Name: 2 in 1: one-step affinity purification for the parallel analysis of protein-protein and protein-metabolite complexes
Uploaded: 2018-08-06T13:30:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes at JoVE.com

ברצוננו להודות בחביבות פרופ ' ד ר לותאר Willmitzer בשל מעורבותו בפרוייקט, בדיונים פרודוקטיביים ולאחר השגחה מעולה. אנחנו אסירי תודה ד ר דניאל Veyel שעזרת עם מדידות MS פרוטיאומיה מבנית. אנחנו מעריכים מיכאליס Änne גברת מי סיפק לנו עזרה טכנית שלא תסולא בפז מדידות LC-MS. יתר על כן, ברצוננו להודות ד ר מוניקה Kosmacz, ד ר Ewelina Sokołowska שלהם לעזרה ומעורבות בעבודה על כתב היד המקורי, ולא כדי Weronika Jasińska לקבלת תמיכה טכנית.

<ol>
	<li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolites+as+global+regulators:+A+new+view+of+protein+regulation.">Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation.</a> Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).</li><li>Schlattner, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Function+of+Mitochondrial+Nm23-H4+Protein+in+Phosphotransfer+and+Intermembrane+Transfer+a+cardiolipin-dependent+switch.">Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).</li><li>Ram&#237;rez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+binding+regulates+cellular+localization+of+Parkinson's+disease-associated+LRRK2.">GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2.</a> Human Molecular Genetics. , ddx161 (2017).</li><li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules:+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Archives of Pharmacal Research. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li><li>Harding, M. W., Galat, A., Uehling, D. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor+for+the+immunosuppressant+FK506+is+a+cis-trans+peptidyl-prolyl+isomerase.">A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase.</a> Nature. 341 (6244), 758-760 (1989).</li><li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li><li>Manabe, Y., Mukai, M., Ito, S., Kato, N., Ueda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLAG+tagging+by+CuAAC+and+nanogram-scale+purification+of+the+target+protein+for+a+bioactive+metabolite+involved+in+circadian+rhythmic+leaf+movement+in+Leguminosae.">FLAG tagging by CuAAC and nanogram-scale purification of the target protein for a bioactive metabolite involved in circadian rhythmic leaf movement in Leguminosae.</a> Chemical Communications. 46 (3), 469-471 (2010).</li><li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery.">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).</li><li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+In+vivo+Metabolite-Protein+Interactions+by+Large-Scale+Systematic+Analyses.">Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses.</a> Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).</li><li>Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protocol+for+the+purification+and+characterization+of+water-soluble+complexes+of+affinity-tagged+proteins+and+lipids.">A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).</li><li>Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+in+vivo+metabolite-protein+interactions+revealed+by+large-scale+systematic+analyses.">Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses.</a> Cell. 143 (4), 639-650 (2010).</li><li>Veyel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+detection+of+protein-small+molecule+complexes+suggests+extensive+metabolite+regulation+in+plants.">System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li><li>Luzarowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+with+metabolomic+and+proteomic+analysis+unravels+diverse+roles+of+nucleoside+diphosphate+kinases.">Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases.</a> Journal of Experimental Botany. , (2017).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+interactomics+reveals+a+complex+core+cell+cycle+machinery+in+Arabidopsis+thaliana.">Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular systems biology. 6 (1), 397 (2010).</li><li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+formula+annotation+of+polar+and+lipophilic+metabolites+using+13C,+15N+and+34S+isotope+labelling,+in+combination+with+high-resolution+mass+spectrometry.">Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using 13C, 15N and 34S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry.</a> The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+transcription+factor+complexes+from+Arabidopsis+cell+suspension+cultures+by+tandem+affinity+purification.">Isolation of transcription factor complexes from Arabidopsis cell suspension cultures by tandem affinity purification.</a> Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 195-218 (2011).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tandem+affinity+purification-based+technology+platform+to+study+the+cell+cycle+interactome+in+Arabidopsis+thaliana.">A tandem affinity purification-based technology platform to study the cell cycle interactome in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6 (7), 1226-1238 (2007).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. -. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301 (2016).</li><li>Hooper, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUBAcon:+a+consensus+algorithm+for+unifying+the+subcellular+localization+data+of+the+Arabidopsis+proteome.">SUBAcon: a consensus algorithm for unifying the subcellular localization data of the Arabidopsis proteome.</a> Bioinformatics. 30 (23), 3356-3364 (2014).</li><li>Katajamaa, M., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+for+mass+spectrometry-based+metabolomics.">Data processing for mass spectrometry-based metabolomics.</a> Journal of Chromatography A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STITCH+5:+augmenting+protein-chemical+interaction+networks+with+tissue+and+affinity+data.">STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data.</a> Nucleic Acids Research. 1277, (2015).</li><li>Tanaka, K. -. i., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dipeptidyl+compounds+ameliorate+the+serum-deprivation-induced+reduction+in+cell+viability+via+the+neurotrophin-activating+effect+in+SH-SY5Y+cells.">Dipeptidyl compounds ameliorate the serum-deprivation-induced reduction in cell viability via the neurotrophin-activating effect in SH-SY5Y cells.</a> Neurological Research. 34 (6), 619-622 (2012).</li><li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=METLIN:+A+metabolite+mass+spectral+database.">METLIN: A metabolite mass spectral database.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 27, 747-751 (2005).</li><li>Bhattacharyya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+protein-protein+interactions+perturb+E.+coli+metabolome+and+cause+gene+dosage+toxicity.">Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול הציג מאפשר זיהוי מקבילי של מתחמי PP ו- PM של חלבון המטרה. מ שיבוט על התוצאות הסופיות, ניתן להשלים את הניסוי קצת כמו 8-12 שבועות. AP מלאה אורכת כ 4-6 h עבור קבוצה של 12 עד 24 דגימות, עיבוד פרוטוקול שלנו מתאימים לניתוח תפוקה באמצע.
הפרוטוקול, למרות להיות בסך הכל פשוטה, יש מספר שלבים קריטיים. (i) כמות מספקת של חלבון קלט וחרוזים זיקה חיוני להגיע טווח דינמי של המטבוליט זיהוי. פירוק התא יעיל לכן צעד מכריע בהליך. התשואות המסכן חלבון יכול להיות תוצאה של pulverization לא מספקת של החומר או של שיוצרת יחס פירוק-מאגר/חומר. (ii) להקפיד כי ריאגנטים בשימוש הם ידידותיים MS. חומרי ניקוי חזקים, גליצרול או כמויות מוגזמות של מלח יש להימנע ככל מתערבות MS זיהוי. (iii) חרוזים Agarose לא צריך להיות יבשים יתר במהלך שטיפת שלבים, כאשר משתמש של יריעה ואקום זה חשוב להחיל קצב זרימה איטית כדי לא כדי להרוס את החרוזים או להשפיע על יציבות מורכבים.
ישנם כמה שינויים אפשריים חשובים בפרוטוקול הציג: (i) נשתמש האמרגן CaMV35S המכונן כדי למקסם את כמות החלבון פיתיון. ביטוי, בעוד מאוד שימושי, ניתן להיות השפעה רצינית על הומאוסטזיס תא28 , להוביל להיווצרות אינטראקציות לא רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. ביטוי של חלבונים מתויגים באמצעות היזמים מקורי שבו האפשר רקע אובדן-של-פונקציה נחשב נעלה לאחזור interactors הביולוגית האמיתית. חלבונים בדרך כלל לא באה לידי ביטוי בתרבויות תא צמח, צמח רקע יוכיח הדרושות כדי לזהות interactors רלוונטיים. (ii) בעת עבודה עם קרום חלבונים, המאגר פירוק צריך להיות בתוספת של דטרגנט התואמים ל- MS. (iii) הקדמה של שלב טיהור זיקה שני יכול לשפר שווא-תוצאות חיוביות ליחס חיובי true, לבטל את הצורך פקדים EV29. תג טנדם הרומן עם שני אתרים פרוטאז עצמאית-המחשוף מציג חלופה אטרקטיבית השלב גודל-הדרה כרומטוגרפיה שנוספו על-ידי. et al. 2014 מיאדה11, זה מפרך וגם זמן רב.
החיסרון החמורה ביותר של נקודת הגישה הוא שיעור גבוה של תוצאות חיוביות שגויות. הסיבות הן רבות. ביטוי מכוננת כבר הוזכר. מקור נוסף של אינטראקציות לא רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, אלא אם כן עובד עם organelles מבודד, הוא הכנת כל-תא lysates המכיל תערובת של חלבונים ושל מטבוליטים של תאים subcellular שונים. לוקליזציה subcellular אמור לשמש כדי לבצע סינון עבור interactors אמיתי. ובכל זאת, הרוב המכריע של תוצאות חיוביות שגויות כתוצאה איגוד לא ספציפי בין חלבונים שרפים agarose. הקדמה של שלב טיהור שני, כפי שתוארה לעיל, מציעה את הפתרון הטוב ביותר לבעיה, עם זאת מגיע על חשבון זמן ותפוקת. יתר על כן, אינטראקציה חלשה עלול ללכת לאיבוד כמו הפרוטוקול מתארך. אזהרה נוספת של AP הוא למרות מידע מקיף שמספק לגבי interactome של חלבון המטרה, המבדילים בין היעדים הישירים והעקיפים של החלבון פתיונים הוא בלתי אפשרי. גישות ריאקציה דו-מולקולרית יישוב נדרשים לאשר אינטראקציות.
AP בשילוב עם גליקומיקס מבוססי MS שימש ללמוד חלבון-מתחמי cerevisiae ס12. עבודה זו, יחד עם שלנו תצפית קודמות13 , באופן דומה כדי שומנים, תרכובת פולאר polar למחצה להישאר מאוגד ל קומפלקסי חלבון מבודד תאית lysates, סיפק והיערכות מושגית עבור פרוטוקול שהוצגו. פרוטוקול שלנו מאופיין על ידי שלוש נקודות ייחודיות: (i) לעומת זאת כדי השמרים לעבוד12, הוא מדגים כי AP מתאים מאחזר לא רק חלבון הידרופובי אבל גם הידרופילית ליגנדים. (ii) בהצגת נוהל חילוץ 3-in-one, AP יחיד ניתן ללמוד interactors חלבון ו מטבוליט של החלבון פיתיון. (iii). שינינו את פרוטוקול לשתול תאים.
המאמצים העתידיים יתמקד ביצירת תג טנדם הרומן עם שני אתרים פרוטאז עצמאית-המחשוף. אנחנו רוצים גם לחקור את התאמתו של הפרוטוקול כדי נמוך-שפע מולקולות קטנות כמו הורמונים צמחיים.

השיטה המתוארים כאן מטרות על הזיהוי של המטבוליט וחלבון השותפים של חלבון של בחירה בתנאים lysate הסלולר ליד -ב- vivo . זה כבר העריכו שיש רבים מטבוליטים יותר מאשר מאופיין היום של פונקציית רגולציה חשוב1. מטבוליטים יכול לשמש מתגים ביולוגי, לשנות את הפעילות, פונקציונליות, ו/או לוקליזציה של שלהם קולטן חלבונים2,3,4. בעשור האחרון מספר שיטות פריצת דרך, המאפשרת זיהוי של PMI ויוו או בתנאים ליד -ב- vivo , כבר מפותחת5. גישות זמין ניתן להפריד לשתי קבוצות. הקבוצה הראשונה כוללת טכניקות להתחיל עם פיתיון ידוע-מטבוליט על מנת ללכוד חלבון הרומן שותפים. שיטות כוללות זיקה כרומטוגרפיה6, סמים זיקה היעד מגיב-יציבות assay7, כימותרפיה-פרוטאומיקס8ו פרוטאום תרמית פרופיל9. הקבוצה השנייה מורכבת שיטה אחת שמתחילה חלבון ידוע על מנת לזהות מולקולה קטנה ליגנדים10,11.
AP בשילוב עם lipidomics מבוססי MS שימש כדי לנתח חלבון-השומנים מתחמי האפייה12. כנקודת התחלה, המחברים השתמשו זני שמרים לבטא 21 אנזימים המעורבים ביוסינטזה ergosterol, 103 kinases דבוקה הוא לטיהור טנדם-זיקה (ברז) תג. 70% של האנזימים ו-20% kinases נמצאו לאגד ליגנדים הידרופובי שונים, ושופך אור לתוך הרשת אינטראקציית חלבון מורכב-השומנים.
בעבר, יכולתי נדגים, באופן דומה כדי שומנים, תרכובת פולאר polar למחצה גם להישאר מאוגד ל קומפלקסי חלבון מבודד lysates הסלולרית13. על סמך ממצאים אלה, החלטנו למטב את AP שיטת שפורסם בעבר10,11 תאי צמחים, תרכובות הידרופילית14. למטרה זו, השתמשנו ברז וקטורים, מתוארת על ידי ואן Leene. ואח 2010, משתמשים בהצלחה במפעל PPI מחקרים15. כדי לקצר את משך הזמן הנדרש להשגת שורות מהונדס, החלטנו על תרביות תאים תודרנית. אנחנו מועסקים מתיל טרטצעד אחד-בוטיל אתר, (MTBE) / מתנול/מים החילוץ שיטה, המאפשר אפיון חלבונים (גלולה), ליפידים (שלב אורגני) ו הידרופילית מטבוליטים (פאזה מימית)16 יחיד זיקה-טיהור הניסוי. EV בקרת קווי הוכנסו כדי לא לכלול תוצאות חיוביות שגויות, כגון חלבונים מחייב את התג לבד. כמו הוכחת לנו מתויגות שלוש (מתוך חמש) nucleoside diphosphate kinases להציג הגנום תודרנית (NDPK1-NDPK3). בין השאר, אנחנו יכול להדגים כי NDPK1 אינטראקציה עם גלוטתיון S-טרנספראז גלוטטיון. כתוצאה מכך נוכל להוכיח כי NDPK1 הוא נתון glutathionylation14.
לסיכום, פרוטוקול הציג היא כלי חשוב עבור אפיון חלבון ורשתות אינטראקציית חלבון-מולקולה קטנה ומהווה התקדמות גדולה על פני שיטות קיימות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Naphthylacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N1641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64 protease inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AcTEV Protease</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>12575015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#160;Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBP Tag Antibody (SB19-C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-101595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>V5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTBE&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>138906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>136806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>232106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>12006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>202341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>69141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unimax 2010 Platform Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>5421002000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh (Wire diameter 34 &#181;M, thickness 55 &#181;M, open area 14%)</td>
			<td>Prosepa</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Funnel, 47 mm, 300 ml</td>
			<td>Restek</td>
			<td>KT953751-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Bottle Top 500 mL 0,2 &#181;M Pes St</td>
			<td>VWR International GmbH</td>
			<td>514-0340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 400</td>
			<td>Retsch GmbH</td>
			<td>207450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0969-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobicol &#34;&#34;Classic&#34;&#34; with 2 different screw caps without filters</td>
			<td>MoBiTec GmbH</td>
			<td>M1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (small) 35 &#181;M pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 &#38; M1053</td>
			<td>MoBiTec GmbH</td>
			<td>M513515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Tube Rotator SB 3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>Y550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary dishes for rotators SB 3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>Y555.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resprep 24-Port SPE Manifolds</td>
			<td>Restek&#160;</td>
			<td>26080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml</td>
			<td>Teknokroma</td>
			<td>TR-F034000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler&#160;Vials</td>
			<td>Klaus Trott Chromatographie-Zubeh&#246;r</td>
			<td>40 11 01 740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 LC Column</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>164534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>LC120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters&#160;</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 &#181;M, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg</td>
			<td>Waters&#160;</td>
			<td>186003533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>RK 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genedata Expressionist</td>
			<td>Genedata</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>NaN</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2 in 1: one-step affinity purification for the parallel analysis of protein-protein and protein-metabolite complexes

תהליכים תאיים מוסדרים על ידי אינטראקציות בין מולקולות ביולוגיות כגון חלבונים, מטבוליטים ו חומצות גרעין. אמנם אין חידוש החקירה של אינטראקציות חלבון (PPI), גישות ניסיוניות מכוון לאפיון אינטראקציות חלבון-מטבוליט אנדוגני (PMI) מהווים התפתחות למדי. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר אפיון סימולטני של PPI, PMI של חלבון של בחירה, המכונה פיתיון. פרוטוקול שלנו היה מותאם עבור תא תודרנית תרבויות, והוא משלב זיקה טיהור (AP) עם ספקטרומטר מסה (MS)-המבוסס על זיהוי חלבונים, מטבוליט. בקיצור, קווים תודרנית מהונדס, המבטאים חלבונים פיתיון דבוקה תג קירבה, הם קודם lysed להשיג תמצית הסלולר מקורית. נוגדנים אנטי-תג משמשים כדי להוריד את השותפים חלבון ו מטבוליט של החלבון פיתיון. מתחמי מטוהרים זיקה מופקים באמצעות מתיל טרטצעד אחד-בוטיל אתר (MTBE) / מתנול/מים בשיטה. בעוד מטבוליטים להפריד את קוטבי או השלב הידרופוביות, ניתן למצוא חלבונים בגדר. מטבוליטים והן חלבונים מכן נותחו על ידי אולטרה-ביצועים נוזלי כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (UPLC-MS או UPLC-MS/MS). ריק-וקטור (EV) בקרת קווי משמשים כדי לא לכלול תוצאות חיוביות שגויות. היתרון העיקרי של פרוטוקול שלנו הוא שהם מאפשרים זיהוי של שותפים חלבון ו מטבוליט של חלבון המטרה במקביל בתנאים ליד-פיזיולוגיים (סלולריים lysate). השיטה הציג היא פשוטה, מהירה, ניתן להתאים בקלות למערכות ביולוגיות חוץ תרביות תאים הצמח.

במחקר המקורי, בשלושה גנים לבנה א NDPK היו overexpressed בתרבויות PSB-L תא ההשעיה תחת השליטה של יזם 35S מכוננת14 (איור 1). תג קירבה טנדם שהיה מחובר מקצוות carboxy - או אמינו-מסוף חלבון פיתיון לגבו. מתחמי מטוהרים זיקה היו נענשים MTBE/מתנול/מים החילוץ16. משך-זיקה חלבונים ומולקולות קטנות אותרו באמצעות MS (טבלאות S2, S3).
לתיקון תוצאות חיוביות שגויות, דגימות ריק שימשו כדי לא לכלול מזהמים מולקולה קטנה מן כימיקלים מעבדה מתכלים. יתר על כן, מטבוליטים וחלבונים לאגד גם תג קירבה או שרף לבד היה אליבי באמצעות קווי הבקרה EV. כדי לאחזר תוצאות חיוביות נכון, דו-זנבית בלתי-זוגי של התלמיד במבחן t וקצב בנימיני & הוכברג גילוי שקר הוחל תיקון כדי לזהות מטבוליטים (טבלה S4), חלבונים (טבלה S5) באופן משמעותי מועשר בנקודת הגישה NDPKs ניסויים (N - ו C-סופני מתויג NDPKs) לעומת הקווים שליטה EV (פד ר < 0.1). שימו לב כי עבודה קודמות, נהגנו היעדרות/נוכחות קריטריונים ניסחו interactors חלבון ומולקולה קטנה.
נציג תוצאות ניתנות עבור NDPK1, בעוד מטבוליט נתונים להתמקד dipeptides, מחלקה הרומן של הרגולטורים מולקולה קטנה למד בקבוצה שלנו. ניתוח פרוטיאומיה מבנית גילה 26 שותפים חלבון בשם של NDPK1. על-ידי סינון נוסף חלבונים משותפת לשפות אחרות בתא subcellular אותו בתור NDPK1 (ציטוזול), הרשימה צמצמנו 13 חלבון בשם interactors. בין החלבונים שזוהו היו גלוטתיון S-טרנספראז, התארכות שני גורמים חניכה, טובולין, aconitate hydratase. ניתוח Metabolomic גילה ארבעה dipeptides ואל-Leu באיל-Glu, Leu-איל, איל-Phe זה במיוחד משותפת eluted עם NDPK1 (איור 2). שים לב כי כל dipeptides ארבע לשתף משקע הידרופובי ב שלהם אמיני, רומז משותפת מחייב ירידה לפרטים.
לחפש מתחמי חלבון, חלבון-מטבוליט ידוע לנו 13 המאוחזרים לזהות חלבונים ו dipeptides ארבעה נגד תפר מסד25 (איור 3). מספר תצפיות עשוי להיות: (i) אף אחד interactors דווח קודם לכן עבור NDPK1. (ii) APX1 ortholog דווח לקיים אינטראקציה עם אלדהיד דהידרוגנאז משפחה ALDH7B4, תוך תרגום חניכה פקטור FBR12 עם תרגום חניכה גורם נוסף מקודדת על ידי הגן AT2G40290. (iii) dipeptides מזוהה לא דיווחו על חלבון שותפים. Dipeptides eluted משותפת לא דווחו קודם הקשורות אל כל חלבון צמחי שאוחזרו. עם זאת, הם תפקיד חשוב אורגניזמים אחרים: Leu-איל, למשל, יש אפקט neurotrophin-מפעיל קו26תאים אנושיים. שימו לב כי הניסוי אינו מאפשר לזהות את הטופולוגיה המדויק של המערכת. לדוגמה, dipeptide ייתכן אינטראקציה ישירה עם NDPK1 אך עשויות להיות קשורות היטב לכל אחד החלבונים משותפת מטוהרים.
יחדיו, התוצאות שלנו להראות כי ההליך הוקמה, העסקת AP יחד עם ספקטרומטר מסה, מאפשר זיהוי של חלבון, חלבון-מולקולה קטנה interactors, מסייע ליצור מידע נרחב אודות interactome של החלבון היעד.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> איור 1. ערכה של זרימת עבודה AP-MS. (א) הכנה של השבר מסיסים מקורית של תרבית תאים. השלבים הבאים (ב') במסגרת ההליך AP. לאחר טעינת המדגם אל העמודה, נקשר החלבון עניין (פוי) התמזגו לתגית ברז הנוגדן IgG ותשמרו על החרוזים agarose. כביסה של העמודה מקלה על הסרת חלבונים לא מאוגד מטבוליטים. לאחר ביצוע AcTEV המחשוף, מתחמי חלבון-מטבוליט פוי הם eluted. (ג) ההפרדה של מתחמי לתוך שבר חלבון ו מטבוליט שלאחריה יבוא ניתוח MS הכמותיים למחצה. חלק איור זה מתרבה מ. ואח 2017 Luzarowski14. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> באיור 2. במיוחד eluting יחד עם NDPK1 dipeptides. עוצמות ממוצע של ארבעה dipeptides ואל-Leu (א), איל-Glu (B), Leu-איל (ג)ואיל-Phe (D) שנמדד בניסוי AP שורטטו. כל dipeptides ארבע להראות העשרה משמעותי בדגימות NDPK1 לעומת שליטה EV (כוכביות מייצגים רוזוולט < 0.1). קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן עבור מדידות 6 (3 ושכפול של N - ו 3 של C-סופני מתויג חלבונים). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> איור 3. אינטראקציה עם רשת של כל המולקולות eluting בשיתוף עם NDPK1, שאילתה מול מסד הנתונים תפר שוקל רק הקודם ניסיוני, עדויות של מסד הנתונים (ביטחון > 0.2). בטחון גבוהה יותר מצביעה על סיכון גבוה יותר של אינטראקציה, מחושב בהתבסס על הנתונים הופקדו. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
שולחן S1. MaxQuant פלט טבלת "parameters.txt". העניינים כולל ערכי סף עבור זיהוי, כימות, כמו גם מידע אודות מסדי הנתונים המשמש. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
שולחן S2. מידע MaxQuant פלט טבלת "proteinGroups.txt". הטבלה מכילה רשימה של כל קבוצות שזוהה חלבון, עוצמות, פרטים נוספים כגון מספר ייחודי פפטידים והניקוד. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
שולחן S3. קובץ פלט ובו ניתוח של מטבוליטים קוטבי. הטבלה מכילה רשימה של כל התכונות המוני מזוהה המאופיין מ ספציפי/z, RT ועוצמה. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
שולחן S4. Dipeptides נמצאו בדגימות AP אשר NDPK1, NDPK2 או NDPK3 שימשו בתור פיתיון. Dipeptides נוכח בדגימות ריק לא נכללו ברשימה. שני עצמאית קווים (מתויג ב או או C-אמיני) עבור כל NDPK היו להפעיל בשלושה עותקים. הסטודנט t-מבחן ולמנף תיקון של p-ערך באמצעות בנימיני & שיטה הוכברג שימשו כדי לקבוע באופן משמעותי מועשר שותפים אינטראקטור של NDPKs (פד ר < 0.1). בהתחשב ΔRT מחושבת ביחס הפניה תרכובות של Δppm ביחס monoisotopic המוני נתון Metlin27. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
שולחן S5. חלבונים מטוהרים בשיתוף עם NDPK1. שני עצמאית קווים (מתויג ב או או C-אמיני) עבור כל NDPK נוהלו דולר. הסטודנט t-מבחן ולמנף תיקון של p-ערך באמצעות בנימיני & שיטה הוכברג שימשו כדי לקבוע באופן משמעותי מועשר שותפים אינטראקטור של NDPKs (פד ר < 0.1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes at JoVE.com

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

צעד אחד ראפיד סינתזה האנזימטית-כל מימית טיהור של אנלוגים trehalose

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

גישה G-quadruplex זיקה-DNA עבור טיהור של enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...