Name: split green fluorescent protein system to visualize effectors delivered from bacteria during infection
Uploaded: 2018-05-24T14:30:00
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이 연구는 기초 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 사역의 과학, ICT 및 향후 계획 (NRF-2018R1A2A1A05019892) dc 및 식물 분자 번 식 센터 (에서 교부 금에 의해 투자에 의해 지원 되었다 PMBC) 에피소드를 농촌 개발 관리 (PJ013201)의 다음 세대 Biogreen 21 프로그램의 우리 confocal 현미경 촬영을 제공 하기 위해 환경 관리에 대 한 국립 계측 센터의 이미징 센터를 감사 합니다.

참고: 모든 단계는 수행 실 온에서 달리 명시 하지 않는 한.
1. 식물 재료 (4 주)의 준비
<ol><li>명. benthamiana 식물에 대 한 준비<ol>
<li>명. benthamiana 의 각 냄비의 토양 표면에 2 씨앗을 뿌리 다, 플라스틱 돔 트레이 커버 및 25 ° C, 16/8-h 명암 photoperiod 사이클 60% 습도 성장 챔버에에서 발 아를 씨를 허용.</li>
		<li>2 주 후, 선택 하 고 각 냄비에 작은 경종을 폐기 단계 1.1.1...

<ol>
	<li>Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+stomata+in+plant+innate+immunity+and+foliar+bacterial+diseases.">Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases.</a> Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126 (5), 969-980 (2006).</li><li>Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-Pathogen+Effectors:+Cellular+Probes+Interfering+with+Plant+Defenses+in+Spatial+and+Temporal+Manners.">Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners.</a> Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).</li><li>Buttner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behind+the+lines-actions+of+bacterial+type+III+effector+proteins+in+plant+cells.">Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells.</a> FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).</li><li>Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Salmonella+typhimurium+effector+protein+SifA+is+modified+by+host+cell+prenylation+and+S-acylation+machinery.">A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery.</a> J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).</li><li>Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. 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Addgene Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org">https://www.addgene.org</a> (2018)</li><li>. Arabidopsis Biological Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://abrc.osu.edu">https://abrc.osu.edu</a> (2018)</li><li>Kvitko, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+in+the+repertoire+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+type+III+secretion+effector+genes+reveal+functional+overlap+among+effectors.">Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000388 (2009).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li><li>Kovach, M. 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H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+intracellular+innate+immune+receptor+Resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+maculicola+1+(RPM1)+is+activated+at,+and+functions+on,+the+plasma+membrane.">Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).</li><li>Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. 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여기에 설명 된 프로토콜 모니터링 호스트 식물 세포 감염 시 세균 T3SS에 의해 주입 하는 effector 단백질의 정확한 지역화에 사용 됩니다. 이전, 분할 GFP 시스템 포유류 단백질23,36의 subcellular 지 방화, 살 모 넬 라 T3E 지역화, Agrobacterium VirE2 납품에 T4SS 통해 공부 하는 도구로 사용 되었다는 식물 세포37. 식물 세포에서이 시스...

식물은 수많은 침입 병원 체 포함 박테리아, 곰 팡이, 바이러스, 곤충 및 nematodes 그들의 수명 주기 동안 발생 하는 착 유기 체. Phytopathogens, 중 녹 종 등 Ralstonia 종, 그램 음성 세균성 병원 체 상처 또는 stomata 및 hydathode 같은 자연 구멍을 통해 입력 하 여 그들의 호스트 식물을 감염1. 성공적으로 호스트 식물 식민지로 세균성 병원 균 독성 요인2의 다양 한 개발을 진화 했다. 박테리아는 기 주 식물을 침공, 그들은 일련의 독성 단백질 주사-이펙터로 알려진-그들의 pathogenicity 홍보를 식물 세포에 직접. 이 이펙터 억제 또는 공장 타고 난 면역을 조절 하 고 세균 생존3결과 호스트 세포 프로세스를 조작.
병원 성 박테리아는 주로 호스트 셀4에 직접 효과 기 단백질을 제공 하는 T3SS를 사용 합니다. T3SS는 호스트 셀5의 사출 사이트 내부와 외부 세균 막 비 계 단백질 구조에서 연결 바늘 같은 채널 분자 주사기를 유사 합니다. 이 이펙터 T3SS 중재 (T3E) 분 비 메커니즘은 인간 뿐만 아니라 식물의 다양 한 그램 음성 세균성 병원 체에 잘 보존. 대표적인 식물 병원 체, P. syringae pv 중 하나입니다. 토마토 DC3000 hrcC 돌연변이 일반적으로 결함이 있는 T3SS 완전히 억제 식물 면역 (effector 단백질을 주입)에 의해6에이 돌연변이의 무 능력으로 인해 식물에 성장을 제한 했다. 호스트 세포로 전, 시 이펙터 대상 다양 한 호스트 단백질 등 식물 방위 응답, 유전자 전사, 세포 죽음, 프로테아좀, 소포 매매, 호르몬 경로7 호스트 셀 시스템에 대 한 중요 한 , 8 , 9 , 10. 따라서, 추적 호스트 셀에 effector 단백질의 세포질 지 방화의 식물 면역의 변조에 관하여 그들의 기능을 이해 하는 매력적인 대상 이다.
T3Es의 지역화 연구의 대부분 Agrobacterium-중재 overexpression 호스트 식물9큰 형광 단백질으로 고용 했다. 그러나, 다른 종에 도입 된 유전자의 분리 식 방법 잘못 지역화 된 또는 때때로 작동 하지11,,1213되도록 표시 되었습니다. 또한, 여러 연구 결과 세균성 이펙터는 호스트 셀14,15,,1617에서 적절 한 대상에 대 한 수정 받을 밝혔다. 따라서, 세포 기능 또는 양적 이펙터 병원 체 감염18시 T3SS에 의해 전달 되는 동일 하지 않을 수 있습니다 식물의 cytosol에서 이펙터 뚜렷이 표현. 또한, 대형 형광 태그 effector 단백질의 융합 적절 한 이펙터 배달 및 시각화18,19중단 될 수 있습니다. 따라서, T3E 함수 분석에이 접근 T3SS 분 비 이펙터의 네이티브 지역화를 완벽 하 게 반영 되지 않을 수 있습니다.
녹색 형광 단백질 (GFP)20발 색 단 포함 하는 중앙 물가 포함 하는 11-배가 좌초 하는 β-배럴의 구성 됩니다. Waldo 외. 작은 부품으로 구성 된 새로운 분할-GFP 시스템을 보고 (GFP β 물가 11; GFP11)와 대형 보완 조각 (GFP β 물가 1-10; GFP1-10)21. 조각을 스스로 형광 하지 않습니다 하지만 두 조각을 서로 가까운 근접에 있을 때 그들의 자기 협회에 형광. 단백질 접히는 효율성의 최적화에 대 한 강력한 접는 변종 GFP, 즉, sfGFP 및 sfGFP선택, 이후에 분할 GFP 시스템20,,2122개발 되었다. 최근, 단일 아미노산 돌연변이 sfGFP1-10선택-sfYFP1-10선택 및 sfCFP1-10선택-을 각각 sfGFP11 조각와 쇼 노란색과 청록색 형광 reconstitute 수, 생성 된23의 변형 . 또한, sfCherry, mCherry의 파생 분열 될 수 있다 sfGFP23와 같은 방식으로 sfCherry11와 sfCherry1-10 조각으로.
이 시스템은 고 살 모 넬 라24. 에서 이펙터를 사용 하 여 감염 동안 추적 하는 HeLa 세포에서 T3SS 이펙터에 맞게 되었습니다. 그러나, 그것은 이전 하지 최적화 호스트 식물 세균성 병원 체 시스템에 대 한. 최근에, 우리는 식물 세포25에 P. syringae 에서 전달 하는 T3Es의 subcellular 지 방화를 모니터링 하는 데 향상 된 sfGFP1-10선택 에 따라 분할 GFP 시스템 최적화. 식물 세포, 유전자 변형 애기 thaliana 집합에에서 다른 subcellular 구획을 T3Es의 지역화 연구를 촉진 하기 위하여 식물 다양 한 subcellular 구획 에서에서 sfGFP1-10OPT 를 표현 하기 위해 생성 된 25. 또한, 다양 한을 운반 하는 플라스 미드 세포 기관이 대상 sfGFP1-10선택 Agrobacterium에 대 한-중재 과도 overexpression 이펙터 T3SS 기반 배달에 대 한 sfGFP11 태그 벡터 또한 생성 했다. 다양 한 유전자 변형 애기 라인과 관심의 T3Es을 표현 하는 플라스 미드의 씨앗 테이블의 자료26,27에서 언급 한 소스에서 얻을 수 있습니다.
다음 프로토콜에서 우리는 분할 sfGFP 시스템을 사용 하 여 호스트 세포에 박테리아에 의해 전달 하는 이펙터의 역학을 모니터링 하는 최적화 된 시스템을 설명 합니다. SfGFP1-10선택 유전자 변형 녹 sfGFP11 재조합 플라스 미드를 들고와 표현 하는 식물의 감염 호스트 셀으로 모나 스 에서 sfGFP11 태그 이펙터의 전달 결과. 따라서, 이러한 단백질 재구성 되 고 특정 이펙터 대상 compartment(s)에 이동. 슈 도모 나 스 syringae pv입니다. 토마토 18 이펙터 삭제 됩니다, CUCPB5500 스트레인이이 스트레인 A. thaliana 및 북 아 일 benthamianas28에 낮은 또는 없음 세포 죽음을 보여주 때문에 사용 되었다. 그러나, 모든 자료와 여기에 설명 된 단계 교체 수 있습니다 또는 다른 생물학 질문 또는 지정 된 실험실 조건에서 최적화의 조사를 위해 분할 sfGFP 시스템에 맞게 수정.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidopsis transgenic lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &#38; Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYTO-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NU-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PT-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MT-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-sfGFP1-10</td>
			<td>ABRC</td>
			<td>CS69838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &#38; Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYTO-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NU-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PT-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MT-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM-sfGFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-sfCherry1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-sfYFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYTO-sfCFP1-10</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>97405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system</td>
			<td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &#38; Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBK-GW-1-2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98250</td>
			<td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBK-GW-1-4</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98251</td>
			<td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBK-GW-2-2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98252</td>
			<td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBK-GW-2-4</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98253</td>
			<td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBG-GW-1-2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98254</td>
			<td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBG-GW-1-4</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98255</td>
			<td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBG-GW-2-2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98256</td>
			<td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBG-GW-2-4</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>98257</td>
			<td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens GV3101</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant germination media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 2.165g/L Murashige &#38; Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium including vitamins</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0222</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave.&#160; Allow solution to cool to 55 &#176;C, and add antibiotic if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro agar</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>King&#39;s B media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 &#176;C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1551128 USP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G1345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol-Glutamate (MG) liquid media </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G0707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NIST200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infiltration buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 &#181;M acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1503</td>
			<td>Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Prepare 150 mM stock in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope equipments/materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>710 laser scanning confocal system</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio observer Z1 inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

split green fluorescent protein system to visualize effectors delivered from bacteria during infection

박테리아, 다양 한 식물 질병의 원인이 되는 가장 중요 한 에이전트 중 하나는 호스트 식물 세포 식물 면역 체계를 파괴에 effector 단백질의 집합을 분 비. 감염 시 세포질 이펙터 유형 III 분 비 시스템 (T3SS)를 통해 호스트 cytosol에 전달 됩니다. 식물 세포에 배달, 후에 effector(s) 생존 및 병원 체의 복제에 대 한 호스트 세포 프로세스를 변조 하는 것 특정 compartment(s) 대상. 비록 pathogenicity에 형광 단백질을 사용 하 여 그들의 기능을 이해 하는 호스트 셀에 effector 단백질의 subcellular 지역화의 박테리아에서 직접 주입 하는 이펙터의 역학 조사에서 일부 연구 하고있다 T3SS와 형광 단백질 간의 비 호환성으로 인해 도전 하고있다.
여기, 우리가 호스트 셀에서 세균 T3SS 통해 전달 하는 이펙터의 지역화를 시각화 하기 위해 최적화 된 분할 superfolder 녹색 형광 단백질 시스템 (sfGFPOPT)의 최근 우리의 방법을 설명 합니다. sfGFP11 (11번째 β 물가의 sfGFP)-태그 이펙터는 T3SS을 통해 분 비 사이트에서 형광 방출에 표적으로 하는 특정 세포 기관이 sfGFP1-10선택 (1-10번째 β 물가의 sfGFP) 행간 조립 될 수 있다. 이 프로토콜 애기 Nicotiana benthamiana 식물에 특정 세포 기관이에 슈 도모 나 스 syringae 에서 effector 단백질으로 재구성된 sfGFP 형광 신호를 시각화 하는 절차를 제공 합니다.

GFP의 β 배럴 구조 11 β 물가의 구성 이며, 두 조각, 1-10번째 가닥 (GFP1-10선택)와 11일 (GFP11) 가닥으로 나눌 수 있습니다. 비록 둘 다 2 개의 파편 스스로 형광의 자기 조립된 sfGFP 근접 (그림 1A)에 존재 하는 2 개의 파편 때 형광을 내보낼 수 있습니다. 이 시스템에서는, sfGFP1-10선택-식물 녹 sfGFP11 태그 이펙터를 들고?...

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Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

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