Name: homochronic transplantation of interneuron precursors into early postnatal mouse brains
Uploaded: 2018-06-08T14:30:00
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Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (K99MH104595) e il programma di ricerca intramurale NICHD a T.J.P. Ringraziamo Gord Fishell, nel cui laboratorio questo approccio originalmente è stato stabilito.

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte secondo le linee guida del National Institutes of Health e sono state approvate dal NICHD Animal Care e uso Comitato (ACUC). Il protocollo descritto di seguito utilizza NKX 2.1-CreC / +; Ai9+ /- cuccioli per la raccolta dei precursori Interneurone MGE-derivato, ma può essere eseguita su qualsiasi linea di topo reporter fluorescente desiderata. Sia maschili che femminili primi topi postnatali (P0-P2) sono stati utilizzati indiscriminatame...

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	<li>Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy+as+a+neurodevelopmental+disorder.">Epilepsy as a neurodevelopmental disorder.</a> Front Psychiatry. 3 (19), (2012).</li><li>Takano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+Dysfunction+in+Syndromic+Autism:+Recent+Advances.">Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances.</a> Dev Neurosci. , (2015).</li><li>Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatial+bias+for+the+origins+of+interneuron+subgroups+within+the+medial+ganglionic+eminence.">A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence.</a> Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).</li><li>Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+bias+in+the+mitotic+origins+of+somatostatin-+and+parvalbumin-expressing+interneuron+subgroups+and+the+chandelier+subtype+in+the+medial+ganglionic+eminence.">Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence.</a> Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).</li><li>Petros, T. J., Bultje, R. 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C., Mayer, C., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+interneuron+specification:+the+juncture+of+genes,+time+and+geometry.">Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry.</a> Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).</li><li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+cell+types+are+fit+to+function.">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li><li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons.">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li><li>Mi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+emergence+of+cortical+interneuron+diversity+in+the+mouse+embryo.">Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo.</a> Science. 360 (6384), 81-85 (2018).</li><li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain.">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).</li><li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice.">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).</li><li>De la Cruz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+progenitors+attenuate+the+power+of+acute+focal+ictal+discharges.">Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges.</a> Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).</li><li>Gilani, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+precursor+transplants+in+adult+hippocampus+reverse+psychosis-relevant+features+in+a+mouse+model+of+hippocampal+disinhibition.">Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).</li><li>Larimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caudal+Ganglionic+Eminence+Precursor+Transplants+Disperse+and+Integrate+as+Lineage-Specific+Interneurons+but+Do+Not+Induce+Cortical+Plasticity.">Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity.</a> Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).</li><li>Martinez-Cerdeno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+MGE+precursor+cells+grafted+into+adult+rat+striatum+integrate+and+ameliorate+motor+symptoms+in+6-OHDA-lesioned+rats.">Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).</li><li>Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+Nkx2.1-lineage+cells+in+the+mouse+telencephalon.">Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon.</a> J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).</li><li>Thompson, L., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+differentiation,+and+connectivity+of+ventral+mesencephalic+dopamine+neurons+following+transplantation.">Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation.</a> Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).</li><li>Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+cell+survival+in+mouse+brain+can+be+improved+by+co-transplantation+of+helper+cells+expressing+bFGF+under+doxycycline+control.">Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control.</a> Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).</li></ol>

Un aspetto critico di questo protocollo è massimizzare le possibilità di sopravvivenza delle cellule. Garantire che i tessuti e le cellule siano sempre in ghiaccio freddo carboxygenated sACSF è necessario promuovere la sopravvivenza delle cellule. Ciò richiede una strategia di dissociazione per ridurre al minimo la lunghezza del tempo che le cellule spendono in varie soluzione e all'esterno dell'ambiente di cervello e di dissezione efficiente. A seconda del numero di regioni del cervello essere sezionato e trapiantat...

La funzione corticale appropriata richiede un equilibrio tra neuroni di proiezione eccitatori e inibitori GABAergici, una popolazione estremamente eterogenea con morfologie distinte, proprietà elettrofisiologiche, connettività e neurochimici marcatori. Sviluppo anormale e funzione di interneuroni (e sottogruppi specifici Interneurone) è stato collegato a pathobiology di disturbi psichiatrici come la schizofrenia, autismo ed epilessia1,2,3. Inoltre, molti geni implicati in questi disordini del cervello sono fortemente arricchiti in interneuroni giovane4. Così, una maggiore comprensione dei meccanismi che regolano la maturazione e la determinazione di destino Interneurone è necessaria per comprendere lo sviluppo normale e potenziali eziologie delle numerose malattie del cervello.
Interneuroni del forebrain nascono principalmente da due strutture embrionali transitorie, le eminenze gangliare mediale e caudale (MGE e CGE, rispettivamente). Queste cellule postmitotic (precursori Interneurone) quindi subire una fase prolungata migrazione tangenziale per disperdere tutto il telencefalo dove si integrano in una vasta gamma di circuiti. Interneuroni MGE-derivati sono costituiti da tre sottogruppi in gran parte non sovrapposte, neurochemically definiti: veloce chiodare interneuroni parvalbumina (PV+), non-fast chiodare interneuroni della somatostatina (SST+) e tardi chiodare un neurone nitrico interneuroni ossido di sintetasi (nNOS+) che costituiscono le cellule hippocampal di neurogliaform ed edera. Numerosi laboratori hanno identificato parecchi meccanismi all'interno di MGE che regolano le decisioni iniziali destino in PV+ o SST + interneuroni, compresi gradienti spaziali di morfogeni, data di nascita dei precursori Interneurone e la modalità di divisione neurogena 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. è stato proposto che interneuroni inizialmente differenziano in 'Cardinale classi' e poi progressivamente maturano in 'definitive classi' come essi interagiscono con il loro ambiente11. La prova recente indica che alcuni sottotipi di Interneurone maturo possono essere geneticamente hardwired come queste cellule diventano postmitotic in eminenze gangliare, che indica che presto definiti programmi genetici intrinseci possono svolgere un ruolo più importante rispetto al passato apprezzata12,13. Tuttavia, la questione chiave di come l'intrinseci programmi genetici interagiscono con stimoli ambientali alla differenziazione di unità in sottotipi distinti Interneurone rimane in gran parte inesplorata.
Numerosi studi sono trapiantate cellule embrionali MGE direttamente in una varietà di regioni del cervello, con i risultati di consenso che innestano le cellule maturo e il rilascio di GABA per inibire generalmente il locale circuiti endogeni14,15, 16,17,18,19. Queste promettenti osservazioni hanno generato notevole interesse nell'utilizzo di cellule staminali umane pluripotenti indotte (hIPSC)-derivato interneuroni per trattare una varietà di malattie del cervello. Tuttavia, molto pochi di questi studi valutare se queste cellule innestate maturano in tipi previsti di interneuroni maturi, un componente critico quando uno pensa di approcci traslazionali.
Per affrontare come ambiente influenza la Interneurone differenziazione e maturazione, una strategia è stata ideata per trapiantare precursori immaturi Interneurone in nuovi ambienti di cervello al fine di esaminare se innestate interneuroni adottano funzionalità dell'host ambiente o conservano le caratteristiche del donatore ambiente20. MGE trapianti non sono adatti per affrontare questa domanda perché il MGE contiene una popolazione mista di Interneurone e cellule di proiezione GABAergici che disperdono nel corso di numerose regioni di cervello21. Senza sapere dove queste cellule MGE avrebbero migrato, uno non può pienamente valutare come questi trapianti sono colpiti dall'ambiente del cervello. Raccogliendo i precursori Interneurone timepoints postnatale precoce, questo problema è aggirato con l'ottenimento di cellule immature che hanno completato la loro migrazione e raggiunto la loro destinazione regione del cervello, ma hanno un'interazione minima con l'ambiente. Focalizzando l'attenzione sulle specifiche caratteristiche di interneuroni che sono differenzialmente espressi tra regioni distinte del cervello, si può quindi determinare come l'ambiente host cambia proprietà Interneurone. L'approccio generale descritto in questo protocollo dovrebbe essere applicabile a qualsiasi investigatore che vuole esaminare come i giovani neuroni si comportano quando ha sfidato in un nuovo ambiente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:776px;" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">S7653</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Glucose</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sucrose</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Brain Matrices</td>
			<td style="width:203px;">Roboz</td>
			<td style="width:136px;">SA-2165</td>
			<td>Only needed if harvesting striatum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fine point Dumont Forceps</td>
			<td style="width:203px;">Roboz</td>
			<td style="width:136px;">RS-4978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microdissecting scissors</td>
			<td style="width:203px;">Roboz</td>
			<td style="width:136px;">RS-5940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Razor blades</td>
			<td style="width:203px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:136px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:203px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:136px;">1367820C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Nanoject III</td>
			<td style="width:203px;">Drummond</td>
			<td style="width:136px;">3-000-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Manual Manipulator w/ stand</td>
			<td style="width:203px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:136px;">M3301R/M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">5 ml round bottom plastic tubes</td>
			<td style="width:203px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:136px;">149591A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">60 mm Petri dishes</td>
			<td style="width:203px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:136px;">12556001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">100 mm Petri dishes</td>
			<td style="width:203px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:136px;">12565100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Pronase</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:203px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:136px;">16140063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">DNase I</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Celltrics 50um filters</td>
			<td style="width:203px;">Sysmex</td>
			<td style="width:136px;">04-0042327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:203px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:136px;">15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:203px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:136px;">02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homochronic transplantation of interneuron precursors into early postnatal mouse brains

Maturazione e la determinazione di destino neuronale richiede un gioco intricato tra programmi genetici e segnali ambientali. Tuttavia, districare i ruoli di intrinseca vs estrinseche meccanismi che regolano questo processo di differenziazione è un enigma per tutti i neurobiologi inerente allo sviluppo. Questo problema è amplificato per interneuroni GABAergici, una popolazione incredibilmente eterogenee delle cellule che è nato da strutture embrionali transitorie e sottoposti a una prolungata fase migratoria per disperdere tutto il telencefalo. Per esplorare come i diversi ambienti di cervello influenzano interneurone destino e maturazione, abbiamo sviluppato un protocollo per la raccolta dei precursori Interneurone immaturo fluorescente contrassegnati da regioni specifiche del cervello in topi neonati (P0-P2). A questa età, migrazione Interneurone è quasi completa e queste cellule risiedono nei loro ambienti di riposo finale con relativamente poca integrazione sinaptica. Dopo il prelievo delle soluzioni di singola cellula tramite citometria a flusso, questi precursori Interneurone sono trapiantati in P0-P2 wildtype postnatali cuccioli. Eseguendo entrambi omotope (per esempio, corteccia di corteccia) o eterotopica (ad es., corteccia di ippocampo) trapianti, si può valutare come impegnativo immaturi interneuroni in nuovi ambienti di cervello colpisce il loro destino, la maturazione e l'integrazione di circuito. Cervelli possono essere raccolte in topi adulti e analizzati con una vasta gamma di analisi posthoc su cellule innestate, compreso immunohistochemical, elettrofisiologici e transcriptional profiling. Questo approccio generale fornisce gli investigatori con una strategia di test come distinti ambienti di cervello possono influenzare numerosi aspetti dello sviluppo del neurone e identificare se caratteristiche specifiche di un neurone sono principalmente guidate da programmi genetici hardwired o stimoli ambientali.

Questo protocollo viene illustrato come raccogliere regioni specifiche del cervello dal cervello postnatale precoce (Figura 1-2), raccogliere dissociazioni singola cella dei precursori Interneurone e trapianto di queste cellule in varie regioni del cervello in ingenuo WT cuccioli postnatali (Figura 3). Per l'analisi posthoc, cervelli che hanno ricevuto gli innesti Interneurone precursore sono state raccolte tra P...

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Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Sfidando i neuroni giovani in nuove regioni del cervello possa rivelare importanti intuizioni come l'ambiente scolpisce maturazione e destino neuronale. Questo protocollo descrive una procedura per raccogliere precursori Interneurone da regioni specifiche del cervello e trapiantarli o homotopically o heterotopically nel cervello dei cuccioli postnatali.

Homochronic trapianto di precursori Interneurone in cervelli di topo postnatale precoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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development when ...

Ricerca

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High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Imaging ad alta risoluzione confocale della barriera sangue - cervello: Imaging, ricostruzione 3D e quantificazione di transcitosi

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica in cellule striatali di cervelli di topo neonatale

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Cryosectioning simultanea di più cervelli roditore

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Trapianto di progenitori interneuroni corticali chemiogeneticamente ingegnerizzati nei primi cervelli dei topi postnatali

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purificazione della Prominin-1- Cellule staminali dal cervelletto del topo postnatale

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...