253</td>
			<td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBG-GW-1-2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98254</td>
			<td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBG-GW-1-4</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98255</td>
			<td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBG-GW-2-2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98256</td>
			<td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBG-GW-2-4</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98257</td>
			<td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens GV3101</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant germination media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 2.165g/L Murashige &#38; Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium including vitamins</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0222</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave.&#160; Allow solution to cool to 55 &#176;C, and add antibiotic if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro agar</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>King&#39;s B media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 &#176;C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1551128 USP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G1345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol-Glutamate (MG) liquid media </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G0707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NIST200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infiltration buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 &#181;M acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1503</td>
			<td>Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Prepare 150 mM stock in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope equipments/materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>710 laser scanning confocal system</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio observer Z1 inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

split green fluorescent protein system to visualize effectors delivered from bacteria during infection

Bakterien, eines der wichtigsten Erreger von verschiedenen Pflanzenkrankheiten, absondern, eine Reihe von Effektor-Proteine in die Wirtszelle Pflanze, die Pflanze Immunsystem zu untergraben. Während der Infektion werden zytoplasmatischen Effektoren Host Zytosol über einen Typ III-Sekretion System (T3SS) geliefert. Nach der Anlieferung in die Pflanzenzelle zielt auf die Effector(s) der spezifischen Kompartiments um Zelle Hostprozesse für Überleben und Replikation des Erregers zu modulieren. Zwar gab es einige der Forschung auf die subzelluläre Lokalisation der Effektor-Proteine in den Wirtszellen, ihre Funktion in der Pathogenität zu verstehen, durch die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen, Untersuchung der Dynamik von Effektoren direkt aus Bakterien injiziert ist aufgrund der Inkompatibilität zwischen der T3SS und fluoreszierende Proteine eine Herausforderung gewesen.
Hier beschreiben wir unsere jüngsten Methode eines optimierten Split Superfolder grün fluoreszierendes Protein Systems (SfGFPOPT), die Lokalisierung von Effektoren geliefert über die bakterielle T3SS in der Wirtszelle zu visualisieren. Die sfGFP11 (11th β-Aktionsbereich des SfGFP)-tagged Effektor abgesondert durch die T3SS kann mit einem bestimmten Organell, die gezielte sfGFP1-10OPT (1-10th β-Aktionsbereich des SfGFP) führenden zur Fluoreszenzemission am Standort montiert werden. Dieses Protokoll enthält eine Prozedur zum rekonstituierten SfGFP Fluoreszenzsignal mit einem Effektor-Protein von Pseudomonas Syringae in einem bestimmten Organell in Arabidopsis und Nicotiana Benthamiana Pflanzen zu visualisieren.

Die β-Fass-Struktur der GFP besteht aus elf β-Stränge und kann in zwei Fragmente, die 1-10th Strand (GFP1-10OPT) und die 11th (GFP11) Strand unterteilt werden. Obwohl weder selbst fluoreszierende zwei Fragmente, kann selbst-zusammengebauten SfGFP die Fluoreszenz ausstrahlen, wenn die beiden Fragmente in der Nähe (Abbildung 1A) vorhanden sind. In diesem System, sfGFP1-10OPT- Arabidopsis oder N. Benth...

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Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Split-grün fluoreszierendes Protein System Effektoren geliefert von Bakterien während der Infektion zu visualisieren

Fluoreszierende Protein-basierte Ansätze, Effektoren abgesondert von Bakterien in Wirtszellen zu überwachen sind anspruchsvoll. Dies ist aufgrund der Inkompatibilität zwischen fluoreszierende Proteine und die Typ-III-Sekretion-System. Hier wird eine optimierte Split Superfolder GLP-System zur Visualisierung von Effektoren abgesondert von Bakterien in die Wirtszelle Pflanze verwendet.

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

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