Name: 2 in 1: one-step affinity purification for the parallel analysis of protein-protein and protein-metabolite complexes
Uploaded: 2018-08-06T13:30:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes at JoVE.com

Wir möchten bitte Prof. Dr. Lothar Willmitzer für sein Engagement im Projekt, produktive Diskussionen und tolle Betreuung anerkennen. Wir sind dankbar, Dr. Daniel Veyel für die Hilfe bei Proteomik-MS-Messungen. Wir schätzen Frau Änne Michaelis, die uns wertvolle technische Hilfe mit LC-MS-Messungen. Darüber hinaus möchten wir Dr. Monika Kosmacz und Dr. Ewelina Sokołowska für ihre Hilfe und Beteiligung an der Arbeit auf dem Originalmanuskript und Weronika Jasińska für technische Unterstützung zu danken.

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die vorgestellte Protokoll ermöglicht parallele Identifikation von PP und PM-komplexe an ein Zielprotein. Von Klonen zur endgültigen Ergebnisse, kann das Experiment in weniger als 8 bis 12 Wochen abgeschlossen werden. Komplette AP dauert ca. 4-6 h für eine Gruppe von 12 bis 24 Proben, Rendern unser Protokoll für mittleren Durchsatz Analyse geeignet.
Das Protokoll, trotz insgesamt einfach, hat eine Reihe von kritischen Schritte. (i) ausreichende Menge an input Protein und Affinität Perlen ist entscheidend für einen dynamischen Bereich von Metaboliten Erkennung zu erreichen. Effiziente Zelle Lysis ist daher ein entscheidender Schritt im Verfahren. Armen Protein Erträge können eine Folge der unzureichenden Pulverisierung des Materials oder der suboptimalen Lyse-Puffer/Material-Verhältnis sein. (Ii) Vorsicht geboten, dass die verwendeten Reagenzien MS-freundlich sind. Starke Reinigungsmittel, Glycerin oder übermäßige Mengen von Salz sollte vermieden werden, da sie mit MS-Detektion stören. (Iii) Agarose Korne sollte nicht über getrocknete während Waschschritte, und bei Vakuum vielfältige Verwendung ist es wichtig, einen langsamen Durchfluss um nicht zu zerstören die Perlen oder beeinflussen Komplexstabilität anzuwenden.
Es gibt einige wichtigen möglichen Änderungen des vorliegenden Protokolls: (i) Wir verwenden die konstitutive CaMV35S Promotor Köder Eiweißmenge zu maximieren. Überexpression, kann zwar sehr nützlich, ernsthafte Auswirkungen auf Zelle Homöostase28 haben und führen zur Bildung von physiologisch irrelevant Interaktionen. Ausdruck der tagged Proteine mit native Promotoren und wo möglich in einem Verlust der Funktion zum Abrufen der wahre biologische Interaktoren überlegen ist. Für Proteine, die normalerweise nicht in pflanzlichen Zellkulturen ausgedrückt könnte ein Pflanze Hintergrund notwendig, um relevante Interaktoren identifizieren. (Ii) bei der Arbeit mit Membranproteine muss der Lyse Puffer mit einer MS-kompatible Reinigungsmittel ergänzt werden. (Iii) Einführung eines zweiten Affinitätsreinigung Schritts Fehlalarme wahr-positive Verhältnis verbessern und beseitigen die Notwendigkeit für EV Steuerelemente29. Ein neuartiger Tandem-Tag mit zwei unabhängigen Protease-spaltstellen stellt eine attraktive Alternative zu der Größe-Ausschluss Chromatographie Schritt hinzugefügt von Maeda Et Al. 201411, das ist mühsam und zeitaufwendig.
Der schwerwiegendste Nachteil des AP ist die hohe Rate falsch positiver Ergebnisse. Die Gründe sind zahlreich. Konstitutive Überexpression wurde bereits erwähnt. Eine weitere Quelle für physiologisch irrelevant Interaktionen ist, wenn Arbeit mit isolierten Organellen, Vorbereitung der gesamten Zelle Lysates mit Mischungen von Proteinen und Metaboliten aus verschiedenen subzelluläre Kompartimente. Subzelluläre Lokalisation sollte für wahre Interaktoren Filtern verwendet werden. Dennoch ergeben sich die Mehrheit der Fehlalarme durch unspezifische Bindung zwischen Proteinen und Agarose Harze. Einführung einer zweiten Reinigungsstufe, wie oben beschrieben, bietet die beste Lösung für das Problem, geht jedoch auf Kosten der Zeit und Durchsatz. Darüber hinaus können schwächere Interaktion verloren gehen, da das Protokoll verlängert. Ein weiterer Nachteil von AP ist, dass trotz der umfassenden bereitgestellten Informationen über die Interaktom an ein Zielprotein, Unterscheidung zwischen direkten und indirekten Ziele des eifrigen Proteins unmöglich. Gezielte Bimolekulare Ansätze sind notwendig, um Interaktionen zu bestätigen.
AP in Verbindung mit MS-basierte Metabolomik wurde verwendet, um Proteinkomplexe in S. Cerevisiae12. zu studieren Dieser Arbeit, zusammen mit unseren früheren Beobachtung13 , dass ähnlich, Lipide, polar und semi-polare Verbindungen isoliert von zellulären Lysates Proteinkomplexe gebunden bleiben vorgesehen konzeptionelle Vorarbeit für die vorgestellten Protokoll. Unser Protokoll zeichnet sich durch drei einzigartige Punkte: (i) im Gegensatz zu der Hefe arbeiten12, es zeigt, dass AP geeignet für das Abrufen von nicht nur wasserabweisend, aber auch hydrophile Protein Liganden. (Ii) durch die Einführung eines drei-in-One-Extraktion-Protokolls, ist eine einzelne AP einsetzbar, Proteinen und Metaboliten Interaktoren des Proteins Köder zu studieren. (Iii) Wir haben das Protokoll zur Pflanzenzellen angepasst.
Zukünftige Bemühungen konzentrieren sich auf einen neuartige Tandem-Tag mit zwei unabhängigen Protease-spaltstellen erstellen. Wir würden auch gerne Eignung des Protokolls zu niedrig-Fülle kleine Moleküle wie pflanzlichen Hormonen zu erkunden.

Hier beschriebenen Methode zielt auf die Identifizierung von Metaboliten und Protein Partnern eines Proteins der Wahl in den zellulären lysate Bedingungen in der Nähe vonin-Vivo . Es wurde spekuliert, dass viele weitere Metaboliten als heute charakterisiert eine wichtige regulatorische Funktion1. Metaboliten fungieren als biologische Schalter, verändern die Aktivität, die Funktionalität sowie die Lokalisierung ihrer Rezeptor Proteine2,3,4. In den letzten zehn Jahren wurden mehrere bahnbrechende Methoden, die Identifizierung des PMI in Vivo oder in nahe -in-Vivo -Bedingungen ermöglichen entwickelten5. Verfügbaren Ansätze können in zwei Gruppen aufgeteilt werden. Die erste Gruppe umfasst Techniken, die mit einem bekannten-Metabolit Köder zu starten, um neues Protein Partner zu fangen. Methoden umfassen Affinität Chromatographie6, Medikament Affinität reagiert Ziel-Stabilität Assay7, Chemo-Proteomics8und thermische Proteom Profilerstellung9. Die zweite Gruppe besteht aus einer einzigen Methode, die mit einem bekannten Protein beginnt um kleine Molekül Liganden10,11zu identifizieren.
AP in Verbindung mit MS-basierte Lipidomics wurde zum Analysieren der Protein-Lipid-komplexe in Saccharomyces Cerevisiae12. Als Ausgangspunkt die Autoren verwendeten Hefestämme mit dem Ausdruck 21 Enzyme Ergosterin-Biosynthese beteiligt und 103 Kinasen verschmolzen zu einem Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) Tag. 70 % der Enzyme und 20 % von der Kinasen fanden sich verschiedene hydrophobe Liganden, Licht in das komplizierte Protein-Lipid-Interaktion-Netz zu binden.
Bisher konnten wir nachweisen, dass ähnlich wie Lipide, polar und semi-polare Verbindungen auch Proteinkomplexe isoliert von der zellulären Lysates13verpflichtet bleiben. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, wir beschlossen, die AP optimieren Methode vorher10,11 für Pflanzenzellen und hydrophilen Verbindungen14veröffentlicht. Zu diesem Zweck haben wir TAP Vektoren von Van Leene Et Al. 2010, erfolgreich im Einsatz im Werk PPI Studien15beschrieben. Um den Zeitaufwand zu transgenen Linien zu verkürzen, haben wir uns entschieden auf Arabidopsis Zellkulturen. Wir Beschäftigten eine einstufige Methyl- Tert-Butyl-Ether, (MTBE) / Methanol/Wasser Extraktions-Verfahren, so dass die Charakterisierung von Proteinen (Pellet), Lipide (organische Phase) und hydrophilen Metaboliten (wässrige Phase)16 in einem einzigen Affinitätsreinigung Experiment. EV-Steuerleitungen wurden eingeführt, um Fehlalarme, z.B. Proteine binden an dem Tag allein auszuschließen. Als Proof of Concept wir markiert drei (von fünf) Nukleosid Diphosphat Kinasen präsentieren in Arabidopsis Genom (NDPK1-NDPK3). Unter anderem Erkenntnisse konnten wir nachweisen, dass NDPK1 mit Glutathion S interagiert-Transferase und Glutathion. Folglich konnten wir beweisen, dass Glutathionylation14NDPK1 ausgesetzt ist.
Zusammenfassend lässt sich sagen, die vorgestellte Protokoll ist ein wichtiges Werkzeug zur Charakterisierung von Protein-Protein und Protein-Small-Molecule Interaktion Netze und stellt einen großen Fortschritt gegenüber bestehenden Methoden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Naphthylacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N1641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64 protease inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AcTEV Protease</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>12575015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#160;Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBP Tag Antibody (SB19-C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-101595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>V5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTBE&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>138906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>136806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>232106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>12006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>202341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>69141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unimax 2010 Platform Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>5421002000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh (Wire diameter 34 &#181;M, thickness 55 &#181;M, open area 14%)</td>
			<td>Prosepa</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Funnel, 47 mm, 300 ml</td>
			<td>Restek</td>
			<td>KT953751-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Bottle Top 500 mL 0,2 &#181;M Pes St</td>
			<td>VWR International GmbH</td>
			<td>514-0340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 400</td>
			<td>Retsch GmbH</td>
			<td>207450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0969-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobicol &#34;&#34;Classic&#34;&#34; with 2 different screw caps without filters</td>
			<td>MoBiTec GmbH</td>
			<td>M1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (small) 35 &#181;M pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 &#38; M1053</td>
			<td>MoBiTec GmbH</td>
			<td>M513515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Tube Rotator SB 3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>Y550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary dishes for rotators SB 3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>Y555.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resprep 24-Port SPE Manifolds</td>
			<td>Restek&#160;</td>
			<td>26080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml</td>
			<td>Teknokroma</td>
			<td>TR-F034000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler&#160;Vials</td>
			<td>Klaus Trott Chromatographie-Zubeh&#246;r</td>
			<td>40 11 01 740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 LC Column</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>164534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>LC120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters&#160;</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 &#181;M, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg</td>
			<td>Waters&#160;</td>
			<td>186003533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>RK 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genedata Expressionist</td>
			<td>Genedata</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>NaN</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2 in 1: one-step affinity purification for the parallel analysis of protein-protein and protein-metabolite complexes

Zelluläre Prozesse werden durch Wechselwirkungen zwischen biologischen Molekülen wie Proteinen, Metaboliten und Nukleinsäuren geregelt. Während die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) keine Neuheit ist, bilden experimentelle Ansätze mit dem Ziel, endogene Protein-Metabolit Interaktionen (PMI) charakterisieren eine relativ neue Entwicklung. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das gleichzeitige Charakterisierung der PPI und PMI eines Proteins Wahl, bezeichnet als Köder erlaubt. Unser Protokoll wurde optimiert für Arabidopsis Zelle Kulturen und Affinitätsreinigung (AP) kombiniert mit der Massenspektrometrie (MS)-basierte Erkennung von Protein und Metaboliten. Kurz gesagt, sind transgene Arabidopsis-Linien, mit dem Ausdruck Köder Protein verschmolzen zu einem Affinität-Tag zunächst lysiert, um eine native zellulären Extrakt zu erhalten. Anti-Tag Antikörper werden verwendet, um die pull-down-Protein und Metabolit Partner des Proteins Köder. Die Affinität gereinigt-komplexe werden extrahiert, mit einer One-Step-Methyl- Tert-Butyl-Äther (MTBE) / Methanol/Wasser-Methode. Während Metaboliten in der polaren oder hydrophoben Phase zu trennen, können Proteine in das Pellet enthalten. Metaboliten und Proteine werden dann von Ultra-Performance liquid Chromatography-Massenspektrometrie (UPLC-MS oder UPLC-MS/MS) analysiert. Leer-Vektor (EV) Steuerleitungen werden verwendet, um Fehlalarme auszuschließen. Der große Vorteil unserer Protokoll ist, dass es ermöglicht die Identifizierung von Proteinen und Metaboliten Partnern ein Zielprotein parallel in der Nähe von physiologischen Bedingungen (Mobilfunk lysate). Die vorgestellte Methode ist einfach, schnell und leicht an biologische Systeme als Pflanze Zellkulturen angepasst werden kann.

In der ursprünglichen Studie wurden drei A. Thaliana NDPK Gene in Zellkulturen Aussetzung PSB-L unter der Kontrolle der konstitutiven 35 s-Promoter14 (Abbildung 1) überexprimiert. Tandem-Affinität-Tag war an entweder Carboxy oder amino-terminalen Ende eines Köder-Proteins fusioniert. Die komplexe Affinität gereinigt wurden MTBE/Methanol/Wasser-Extraktion16unterzogen. Affinität zog Proteinen und kleinen Molekülen wurden mit MS (Tabellen S2 und S3) identifiziert.
Um Fehlalarme zu beheben, wurden leere Proben verwendet, um kleine Molekül Verunreinigungen aus der Chemie- und Labor-Verbrauchsmaterialien auszuschließen. Darüber hinaus wurden Metaboliten und Proteine, die entweder einen Affinität Tag binden oder Harz allein entfielen mit EV Steuerleitungen. Zum Abrufen von wahren positiven, zweiseitige nicht gepaart Schülers t-Test und Benjamini & Hochberg false Discovery Rate wurde Korrektur angewandt, um Metaboliten (Tabelle S4) und Proteine (Tabelle S5) wesentlich bereichert, in der NDPKs AP zu identifizieren Experimente (N - und C-Terminal NDPKs markiert) im Vergleich zu den EV-Steuerleitungen (FDR < 0,1). Beachten Sie, dass in den früheren arbeiten wir Abwesenheit/Präsenz Kriterien, Protein und kleine Molekül Interaktoren abzugrenzen.
Repräsentative Ergebnisse erhalten für NDPK1, während auf Dipeptide, einer neuartigen Klasse der kleinen Molekül Regulierungsbehörden studierte in unserer Gruppe Metabolit Daten konzentrieren. Proteomic Analyse ergab 26 vermeintliche Protein-Partner des NDPK1. Durch weitere Filterung für Proteine, die gemeinsam im selben subzelluläre Raum als NDPK1 lokalisiert (Zytosol), die Liste verengt sich auf 13 mutmaßliche Protein Interaktoren. Unter den identifizierten Proteine waren Glutathion S-Transferase, zwei Dehnung Einleitung Faktoren, Tubulin und aconitate Hydratase. Metabolomic Analyse ergab vier Dipeptide Val-Leu, Ile-Glu Leu-Ile und Ile-Phe, die speziell Co eluiert mit NDPK1 (Abbildung 2). Beachten Sie, dass alle vier Dipeptide einen hydrophoben Rest in ihrem N-Terminus, was auf gemeinsame verbindliche Spezifität teilen.
Suchen Sie nach bekannten Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe wir identifiziert abgefragten 13 Proteine und vier Dipeptide gegen den Stich Datenbank25 (Abbildung 3). Mehrere Beobachtungen gemacht werden könnte: (i) keines der interagierenden wurde zuvor für NDPK1 gemeldet. (Ii) APX1 Ortholog wurde berichtet, dass Aldehyde Dehydrogenase Familienmitglied ALDH7B4, während der Einleitung Übersetzungsfaktor FBR12 mit einer anderen Übersetzung Einleitung Faktor kodiert durch das Gen AT2G40290 interagieren. (Iii) die identifizierten Dipeptide haben kein Protein Partner berichtet. Co eluierten Dipeptide wurden früher als alle abgerufenen pflanzlichem Eiweiß verbunden nicht gemeldet. Allerdings spielen sie eine wichtige Rolle in anderen Organismen: Leu-Ile, z. B.hat eine Neurotrophin-aktivierende Wirkung in einer menschlichen Zelle Zeile26. Beachten Sie, dass das Experiment nicht erlaubt die genaue Topologie des Systems zu identifizieren. Zum Beispiel ein Dipeptid kann direkt mit NDPK1 interagieren aber kann auch im Zusammenhang mit einem der Co gereinigter Proteine.
Zusammen genommen, unsere Ergebnisse zeigen, dass das festgelegte Verfahren, Einsatz von AP zusammen mit Massenspektrometrie, erleichtert die Identifizierung von Protein-Protein und Protein-Small-Molecule Interaktoren und hilft umfassende Informationen über generieren die Interaktom des Zielproteins.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> Abbildung 1: Schema des AP-MS-Workflow. (A) Vorbereitung einer native lösliche Fraktion aus pflanzlichen Zellkultur. (B) die nächsten Schritte in der AP-Prozedur. Nach dem Laden der Probe auf die Säule, bindet das Protein von Interesse (POI) verschmolzen zu einem TAP-Tag an der IgG-Antikörper auf die Agarose-Perlen immobilisiert. Waschen der Spalte erleichtert die Entfernung von ungebundenen Proteinen und Metaboliten. Nach der Durchführung entwicklelt Spaltung, sind POI Protein-Metabolit komplexe eluiert. (C) Trennung von komplexen in Protein und Metabolit Fraktion gefolgt von semi-quantitativen MS-Analyse. Teil dieser Figur wird von Luzarowski Et Al. 201714wiedergegeben. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> Abbildung 2: Dipeptide speziell Co eluierenden mit NDPK1. Durchschnittliche Intensität von vier Dipeptide Val-Leu (A), Ile-Glu (B), Leu-Ile (C)und Ile-Phe (D) in AP Experiment gemessen wurden aufgetragen. Alle vier Dipeptide zeigen deutliche Bereicherung in NDPK1 Proben im Vergleich zur Kontrolle der EV (Sternchen darstellen FDR < 0,1). Fehlerbalken darzustellen Standardfehler für 6 Messungen (3 Wiederholungen von N- und C-Terminal 3 markiert Proteine). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> Abbildung 3. Interaktion-Netzwerk aller Moleküle zusammen mit NDPK1, eluierenden abgefragt gegen Stich-Datenbank unter Berücksichtigung nur frühere experimentelle und Datenbank Beweise (Vertrauen > 0,2). Mehr Zuversicht zeigt höhere Chancen von Interaktion und errechnet sich anhand der hinterlegten Daten. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Tabelle S1. MaxQuant output-Tabelle "parameters.txt". Tabelle enthält Grenzwerte für die Identifizierung und Quantifizierung sowie Informationen über die verwendeten Datenbanken. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Tabelle S2. Ausgabe von Informationen aus MaxQuant Tabelle "proteinGroups.txt". Tabelle enthält eine Liste aller identifizierten Protein Gruppen, Intensitäten und zusätzliche Informationen wie Anzahl der einzigartigen Peptide und Partitur. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Tabelle S3. Ausgabedatei, die Analyse der polaren Metaboliten. Tabelle enthält eine Liste aller identifizierten Masse Features zeichnet sich durch spezifische m/Z, RT und Intensität. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Tabelle S4. Dipeptide in AP Proben gefunden, in denen NDPK1, NDPK2 oder NDPK3 als Köder verwendet wurden. Dipeptide im leeren Proben wurden aus der Liste ausgeschlossen. Zwei unabhängige Linien (gekennzeichnet in beiden N - oder C-Terminus) für jede NDPK wurden in dreifacher Ausführung ausgeführt. Schülers t-test und weitere Korrektur der p-Wert mit Benjamini & Hochberg Methode wurden verwendet, um deutlich bereichert interactor Partner des NDPKs zu bestimmen (FDR < 0,1). ΔRT errechnet sich in Bezug auf die Referenzverbindungen und Δppm in Bezug auf die Monoisotopic Masse in Metlin27gegeben gegeben. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Tabelle S5. Proteine, die gemeinsam mit NDPK1 gereinigt. Zwei unabhängige Linien (gekennzeichnet in beiden N - oder C-Terminus) für jede NDPK in dreifacher Ausfertigung ausgeführt wurden. Schülers t-test und weitere Korrektur der p-Wert mit Benjamini & Hochberg Methode wurden verwendet, um deutlich bereichert interactor Partner des NDPKs zu bestimmen (FDR < 0,1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Protein-Protein und Protein-Metabolit Interaktionen sind entscheidend für alle Zellfunktionen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das parallele Analyse dieser Interaktionen mit einem Protein der Wahl ermöglicht. Unser Protokoll wurde optimiert für die Anlage Zellkulturen und verbindet Affinitätsreinigung mit Massenspektrometrie-basierte Protein und Metabolit Erkennung.

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