Name: 2 in 1: one-step affinity purification for the parallel analysis of protein-protein and protein-metabolite complexes
Uploaded: 2018-08-06T13:30:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes at JoVE.com

أننا نود أن يرجى نقر أ. د. لوثار ويلميتزير لمشاركته في المشروع، وإجراء مناقشات مثمرة، وإشراف كبير. ونحن ممتنون للدكتور دانييل Veyel لمساعدة مع قياسات MS البروتين. ونحن نقدر السيدة Änne ميكايليس الذين قدموا لنا المساعدة التقنية لا تقدر بثمن مع قياسات LC-مرض التصلب العصبي المتعدد. وعلاوة على ذلك، نود أن نشكر الدكتورة مونيكا كوسماكز والدكتور اويلينا Sokołowska على مساعدتها ومشاركتها في الأعمال على المخطوطة الأصلية، وإلى Jasińska ويرونيكا لتقديم الدعم التقني.

<ol>
	<li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolites+as+global+regulators:+A+new+view+of+protein+regulation.">Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation.</a> Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).</li><li>Schlattner, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Function+of+Mitochondrial+Nm23-H4+Protein+in+Phosphotransfer+and+Intermembrane+Transfer+a+cardiolipin-dependent+switch.">Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).</li><li>Ram&#237;rez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+binding+regulates+cellular+localization+of+Parkinson's+disease-associated+LRRK2.">GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2.</a> Human Molecular Genetics. , ddx161 (2017).</li><li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules:+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Archives of Pharmacal Research. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li><li>Harding, M. W., Galat, A., Uehling, D. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor+for+the+immunosuppressant+FK506+is+a+cis-trans+peptidyl-prolyl+isomerase.">A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase.</a> Nature. 341 (6244), 758-760 (1989).</li><li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li><li>Manabe, Y., Mukai, M., Ito, S., Kato, N., Ueda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLAG+tagging+by+CuAAC+and+nanogram-scale+purification+of+the+target+protein+for+a+bioactive+metabolite+involved+in+circadian+rhythmic+leaf+movement+in+Leguminosae.">FLAG tagging by CuAAC and nanogram-scale purification of the target protein for a bioactive metabolite involved in circadian rhythmic leaf movement in Leguminosae.</a> Chemical Communications. 46 (3), 469-471 (2010).</li><li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery.">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).</li><li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+In+vivo+Metabolite-Protein+Interactions+by+Large-Scale+Systematic+Analyses.">Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses.</a> Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).</li><li>Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protocol+for+the+purification+and+characterization+of+water-soluble+complexes+of+affinity-tagged+proteins+and+lipids.">A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).</li><li>Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+in+vivo+metabolite-protein+interactions+revealed+by+large-scale+systematic+analyses.">Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses.</a> Cell. 143 (4), 639-650 (2010).</li><li>Veyel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+detection+of+protein-small+molecule+complexes+suggests+extensive+metabolite+regulation+in+plants.">System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li><li>Luzarowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+with+metabolomic+and+proteomic+analysis+unravels+diverse+roles+of+nucleoside+diphosphate+kinases.">Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases.</a> Journal of Experimental Botany. , (2017).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+interactomics+reveals+a+complex+core+cell+cycle+machinery+in+Arabidopsis+thaliana.">Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular systems biology. 6 (1), 397 (2010).</li><li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+formula+annotation+of+polar+and+lipophilic+metabolites+using+13C,+15N+and+34S+isotope+labelling,+in+combination+with+high-resolution+mass+spectrometry.">Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using 13C, 15N and 34S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry.</a> The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+transcription+factor+complexes+from+Arabidopsis+cell+suspension+cultures+by+tandem+affinity+purification.">Isolation of transcription factor complexes from Arabidopsis cell suspension cultures by tandem affinity purification.</a> Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 195-218 (2011).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tandem+affinity+purification-based+technology+platform+to+study+the+cell+cycle+interactome+in+Arabidopsis+thaliana.">A tandem affinity purification-based technology platform to study the cell cycle interactome in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6 (7), 1226-1238 (2007).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. -. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301 (2016).</li><li>Hooper, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUBAcon:+a+consensus+algorithm+for+unifying+the+subcellular+localization+data+of+the+Arabidopsis+proteome.">SUBAcon: a consensus algorithm for unifying the subcellular localization data of the Arabidopsis proteome.</a> Bioinformatics. 30 (23), 3356-3364 (2014).</li><li>Katajamaa, M., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+for+mass+spectrometry-based+metabolomics.">Data processing for mass spectrometry-based metabolomics.</a> Journal of Chromatography A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STITCH+5:+augmenting+protein-chemical+interaction+networks+with+tissue+and+affinity+data.">STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data.</a> Nucleic Acids Research. 1277, (2015).</li><li>Tanaka, K. -. i., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dipeptidyl+compounds+ameliorate+the+serum-deprivation-induced+reduction+in+cell+viability+via+the+neurotrophin-activating+effect+in+SH-SY5Y+cells.">Dipeptidyl compounds ameliorate the serum-deprivation-induced reduction in cell viability via the neurotrophin-activating effect in SH-SY5Y cells.</a> Neurological Research. 34 (6), 619-622 (2012).</li><li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=METLIN:+A+metabolite+mass+spectral+database.">METLIN: A metabolite mass spectral database.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 27, 747-751 (2005).</li><li>Bhattacharyya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+protein-protein+interactions+perturb+E.+coli+metabolome+and+cause+gene+dosage+toxicity.">Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يسمح البروتوكول قدم موازية الهوية مجمعات PP وبعد الظهر للبروتين الهدف. من الاستنساخ للنتائج النهائية، يمكن أن تكتمل التجربة في أقل من 8-12 أسبوعا. AP كاملة يأخذ حوالي 4-6 ح لمجموعة من العينات 12 إلى 24، مما يجعل لدينا بروتوكول مناسبة لتحليل الإنتاجية منتصف.
البروتوكول، على الرغم من كونها واضحة عموما، يحتوي على عدد من الخطوات الحاسمة. (ط) يكفي كمية البروتين الإدخال والخرز تقارب أمر حاسم للتوصل إلى مجموعة ديناميكية من كشف المستقلب. ولذلك تحلل الخلية فعالة خطوة حاسمة في الإجراء. يمكن أن تكون غلة بروتين الفقراء نتيجة لنضح غير كافية من المواد أو نسبة تحلل-المواد العازلة دون المستوى الأمثل. (ثانيا) ينبغي الحرص أن الكواشف المستخدمة هي صديقة لمرض التصلب العصبي المتعدد. وينبغي تجنب المنظفات القوية أو الجلسرين، أو كميات مفرطة من الملح كما أنها تتعارض مع الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد. (ثالثا) الخرز [اغروس] ينبغي أن لا الإفراط المجفف أثناء الغسيل الخطوات، وعند استخدام مشعب فراغ من المهم تطبيق معدل تدفق بطيء حتى لا تدمير الخرز أو تؤثر على الاستقرار المعقدة.
وهناك بعض التعديلات المحتملة الهامة في البروتوكول المقدم: (ط) نستخدم المروج CaMV35S التأسيسي لزيادة كمية البروتين الطعم. Overexpression، كانت مفيدة جداً، يمكن أن يكون آثار خطيرة على التوازن خلية28 وأن يؤدي إلى تشكيل تفاعلات غير ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. تعبير البروتينات المعلمة استخدام المروجين الأصلية والتي يعتبر فيها ممكن في خلفية فقدان لوظيفة متفوقة لاسترداد التمثيلات البيولوجية الحقيقية. للبروتينات عادة لا المعرب عنه في الثقافات الخلية النباتية، قد يثبت خلفية النباتية اللازمة لتحديد التمثيلات ذات الصلة. (ثانيا) عند العمل مع بروتينات الغشاء, المخزن المؤقت تحلل يحتاج إلى أن تستكمل بالمنظفات الصناعية متوافقة مع مرض التصلب العصبي المتعدد. (ثالثا) الأخذ بخطوة تقارب تنقية ثانية يمكن تحسين إيجابيات كاذبة بالنسبة الحقيقية من إيجابيات والقضاء على الحاجة إلى ضوابط EV29. علامة رواية جنبا إلى جنب مع موقعين حوزتي المستقلة-الانقسام ويقدم بديلاً جذاباً للخطوة حجم الاستبعاد اللوني يضيفها مايدا et al. عام 201411، وشاقة وتستغرق وقتاً طويلاً على حد سواء.
العائق أخطر من وكالة اسوشييتد برس هي المعدل المرتفع من إيجابيات كاذبة. أسباب عديدة. سبق أن ورد overexpression التأسيسي. مصدر آخر للتفاعلات غير ذات صلة من الناحية الفسيولوجية، ما لم يكن العمل مع العضيات معزولة، إعداد ليساتيس كامل الخلية التي تحتوي على خليط من البروتينات ونواتج الأيض من المقصورات سوبسيلولار مختلفة. وينبغي استخدام التعريب سوبسيلولار لتصفية للتمثيلات الحقيقية. ومع ذلك، نتيجة أغلبية المغلوطة ملزمة غير محدد بين البروتينات والراتنجات [اغروس]. مقدمة لتنقية الخطوة الثانية، كما هو موضح أعلاه، يقدم أفضل حل للمشكلة، لكن يأتي على حساب الوقت والإنتاجية. وعلاوة على ذلك، قد يتم فقدان التفاعل أضعف كما يطيل البروتوكول. تحذير آخر من وكالة اسوشييتد برس هو رغم شاملة المعلومات التي يقدمها حول إينتيراكتومي البروتين المستهدف، التفريق بين الأهداف المباشرة وغير المباشرة من البروتين اصطاد مستحيلة. النهج بيموليكولار المستهدفة ضرورية لتأكيد التفاعلات.
AP مقترنة بجميع المستندة إلى MS استخدمت لدراسة البروتين-المجمعات في S. cerevisiae12. هذا العمل، جنبا إلى جنب مع جهودنا الملاحظة السابقة13 ، وبالمثل للدهون، المركبات القطبية وشبه القطبية تظل ملتزمة بمجمعات البروتين المعزولة من ليساتيس الخلوية، وفرت الأساس المفاهيمي للبروتوكول المقدم. لدينا بروتوكول تتميز بثلاث نقاط فريدة من نوعها: (ط) وفي المقابل للخميرة العمل12، فإنه يوضح أن AP مناسبة لاسترجاع ليس فقط البروتين مسعور ولكن أيضا ماء يغاندس. (ثانيا) عن طريق إدخال بروتوكول استخراج ثلاثة في واحد، يمكن استخدام نقطة واحدة لدراسة البروتين والمستقلب التمثيلات من البروتين الطعم. (ثالثا) علينا تكييف البروتوكول الخلايا النباتية.
الجهود المقبلة ستركز على إنشاء علامة جديدة جنبا إلى جنب مع موقعين الانقسام حوزتي مستقلة. ونود أيضا لاستكشاف مدى ملاءمة البروتوكول إلى جزيئات صغيرة منخفضة-وفرة مثل الهرمونات النباتية.

الأسلوب الموصوفة هنا يهدف إلى تحديد الشركاء المستقلب والبروتين بروتين الاختيار في ظروف شبهفي فيفو ليساتي الخلوية. كان قد تردد أن العديد من نواتج الأيض أكثر مما يتسم اليوم وظيفة تنظيمية هامة1. والايضات يمكن أن تعمل كمفاتيح البيولوجية، تغيير في النشاط ووظائف الترجمة على مستقبلات بروتينات2،،من34. وكانت أساليب اختراق عدة، مما يتيح تحديد الهوية من PMI في فيفو أو في ظروف شبهفي فيفو ، في العقد الماضي نمواً5. يمكن فصل النهج المتاحة إلى مجموعتين. وتضم المجموعة الأولى التقنيات التي تبدأ ب طعم المستقلب المعروفة بغية تعويض البروتين رواية الشركاء. وتشمل أساليب التقارب اللوني6والمخدرات تقارب الاستقرار المستهدفة تستجيب المقايسة7، البروتيوميات الكيماوي8والبروتين الحرارية التنميط9. تتكون المجموعة الثانية من أسلوب واحد يبدأ مع بروتين معروفة من أجل تحديد يغاندس جزيء صغير10،11.
AP يقترن المستندة إلى MS ليبيدوميكس استخدمت لتحليل البروتينات الدهنية المجمعات في. Saccharomyces cerevisiae12 كنقطة انطلاق، المؤلفين استخدام سلالات الخميرة معربا عن 21 الإنزيمات المشاركة في تخليق ارجوستيرول الحيوي وتنصهر مؤنزم 103 على تنقية جنبا إلى جنب-تقارب العلامة (الصنبور). تم العثور على 70% الإنزيمات و 20% من مؤنزم لربط مختلف يغاندس مسعور، تسليط الضوء في شبكة التفاعل المعقدة البروتينات الدهنية.
سابقا، يمكن أن نظهر أن، وبالمثل للدهون، المركبات القطبية وشبه القطبية أيضا تظل ملتزمة بمجمعات البروتين المعزولة من ليساتيس الخلوية13. وبناء على هذه النتائج، قررنا أن تحسين وكالة اسوشييتد برس الأسلوب سبق نشرة10،11 للخلايا النباتية ومجمعات ماء14. ولهذا الغرض، استخدمنا ناقلات الصنبور الموصوفة بلين فإن وآخرون 2010، استخدمت بنجاح في مصنع PPI الدراسات15. لتقصير الفترة الزمنية اللازمة للحصول على خطوط محوره وراثيا، قررنا نبات خلية الثقافات. نحن العاملين خطوة واحدة الميثيل ثالثي-بوتيل الاثير، (مثيل ثالثي بوتيل الإيثر)/الميثانول/المياه استخراج أسلوب، مما يتيح وصف البروتينات (بيليه)، والدهون (المرحلة العضوية)، وماء الأيض (المرحلة المائية)16 في واحد تنقية تقارب التجربة. وأدخلت خطوط التحكم EV استبعاد إيجابيات كاذبة، مثل البروتينات ملزمة للعلامة وحدها. وكدليل على مفهوم نحن معلم ثلاثة (من خمسة) نوكليوزيد diphosphate مؤنزم الموجودة في جينوم نبات (NDPK1-NDPK3). من بين النتائج الأخرى، يمكن أن نظهر أن NDPK1 يتفاعل مع الجلوتاثيون S-ترانسفيراز والجلوتاثيون. وبالتالي يمكن أن نثبت أن تعرض NDPK1 إلى جلوتاثيونيليشن14.
خلاصة القول، هو أداة هامة لوصف البروتين-بروتين وشبكات التفاعل جزيء صغير البروتين-البروتوكول المقدم ويشكل تقدما كبيرا على مدى الأساليب القائمة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Naphthylacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N1641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64 protease inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AcTEV Protease</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>12575015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#160;Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBP Tag Antibody (SB19-C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-101595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>V5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTBE&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>138906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>136806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>232106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>12006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>202341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>69141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unimax 2010 Platform Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>5421002000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh (Wire diameter 34 &#181;M, thickness 55 &#181;M, open area 14%)</td>
			<td>Prosepa</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Funnel, 47 mm, 300 ml</td>
			<td>Restek</td>
			<td>KT953751-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Bottle Top 500 mL 0,2 &#181;M Pes St</td>
			<td>VWR International GmbH</td>
			<td>514-0340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 400</td>
			<td>Retsch GmbH</td>
			<td>207450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0969-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobicol &#34;&#34;Classic&#34;&#34; with 2 different screw caps without filters</td>
			<td>MoBiTec GmbH</td>
			<td>M1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (small) 35 &#181;M pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 &#38; M1053</td>
			<td>MoBiTec GmbH</td>
			<td>M513515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Tube Rotator SB 3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>Y550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary dishes for rotators SB 3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>Y555.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resprep 24-Port SPE Manifolds</td>
			<td>Restek&#160;</td>
			<td>26080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml</td>
			<td>Teknokroma</td>
			<td>TR-F034000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler&#160;Vials</td>
			<td>Klaus Trott Chromatographie-Zubeh&#246;r</td>
			<td>40 11 01 740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 LC Column</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>164534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>LC120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters&#160;</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 &#181;M, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg</td>
			<td>Waters&#160;</td>
			<td>186003533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>RK 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genedata Expressionist</td>
			<td>Genedata</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>NaN</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2 in 1: one-step affinity purification for the parallel analysis of protein-protein and protein-metabolite complexes

وتخضع العمليات الخلوية بالتفاعلات بين الجزيئات البيولوجية مثل البروتينات ونواتج الأيض والأحماض النووية. بينما يتم التحقيق في تفاعلات البروتين البروتين (PPI) لا الجدة، نهج تجريبي يهدف إلى وصف التفاعلات الذاتية البروتين-المستقلب (PMI) تشكل تطورا الأخيرة بدلاً من ذلك. وهنا، نقدم بروتوكول يسمح لتوصيف المتزامنة PPI والصليب الأحمر من بروتين اختيارهم، ويشار إليها كطعم. لدينا بروتوكول كان الأمثل لخلية نبات الثقافات ويجمع بين انجذاب تطهير (AP) مع الطيف الكتلي (مللي ثانية)-على أساس الكشف عن البروتين والمستقلب. باختصار، أولاً يتم تفكيك خطوط نبات المحورة وراثيا، معربا عن البروتين الطعم تنصهر فيها علامة تقارب، للحصول على خلاصة خلوية أصلية. وتستخدم الأجسام المضادة العلامة لهدم البروتين والمستقلب الشركاء من البروتين الطعم. المجمعات تنقية تقارب يتم استخراج استخدام الميثيل خطوة واحدة ثالثي-بوتيل الاثير (مثيل ثالثي بوتيل الإيثر)/الميثانول/المياه الأسلوب. بينما فصل نواتج الأيض إلى القطبية أو في مرحلة مسعور، يمكن العثور على البروتينات في بيليه. ثم يتم تحليل نواتج الأيض والبروتينات بواسطة فائقة الأداء السائل اللوني-قياس الطيف الكتلي (أوبلك--مرض التصلب العصبي المتعدد أو أوبلك-MS/MS). متجه فارغة (EV) مراقبة خطوط تستخدم لاستبعاد المغلوطة. والميزة الرئيسية لأن البروتوكول أنه يمكن تحديد شركاء البروتين والمستقلب البروتين المستهدف بالتوازي في ظروف القرب الفسيولوجية (الخلوية ليستي). طريقة عرض واضحة وسريعة، ويمكن تكييفها بسهولة للنظم البيولوجية خلاف الثقافات الخلية النباتية.

في الدراسة الأصلية، كانت overexpressed ثلاثة ندبك التمويل (أ) الجينات في الثقافات تعليق خلية PSB-L تحت سيطرة المروج 35S التأسيسي14 (الشكل 1). وكان تنصهر فيها علامة تقارب جنبا إلى جنب أما النهاية الطرفية كاربوكسي أو الأمينية بروتين الطعم. المجمعات تنقية تقارب تعرضوا ل استخراج الميثانول ومثيل ثالثي بوتيل الإيثر/الماء16. وحددت سحبت تقارب البروتينات والجزيئات الصغيرة باستخدام MS (الجداول S2 و S3).
لتصحيح المغلوطة، استخدمت عينات فارغة لاستبعاد الملوثات جزيء صغير من المواد الكيميائية والمواد الاستهلاكية المختبر. وعلاوة على ذلك، الأيض والبروتينات التي تربط إلى أما علامة تقارب أو الراتنج وحدها كانت استأثرت باستخدام خطوط التحكم EV. لاسترداد إيجابيات حقيقية، واختبار t-غير إقران التائي ومعدل اكتشاف كاذبة بينجاميني & هوشبيرغ تم تطبيق التصحيح لتحديد نواتج الأيض (S4 الجدول) والبروتينات (S5 الجدول) أثرت إلى حد كبير في "وكالة اسوشييتد برس ندبكس" تجارب (N-وج-الميؤوس من شفائهم معلم ندبكس) بالمقارنة مع خطوط التحكم EV (FDR < 0.1). لاحظ أن في الأعمال السابقة، استخدمنا غياب/وجود معايير لتحديد التمثيلات البروتين والجزيئات الصغيرة.
يعطي نتائج تمثيلية ل NDPK1، بينما المستقلب بيانات التركيز على ديبيبتيديس، فئة جديدة من المنظمين جزيء صغير درس في مجموعتنا. وكشف تحليل البروتين 26 شركاء البروتين المفترضة من NDPK1. عن طريق تصفية إضافية للبروتينات مترجمة شارك في نفس حجرة سوبسيلولار ك NDPK1 (cytosol)، القائمة ضاقت إلى 13 بروتين المفترضة التمثيلات. بين البروتينات التي تم تحديدها هي الجلوتاثيون S-ترانسفيراز، وعوامل بدء استطالة اثنين، وتوبولين وهيدراتاسي أكونيتاتي. وكشف تحليل Metabolomic أربعة ديبيبتيديس لوي فال وايل-غلو ولوي-إيل وايل-Phe أن الوتيد على وجه التحديد المشترك مع NDPK1 (الشكل 2). علما بأن حصة ديبيبتيديس الأربعة جميع بقايا مسعور في بهم ن-المحطة، مما يوحي بخصوصية الربط المشترك.
للبحث عن مجمعات البروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المعروفة ونحن حددت 13 المستعلم عنها البروتينات وأربعة ديبيبتيديس ضد قاعدة الإبرة25 (الشكل 3). ويمكن إبداء الملاحظات عدة: (ط) أيا من التمثيلات وأبلغ سابقا عن NDPK1. (ثانيا) APX1 أورثولوج أفيد أن تتفاعل مع ألدهيد نازعة أفراد الأسرة ALDH7B4، بينما الترجمة بدء عامل FBR12 مع عامل آخر بدء الترجمة مرمزة بواسطة الجينات AT2G40290. (ثالثا وأفادت) ديبيبتيديس المحددة لا الشركاء البروتين. لم يتم الإبلاغ عنها ديبيبتيديس التيد شارك في وقت سابق كما المرتبطة بالبروتين المصنع استرجاع أي. ومع ذلك، أنها تلعب أدواراً هامة في الكائنات الحية الأخرى: لوي-إيل، مثلاً، له تأثير نيوروتروفين-تفعيل في خط خلية بشرية26. علما أن التجربة لا تسمح بتحديد الطبولوجيا الدقيق للنظام. على سبيل المثال، قد تتفاعل مباشرة مع NDPK1 ديبيبتيدي لكن جيدا قد تكون متصلة بأي من البروتينات المنقاة المشترك.
أخذت معا، النتائج التي توصلنا إليها تظهر أن الإجراءات المعمول بها، توظف AP جنبا إلى جنب مع الطيف الكتلي، يسهل تحديد التمثيلات البروتين-بروتين والبروتين-الصغيرة-جزيء ويساعد على توليد معلومات مستفيضة عن إينتيراكتومي البروتين الهدف.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> رقم 1. مخطط سير العمل AP-مرض التصلب العصبي المتعدد. (أ) إعداد جزء قابل للذوبان أصلي من زراعة الخلايا النباتية. (ب) الخطوات التالية في الإجراء AP. بعد تحميل العينة على العمود، يربط بروتين الاهتمام (POI) تنصهر فيها علامة حنفية إلى جسم مفتش معطلة على الخرز [اغروس]. غسالة عمود تسهل إزالة البروتينات غير منضم ونواتج الأيض. بعد أداء أكتيف الانقسام، هي التيد مجمعات البروتين-المستقلب البوي. (ج) فصل المجمعات إلى الكسر البروتين والمستقلب متبوعاً بالتحليل الكمي شبه لمرض التصلب العصبي المتعدد. ويرد جزء من هذا الرقم من لوزارووسكي et al. عام 201714. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> رقم 2. ديبيبتيديس على وجه التحديد المشترك الوتينج مع NDPK1- تم رسم متوسط كثافة ديبيبتيديس أربعة Val-لوي (A)وايل-غلو (ب)ولوي-إيل (ج)وايل-الفنيل ألانين (د) تقاس في تجربة وكالة اسوشييتد برس. إظهار جميع ديبيبتيديس أربعة إثراء كبيرا في عينات NDPK1 مقارنة بمراقبة EV (العلامات النجمية تمثل فرانكلين روزفلت < 0.1). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للقياسات 6 (replicates 3 ن-و 3 من ج-شفاء معلم البروتينات). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> الشكل 3. شبكة التفاعل من جميع الجزيئات التينج يشترك مع NDPK1، وتساءل ضد قاعدة الإبرة تنظر فقط في السابق التجريبية وقاعدة بيانات الأدلة (الثقة > 0.2). الثقة أعلى يشير إلى فرص أكبر للتفاعل ويحسب استناداً إلى البيانات المودعة. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
الجدول S1. ماكسكوانت إخراج الجدول "parameters.txt". جدول يتضمن قيم العتبات للتعريف والتحديد الكمي، فضلا عن معلومات حول قواعد البيانات المستخدمة. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الجدول S2. المعلومات الواردة من ماكسكوانت إخراج الجدول "proteinGroups.txt". يحتوي الجدول على قائمة بجميع المجموعات المحددة البروتين وكثافات ومعلومات إضافية مثل عدد من الببتيدات فريدة من نوعها ودرجة. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الجدول S3. ملف الإخراج الذي يحتوي على تحليل لنواتج الأيض القطبية. الجدول يحتوي على قائمة من كافة الميزات الجماعية المحددة تميزت محددة m/z، الرايت وكثافة. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الجدول S4. ديبيبتيديس وجدت في عينات AP في NDPK1، NDPK2 أو NDPK3 التي استخدمت كطعم. ديبيبتيديس الموجودة في عينات فارغة تم استبعادها من القائمة. تم تشغيل اثنين من خطوط مستقلة (معلم في أما ن-أو ج-تيرمينوس) لكل ندبك في ثلاث نسخ. الطالب t-اختبار ومواصلة تصحيح فالقيمه باستخدام بينجاميني & أسلوب هوشبيرغ واستخدمت لتحديد الشركاء إينتيراكتور المخصب بدرجة كبيرة من ندبكس (FDR < 0.1). ونظرا ΔRT تحسب بالنسبة للمركبات الإشارة و Δppm بالنسبة مونويسوتوبيك نظراً للدمار في ميتلين27. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الجدول S5. تنقية البروتينات يشترك مع NDPK1. تم تشغيل اثنين من خطوط مستقلة (معلم في أما ن-أو ج-تيرمينوس) لكل ندبك في ثلاث نسخ. الطالب t-اختبار ومواصلة تصحيح فالقيمه باستخدام بينجاميني & أسلوب هوشبيرغ واستخدمت لتحديد الشركاء إينتيراكتور المخصب بدرجة كبيرة من ندبكس (FDR < 0.1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes at JoVE.com

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

تفاعلات البروتين البروتين والبروتين-المستقلب حاسمة بالنسبة لجميع الوظائف الخلوية. هنا، نحن وصف بروتوكول يسمح تحليل موازية لهذه التفاعلات مع بروتين في الاختيار. لدينا بروتوكول الأمثل للثقافات الخلية النباتية، ويجمع بين انجذاب تطهير مع البروتين الشامل القائم على قياس الطيف الكتلي وكشف المستقلب.

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

السريع خطوة واحدة الأنزيمية توليف وجميع المائيه تنقية طرهالوز النظائر

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

نهج G-quadruplex الحمض النووي تقارب لتنقية نشط إنزيمي G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

تنقية وإعادة تشكيل TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

انجذاب تطهير المجمعات البروتين ترانسلوكون بلاستيدات الخضراء باستخدام علامة الحنفية

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا البطانية في الجسم الحي

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...