Name: 2 in 1: one-step affinity purification for the parallel analysis of protein-protein and protein-metabolite complexes
Uploaded: 2018-08-06T13:30:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes at JoVE.com

Wij willen vriendelijk erkennen Prof. Dr. Lothar Willmitzer voor zijn betrokkenheid bij het project, productieve discussies en grote toezicht. Wij zijn dankbaar aan Dr Daniel Veyel voor het helpen met proteomic MS metingen. Wij waarderen Mrs. Änne Michaelis die ons onschatbare technische hulp met LC-MS-metingen. Bovendien wil wij Dr. Monika Kosmacz en Dr. Ewelina Sokołowska bedanken voor hun hulp en hun betrokkenheid bij het werk op het originele manuscript en tot Weronika Jasińska voor technische ondersteuning.

<ol>
	<li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolites+as+global+regulators:+A+new+view+of+protein+regulation.">Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation.</a> Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).</li><li>Schlattner, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Function+of+Mitochondrial+Nm23-H4+Protein+in+Phosphotransfer+and+Intermembrane+Transfer+a+cardiolipin-dependent+switch.">Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).</li><li>Ram&#237;rez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+binding+regulates+cellular+localization+of+Parkinson's+disease-associated+LRRK2.">GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2.</a> Human Molecular Genetics. , ddx161 (2017).</li><li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules:+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Archives of Pharmacal Research. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li><li>Harding, M. W., Galat, A., Uehling, D. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor+for+the+immunosuppressant+FK506+is+a+cis-trans+peptidyl-prolyl+isomerase.">A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase.</a> Nature. 341 (6244), 758-760 (1989).</li><li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li><li>Manabe, Y., Mukai, M., Ito, S., Kato, N., Ueda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLAG+tagging+by+CuAAC+and+nanogram-scale+purification+of+the+target+protein+for+a+bioactive+metabolite+involved+in+circadian+rhythmic+leaf+movement+in+Leguminosae.">FLAG tagging by CuAAC and nanogram-scale purification of the target protein for a bioactive metabolite involved in circadian rhythmic leaf movement in Leguminosae.</a> Chemical Communications. 46 (3), 469-471 (2010).</li><li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery.">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).</li><li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+In+vivo+Metabolite-Protein+Interactions+by+Large-Scale+Systematic+Analyses.">Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses.</a> Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).</li><li>Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protocol+for+the+purification+and+characterization+of+water-soluble+complexes+of+affinity-tagged+proteins+and+lipids.">A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).</li><li>Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+in+vivo+metabolite-protein+interactions+revealed+by+large-scale+systematic+analyses.">Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses.</a> Cell. 143 (4), 639-650 (2010).</li><li>Veyel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+detection+of+protein-small+molecule+complexes+suggests+extensive+metabolite+regulation+in+plants.">System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li><li>Luzarowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+with+metabolomic+and+proteomic+analysis+unravels+diverse+roles+of+nucleoside+diphosphate+kinases.">Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases.</a> Journal of Experimental Botany. , (2017).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+interactomics+reveals+a+complex+core+cell+cycle+machinery+in+Arabidopsis+thaliana.">Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular systems biology. 6 (1), 397 (2010).</li><li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+formula+annotation+of+polar+and+lipophilic+metabolites+using+13C,+15N+and+34S+isotope+labelling,+in+combination+with+high-resolution+mass+spectrometry.">Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using 13C, 15N and 34S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry.</a> The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+transcription+factor+complexes+from+Arabidopsis+cell+suspension+cultures+by+tandem+affinity+purification.">Isolation of transcription factor complexes from Arabidopsis cell suspension cultures by tandem affinity purification.</a> Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 195-218 (2011).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tandem+affinity+purification-based+technology+platform+to+study+the+cell+cycle+interactome+in+Arabidopsis+thaliana.">A tandem affinity purification-based technology platform to study the cell cycle interactome in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6 (7), 1226-1238 (2007).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. -. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301 (2016).</li><li>Hooper, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUBAcon:+a+consensus+algorithm+for+unifying+the+subcellular+localization+data+of+the+Arabidopsis+proteome.">SUBAcon: a consensus algorithm for unifying the subcellular localization data of the Arabidopsis proteome.</a> Bioinformatics. 30 (23), 3356-3364 (2014).</li><li>Katajamaa, M., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+for+mass+spectrometry-based+metabolomics.">Data processing for mass spectrometry-based metabolomics.</a> Journal of Chromatography A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STITCH+5:+augmenting+protein-chemical+interaction+networks+with+tissue+and+affinity+data.">STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data.</a> Nucleic Acids Research. 1277, (2015).</li><li>Tanaka, K. -. i., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dipeptidyl+compounds+ameliorate+the+serum-deprivation-induced+reduction+in+cell+viability+via+the+neurotrophin-activating+effect+in+SH-SY5Y+cells.">Dipeptidyl compounds ameliorate the serum-deprivation-induced reduction in cell viability via the neurotrophin-activating effect in SH-SY5Y cells.</a> Neurological Research. 34 (6), 619-622 (2012).</li><li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=METLIN:+A+metabolite+mass+spectral+database.">METLIN: A metabolite mass spectral database.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 27, 747-751 (2005).</li><li>Bhattacharyya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+protein-protein+interactions+perturb+E.+coli+metabolome+and+cause+gene+dosage+toxicity.">Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De gepresenteerde protocol kunnen parallelle identificatie van PP en PM complexen van een doel-eiwit. Van klonen te eindresultaten, kan het experiment worden afgerond in minder dan 8-12 weken. Volledige AP duurt ongeveer 4-6 h voor een set van 12 tot en met 24 monsters, waardoor ons protocol geschikt voor mid doorvoer analyse.
Het protocol, ondanks het feit dat over het algemeen eenvoudig, heeft een aantal kritische stappen. (i) voldoende hoeveelheid input eiwitten en affiniteit kralen is cruciaal voor het bereiken van een dynamisch scala aan metaboliet detectie. Efficiënte cellysis is daarom een essentiële stap in de procedure. Slechte eiwit opbrengsten kunnen een gevolg zijn van onvoldoende verpulvering van het materiaal of van de verhouding tussen suboptimaal lysis-buffer/materiaal. (ii) moet worden gezorgd dat gebruikte reagentia MS-vriendelijk zijn. Agressieve schoonmaakmiddelen, glycerol, of grote hoeveelheden zout moeten worden vermeden als zij met MS detectie interfereren. (iii) Agarose kralen mag niet overdreven gedroogde tijdens het wassen stappen, en bij het gebruik van een vacuüm variëteit is het belangrijk een langzame stroming tarief zo niet te vernietigen de kralen of complexe stabiliteit beïnvloeden toe te passen.
Er zijn enkele belangrijke eventuele wijzigingen in het gepresenteerde protocol: (i) We de constitutieve promotor van de CaMV35S gebruiken om de hoeveelheid aas eiwit te maximaliseren. Overexpressie, kan terwijl zeer nuttig, ernstige gevolgen hebben voor cel homeostase28 en leiden tot de vorming van fysiologisch irrelevant interacties. Expressie van tagged eiwitten met behulp van inheemse initiatiefnemers en waar mogelijk op de achtergrond van een verlies-van-functie wordt beschouwd als superieur voor ophalen waar biologische interactors. Voor de eiwitten die normaal niet uitgedrukt in celculturen plant, kan een plant achtergrond noodzakelijk blijken om te identificeren van relevante interactors. (ii) bij het werken met membraaneiwitten, moet de lysis-buffermengsel worden aangevuld met een MS-compatibele wasmiddel. (iii) invoering van een tweede affiniteit-zuivering kan verbeteren van vals-positieven te waar-positieven verhouding en elimineren de noodzaak voor EV besturingselementen29. Een nieuwe tandem-tag met twee onafhankelijke protease-decollete sites presenteert een aantrekkelijk alternatief voor de grootte-uitsluiting chromatografie-stap toegevoegd door Maeda et al. 201411, die zowel moeizaam en tijdrovend is.
Het grootste nadeel van de AP is de hoge mate van valse positieven. De redenen zijn talrijk. Constitutieve overexpressie werd reeds genoemd. Een andere bron van fysiologisch irrelevant interacties, is tenzij werkt met geïsoleerde organellen, voorbereiding van geheel-cel lysates met mengsels van eiwitten en metabolieten van verschillende subcellular compartimenten. Subcellular Localisatie moet worden gebruikt om te filteren op ware interactors. Niettemin is de meerderheid van de valse positieven leiden tot van aspecifieke binding tussen eiwitten en agarose harsen. Introductie van een tweede zuivering, zoals hierboven beschreven, biedt de beste oplossing voor het probleem, maar gaat ten koste van tijd en doorvoer. Bovendien kan zwakkere interactie worden verloren als het protocol verlengt. Een andere valkuil van AP is dat ondanks de uitgebreide informatie over de interactome voor een doel-eiwit, onderscheid tussen directe en indirecte doelstellingen van het aas-eiwit is het onmogelijk. Gerichte bimolecular benaderingen zijn nodig om te bevestigen van interacties.
AP in combinatie met MS gebaseerde metabolomica werd gebruikt bij het bestuderen van eiwitcomplexen in S. cerevisiae12. Dit werk, samen met onze eerdere observatie13 dat ook lipiden, polar en semi-polaire verbindingen gebonden aan eiwitcomplexen afgezonderd van cellulaire lysates blijven, voorziet het voorgestelde protocol conceptuele basis. Ons protocol wordt gekenmerkt door drie unieke punten: (i) In tegenstelling tot de gist werken12, het toont aan dat AP is geschikt voor het ophalen van niet alleen hydrofobe maar ook hydrofiele proteïne liganden. (ii) door de invoering van een drie-in-één extractie-protocol, kan een enkele AP te bestuderen van eiwitten en metaboliet interactors van het aas-eiwit worden gebruikt. (iii) wij het protocol plantenziekterisico cellen aangepast.
Toekomstige inspanningen zal zich richten op het creëren van een nieuwe tandem-tag met twee onafhankelijke protease-decollete sites. Wij zouden ook graag verkennen van geschiktheid van het protocol voor lage-overvloed kleine molecules zoals plantenhormonen.

Hier beschreven de methode beoogt de identificatie van metaboliet en eiwit partners van een proteïne van keuze in de omgeving vanin-vivo cellulaire lysate voorwaarden. Er werd gespeculeerd dat veel meer metabolieten dan vandaag gekenmerkt een belangrijke regelgevende functie1 hebben. Metabolieten kunnen fungeren als biologische schakelaars, wijzigen van de activiteit, functionaliteit, en/of de lokalisatie van hun receptor eiwitten2,3,4. In het laatste decennium geweest verschillende doorbraak methoden, waardoor identificatie van PMI in vivo of in de omgeving vanin-vivo voorwaarden, ontwikkelde5. Beschikbare benaderingen kunnen worden gescheiden in twee groepen. De eerste groep bestaat uit technieken die met een bekende-metaboliet aas beginnen om te val roman eiwit partners. Methoden omvatten affinity chromatografie6, drug affiniteit responsieve doel-stabiliteit assay7, chemo-proteomics8en thermische Proteoom profilering van9. De tweede groep bestaat uit een enkele methode die met een bekende eiwit begint teneinde kleine-molecuul liganden10,11.
AP in combinatie met MS gebaseerde jachtgeweerlipidomics werd gebruikt voor het analyseren van eiwit-lipide complexen in Saccharomyces cerevisiae12. Als uitgangspunt, de auteurs gebruikt giststammen 21 enzymen die betrokken zijn bij biosynthese van ergosterol uitdrukken en 103 kinases gesmolten tot een zuivering van de tandem-affiniteit (TAP) label. 70% van de enzymen en 20% van de kinases bleken te binden verschillende hydrofobe liganden, vergieten van licht in het ingewikkelde eiwit-lipide interactie netwerk.
Voorheen konden we aantonen dat eveneens aan lipiden, polar en semi-polaire verbindingen ook gebonden aan eiwitcomplexen geïsoleerd van de cellulaire lysates13 blijven. Op basis van deze bevindingen, hebben we besloten voor het optimaliseren van de AP-methode, gepubliceerd eerder10,,11 voor plantencellen en hydrofiele stoffen14. Voor dit doel gebruikten we TAP vectoren beschreven door Van Leene et al. 2010, met succes gebruikt in de plant PPI studies15. We besloten om te verkorten van de benodigde tijd voor het verkrijgen van transgene lijnen, Arabidopsis celculturen. Wij werken een one-step methyl- tert-butylether, (MTBE) / methanol/water extractiemethode, waardoor de karakterisatie van eiwitten (korrel), lipiden (organische fase) en hydrofiele metabolieten (waterige fase)16 in één affiniteit-zuivering experiment. EV control lijnen werden geïntroduceerd om uit te sluiten van valse positieven, bijvoorbeeld eiwitten binden aan de tag alleen. Als bewijs van concept we gelabeld drie (van de vijf) nucleoside (III) difosfaat kinases presenteren in het Arabidopsis genoom (NDPK1-NDPK3). Onder andere bevindingen, kunnen wij laten zien dat NDPK1 met glutathione S communiceert-transferase en glutathion. Bijgevolg kunnen wij bewijzen dat NDPK1 is onderworpen aan glutathionylation14.
Kortom, het gepresenteerde protocol is een belangrijk instrument voor het karakteriseren van de eiwit-eiwit en eiwit-kleine-molecuul interactienetwerken en vormt een belangrijke vooruitgang over bestaande methoden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Naphthylacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N1641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64 protease inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AcTEV Protease</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>12575015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#160;Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBP Tag Antibody (SB19-C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-101595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>V5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTBE&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>138906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>136806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>232106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>12006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>202341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>69141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unimax 2010 Platform Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>5421002000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh (Wire diameter 34 &#181;M, thickness 55 &#181;M, open area 14%)</td>
			<td>Prosepa</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Funnel, 47 mm, 300 ml</td>
			<td>Restek</td>
			<td>KT953751-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Bottle Top 500 mL 0,2 &#181;M Pes St</td>
			<td>VWR International GmbH</td>
			<td>514-0340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 400</td>
			<td>Retsch GmbH</td>
			<td>207450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0969-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobicol &#34;&#34;Classic&#34;&#34; with 2 different screw caps without filters</td>
			<td>MoBiTec GmbH</td>
			<td>M1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (small) 35 &#181;M pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 &#38; M1053</td>
			<td>MoBiTec GmbH</td>
			<td>M513515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Tube Rotator SB 3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>Y550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary dishes for rotators SB 3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>Y555.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resprep 24-Port SPE Manifolds</td>
			<td>Restek&#160;</td>
			<td>26080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml</td>
			<td>Teknokroma</td>
			<td>TR-F034000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler&#160;Vials</td>
			<td>Klaus Trott Chromatographie-Zubeh&#246;r</td>
			<td>40 11 01 740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 LC Column</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>164534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>LC120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters&#160;</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 &#181;M, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg</td>
			<td>Waters&#160;</td>
			<td>186003533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>RK 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genedata Expressionist</td>
			<td>Genedata</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>NaN</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2 in 1: one-step affinity purification for the parallel analysis of protein-protein and protein-metabolite complexes

Cellulaire processen worden gereguleerd door interacties tussen biologische moleculen zoals nucleïnezuren, eiwitten en metabolieten. Terwijl het onderzoek van eiwit-eiwitinteractie (PPI) geen noviteit is, vormen experimentele benaderingen willen karakteriseren van endogene eiwit-metaboliet interacties (PMI) een vrij recente ontwikkeling. Hierin presenteren wij een protocol waarmee gelijktijdige karakterisering van de PPI en PMI van een proteïne van keuze, hierna aangeduid als aas. Ons protocol is geoptimaliseerd voor Arabidopsis cel-culturen en affiniteit zuivering (AP) combineert met de Spectrometrie van de massa (MS)-op basis van eiwit en metaboliet detectie. Kortom, zijn transgene Arabidopsis lijnen, uitdrukken van aas eiwit gesmolten tot een affiniteit tag, eerst lysed om een inheemse cellulaire extract bekomen. Anti-label antilichamen worden gebruikt voor pull-down eiwit en metaboliet partners van het aas-eiwit. De complexen affiniteit-gezuiverd worden geëxtraheerd met behulp van een one-step methyl- tert-butyl ether (MTBE) / methanol/water-methode. Terwijl metabolieten in de polar of de hydrofobe fase verdeelt, kunnen eiwitten worden gevonden in de pellet. Zowel de metabolieten en de eiwitten worden vervolgens geanalyseerd door ultra krachtige vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (UPLC-MS of UPLC-MS/MS). Leeg-vector (EV) controle lijnen worden gebruikt om uit te sluiten van valse positieven. Het grote voordeel van onze protocol is dat het identificatie van eiwitten en metaboliet partners van een doel-eiwit in parallel in in de buurt van de fysiologische omstandigheden (mobiele lysate) mogelijk maakt. De onderhavige methode is eenvoudig, snel en kan gemakkelijk aangepast worden aan biologische systemen dan plant celculturen.

In de oorspronkelijke studie, werden drie A. thaliana NDPK genen overexpressie in PSB-L schorsing celculturen onder de controle van de constitutieve 35S promotor14 (Figuur 1). Tandem affiniteit label was gesmolten aan weerszijden carboxy - of amino-terminal van een aas-eiwit. De affiniteit-gezuiverd complexen werden onderworpen aan MTBE/methanol/water winning16. Affiniteit-trok eiwitten en kleine moleculen werden geïdentificeerd met behulp van MS (tabellen S2 en S3).
Om te corrigeren voor valse positieven, werden blancomonsters gebruikt om het uitsluiten van kleine-molecuul verontreinigingen van de chemicaliën en Laboratorium verbruiksartikelen. Bovendien, metabolieten en eiwitten die binden aan hetzij een affiniteit tag of hars alleen waren goed voor met behulp van de EV control lijnen. Om op te halen waar positieven, tweezijdige niet-gepaarde Student t-test- en Benjamini & Hochberg valse ontdekking tarief werd correctie toegepast om metabolieten (Tabel S4) en eiwitten (Tabel S5) aanzienlijk verrijkt in de NDPKs AP te identificeren experimenten (N - en C-terminaal gelabeld NDPKs) in vergelijking met de EV control lijnen (FDR < 0.1). Merk op dat we in de vorige werk, afwezigheid/aanwezigheid criteria af te bakenen eiwitten en kleine-molecuul interactors gebruikt.
Representatieve resultaten gegeven voor NDPK1, terwijl de metaboliet gegevens focus op dipeptides, een nieuwe klasse van de regelgevers van de kleine-molecuul studeerde in onze fractie. Proteoom analyse bleek 26 putatief eiwit partners van NDPK1. Door verdere filtering voor eiwitten mede gelokaliseerd in hetzelfde subcellular compartiment als NDPK1 (cytosol), de lijst verkleinde tot 13 putatief eiwit interactors. Onder de geïdentificeerde eiwitten waren glutathione S-transferase, twee rek initiatie factoren, tubuline en aconitate hydratase. Metabolomic analyse bleek vier dipeptides Val-Leu, Ile-Glu Leu-Ile en Ile-Phe die specifiek geëlueerd samen met NDPK1 (Figuur 2). Merk op dat alle vier dipeptides een hydrofobe residu in hun N-terminus delen, suggereren gedeelde bindende specificiteit.
Op zoek naar bekende eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen we geïdentificeerd opgevraagde 13 eiwitten en vier dipeptides tegen de Stitch database25 (Figuur 3). Verscheidene opmerkingen kunnen worden gemaakt: (i) geen van de interactors voorheen werd gerapporteerd voor NDPK1. (ii) APX1 ortholog werd gemeld om te interageren met aldehyde dehydrogenase familielid ALDH7B4, terwijl de vertaling initiatie factor FBR12 met een andere vertaling initiatie factor gecodeerd door gen AT2G40290. (iii) de geïdentificeerde dipeptides hebben eiwit partners niet gemeld. Co geëlueerd dipeptides werden niet gemeld eerder als geassocieerd met alle opgehaalde plantaardige eiwitten. Echter, ze spelen een belangrijke rol in andere organismen: Leu-Ile, bijvoorbeeld, heeft een Neurotrofine-activeren effect in een menselijke cel lijn26. Merk op dat het experiment niet toelaat de exacte topologie van het systeem identificeren. Bijvoorbeeld, een dipeptide kan directe interactie met NDPK1 maar kan goed worden veroorzaakt door een van de mede gezuiverde eiwitten.
Tezamen, onze resultaten tonen aan dat de vastgestelde procedure, AP dienst samen met de Spectrometrie van de massa, vergemakkelijkt de identificatie van de eiwit-eiwit en eiwit-kleine-molecuul interactors en helpt genereren uitgebreide informatie over de interactome van het target-eiwit.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> Figuur 1. Schema van de AP-MS werkstroom. (A) voorbereiding van een inheemse oplosbare fractie uit de cultuur van de cel van de plant. (B) volgende stappen in de procedure van de AP. Na het laden van het monster op de kolom, bindt de proteïne van belang (POI's), gesmolten tot een TAP-tag aan de IgG-antilichamen geïmmobiliseerd op de agarose parels. Wassen van de kolom vergemakkelijkt verwijdering van niet-afhankelijke eiwitten en metabolieten. Na het uitvoeren van AcTEV decollete, worden POI eiwit-metaboliet complexen geëlueerd. (C) scheiding van complexen in eiwit en metaboliet fractie gevolgd door semi-kwantitatieve analyse van MS. Deel van dit bedrag is opgenomen van Luzarowski et al. 201714. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> Figuur 2. Dipeptides specifiek mede eluerende met NDPK1. Gemiddelde intensiteiten van vier dipeptides Val-Leu (A), Ile-Glu (B), Leu-Ile (C)en Ile-Phe (D) gemeten in AP experiment werden uitgezet. Alle vier dipeptides aanzienlijke verrijking in NDPK1 monsters in vergelijking met EV controle weergeven (sterretjes vertegenwoordigen FDR < 0.1). Foutbalken vertegenwoordigen standaardfout voor 6 metingen (3 replicatieonderzoeken van N- en 3 C-terminaal gelabeld eiwitten). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> Figuur 3. Netwerk van de interactie van alle moleculen samen met NDPK1, eluerende opgevraagd tegen STITCH database overwegen alleen vorige experimentele en database bewijzen (vertrouwen > 0.2). Hogere vertrouwen geeft hogere kans op interactie en is berekend op basis van de neergelegde gegevens. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Tabel S1. MaxQuant uitgang tabel "parameters.txt". Tabel bevat drempelwaarden voor identificatie en kwantificering, evenals informatie over de databases die worden gebruikt. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Tabel S2. Informatie uit MaxQuant uitgang tabel "proteinGroups.txt". Deze tabel bevat een lijst van alle groepen van de geïdentificeerde eiwit, intensiteiten en aanvullende informatie zoals het aantal unieke peptiden en score. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Tabel S3. Output-bestand met de analyse van polar metabolieten. Tabel bevat een lijst van alle geïdentificeerde massa eigenschappen gekenmerkt door specifieke m/z, RT en intensiteit. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Tabel S4. Dipeptides gevonden in AP monsters waarvan NDPK1, de NDPK2 of de NDPK3 werden gebruikt als aas. Dipeptides in blancomonsters aanwezig waren uitgesloten van de lijst. Twee onafhankelijke lijnen (gelabeld in beide N - of C-terminus) voor elke NDPK zijn uitgevoerd in drievoud. Student t-test en na correctie van de p-waarde met behulp van Benjamini & Hochberg methode werden gebruikt om te bepalen van aanzienlijk verrijkt gegevensstroomdiagrammen partners van NDPKs (FDR < 0.1). Gegeven is ΔRT berekend op basis van de referentiestoffen en Δppm met betrekking tot de exacte massa gegeven in Metlin27. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Tabel S5. Eiwitten gezuiverd samen met NDPK1. Twee onafhankelijke lijnen (gelabeld in beide N - of C-terminus) voor elke NDPK zijn uitgevoerd in drievoud. Student t-test en na correctie van de p-waarde met behulp van Benjamini & Hochberg methode werden gebruikt om te bepalen van aanzienlijk verrijkt gegevensstroomdiagrammen partners van NDPKs (FDR < 0.1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes at JoVE.com

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Rapid One-step enzymatische synthese en All-waterige Zuivering van Trehalose analogen

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Een G-quadruplex DNA-affiniteit Aanpak voor zuivering van enzymatisch actieve G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affiniteit zuivering van Chloroplast Translocon eiwitcomplexen met behulp van de Tag van de TAP

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Het vertalen van ribosome Affiniteits zuivering (TRAP) voor RNA-isolatie van endotheel cellen in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Toepassing van Biolayer interferometrie (BLI) voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in transcriptie

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...