Name: calorespirometry: a powerful, noninvasive approach to investigate cellular energy metabolism
Uploaded: 2018-05-31T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism at JoVE.com

Dette arbejde var delvis finansieret af National Science Foundation grant CHE-160944 til Mary E. Konkle og Michael A. Menze.

1. cellekultur
<ol><li>Vedligeholde menneskelige hepatocellulært carcinom (HepG2) celler i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) som indeholder 10% føtal bovint serum (FBS) og yderligere substrater (10 mM glukose, 2 mM glutamin og 1 mM pyruvat) ved 37 ° C i en celle kultur inkubator (5% CO2 , 95% luft, 100% fugtighed). Bemærk: Brug ovenstående DMEM formulering, når DMEM der henvises til i senere trin for respirometri og kalorimetri.</li>
	<li>Plade celler på 1 x 106 celler pr. 100 m...

<ol>
	<li>Gnaiger, E., Kemp, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+metabolism+in+aerobic+mammalian+cells:+information+from+the+ratio+of+calorimetric+heat+flux+and+respirometric+oxygen+flux.">Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).</li><li>Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+the+specific+rate+of+catabolic+activity+(Ac)+from+the+heat+flow+rate+of+soil+microbial+reactions+measured+by+calorimetry:+significance+and+applications.">Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).</li><li>Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbicide+and+estrogen+effects+on+the+metabolic+activity+of+Elliptio+complanata+measured+by+calorespirometry.">Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).</li><li>Wadso, L., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorespirometry+of+terrestrial+organisms+and+ecosystems.">Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems.</a> Methods. 76, 11-19 (2015).</li><li>Gnaiger, E., Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+energetics+at+very+low+oxygen:+information+from+calorimetry+and+respirometry.">Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry.</a> Strategies for Gas Exchange and Metabolism. , 149-171 (1991).</li><li>Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+calorespirometric+ratios+of+soil+microbial+metabolism.">Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism.</a> Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).</li><li>Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+preconditioning+of+cells+with+AICAR-riboside:+improved+cryopreservation+and+cell-type+specific+impacts+on+energetics+and+proliferation.">Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation.</a> Cryobiology. 61, 79-88 (2010).</li><li>Webb, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Calorimetry. , (1985).</li><li>Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+modified+atmospheres+on+diapausing+5th+instar+codling+moth+metabolism.">Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism.</a> Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).</li><li>Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+application+of+tunable+diode+laser+absorption+spectroscopy+and+isothermal+micro-calorimetry+for+calorespirometric+analysis.">A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).</li><li>Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ascorbic+acid+and+light+on+reactions+in+fresh-cut+apples+by+microcalorimetry.">Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry.</a> Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).</li><li>Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+metabolic+heat+rate,+CO2+production,+and+O2+consumption+by+microcalorimetry.">Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).</li><li>Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+calorimetric+and+respirometric+measurements+on+plant-tissues.">Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues.</a> Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).</li><li>Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+cellular+energetics+by+galactose+and+pioglitazone.">Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone.</a> Cell and Tissue Research. , (2017).</li><li>Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+calorespirometric+ratios,+heat+per+CO2+and+heat+per+O2,+to+quantify+metabolic+paths+and+energetics+of+growing+cells.">Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells.</a> Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).</li><li>Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetric+determination+of+energy+expenditure+due+to+active+sodium-potassium+transport+in+the+soleus+muscle+and+brown+adipose+tissue+of+the+rat.">Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat.</a> The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).</li><li>Paul, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+biochemical+energy+balance+during+an+isometric+tetanus+and+steady+state+recovery+in+frog+sartorius+at+0+degree+C.">Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C.</a> Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Kemp, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+calorimetric-respirometric+ratio+in+studying+intermediary+metabolism+of+cultured+mammalian+cells.">Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells.</a> Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).</li><li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+pharmaceutical+industry+reduce+attrition+rates?.">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).</li><li>Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+HepG2+cells+to+identify+direct+mitochondrial+dysfunction+in+the+absence+of+cell+death.">The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death.</a> Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).</li><li>Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+substrate+modulates+mitochondrial+structure+and+oxidative+capacity+in+cancer+cells.">Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells.</a> Cancer Research. 64, 985-993 (2004).</li><li>Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetric+measurement+of+aerobic+cell-metabolism+in+unstirred+cell-cultures.">Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures.</a> Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).</li></ol>

Formålet med calorespirometry er at kvantitativt vurdere bidragene fra aerobe og anaerobe veje til metaboliske aktivitet og få et sammensat billede af cellulære energi flux. Dette opnås ved en samtidig måling af varmeafledning og ilt flux efterfulgt af en sammenligning af de beregnede CR forholdet med den teoretiske oxycaloric tilsvarende. Flere kritiske trin skal anses for reproducerbare og pålidelige data. Vedligeholdelse af en steril, sund cellekultur er kritisk. Forurening med bakterier eller svampe kan resulte...

I biologiske systemer, den varme-release eller enthalpi ændring under stofskiftet er typisk overvåges enten direkte (via direkte kalorimetri) eller indirekte via O2 forbrug og/eller CO2 produktion (via respirometri). Desværre, når disse teknikker anvendes i isolation, kritiske oplysninger går tabt, såsom bidrag af anaerobe veje til cellulære metabolisme. Calorespirometry er en effektiv teknik, der bygger på den samtidige måling af både varmeafledning og respiration. Calorespirometric pionerarbejde undersøgt det anaerobe stofskifte i fuldt iltet pattedyrceller og demonstreret samtidige bidrag af både aerobe og anaerobe veje til energi homøostase trods de transformerede celler er i en fuldt iltet miljø1. Calorespirometry er siden blevet anvendt til en bred vifte af biologiske spørgsmål. Nogle eksempler kan nævnes studiet af dyrs energetik på lavt iltindhold, virkningerne af både herbicid og østrogen på gællerne af muslinger, metabolismen af terrestriske organismer og mikrobielle nedbrydning af organisk jord sag2, 3 , 4 , 5 , 6. calorespirometry har desuden afsløret hvordan metaboliske forkonditionering før frysning forbedrer kryopræservering af pattedyr celler7. Hver tilgang, både kalorimetri og respirometri, selvstændigt har øget vores viden om cellulært og kropsligt bioenergetik. Grundlæggende biologiske spørgsmål, der kan besvares ved hjælp af calorespirometry er dog stadig relativt uudforsket.
Hesss lov fastslår, at den samlede enthalpi ændring af en reaktion er uafhængig af vej mellem første og sidste. F.eks. den samlede enthalpi ændring for en biokemisk pathway er summen af ændringen i enthalpies af alle reaktioner i vejen. Kalorimetri tilbyder en real-time tilgang til måling af cellulære varmeproduktion, som ukritisk registrerer både aerobe og anaerobe veje. Dette er baseret på det fundament, at ingen energi udveksles i systemet undtagen gennem væggene af de eksperimentelle ampule8. En ændring i varmeafledning er lig med ændringen i enthalpi frigivet fra alle metaboliske reaktioner i ampule. Således, en negativ enthalpi korrelerer til et tab af varme fra systemet. Udtømmende forskning i de sidste fire årtier har karakteriseret den termodynamiske landskab af både katabolisme og anabolisme. Dette er repræsenteret ved en støt stigning i forskningsartikler fundet under søgeudtryk "biologiske" og "Calorimetri" som indekseret af USA 's nationale bibliotek af Medicine (NLM) på National Institutes of Health (PubMed). Søgningen viser sig før 1970, ialt 27 publikationer reference biologiske kalorimetri; i mellemtiden, i 2016 alene, 546 publikationer udnyttet teknikken.
Kolorimetriske metoder er veletableret at bestemme varmeproduktion. Dog gives mere fleksibilitet til at løse den respirometric værdi. Respirometric måling kan bestå af O2, CO2, eller både O2 og CO2. Yderligere, måling af O2 eller CO2 kan opnås ved hjælp af forskellige teknikker, herunder optrodes, Clark-type elektroder og afstemmelige diode laser absorption spektroskopi7,9,10 ,11. Mens CO2 produktion er en værdifuld måling i mange respirometric undersøgelser, udnytter medium for kulturperler celler ofte en bicarbonic buffersystem for pH kontrol12,13. For at undgå komplikationer af CO2 måling i ordningen bikarbonat, udnytter følgende protokol for calorespirometry af celler i kultur O2 som den eneste respirometric parameter.
Samtidige med at måle ilt flux, visse respirometers (Se Tabel af materialer) er designet til detaljerede vurderinger af mitokondrie-funktionen. Substrat-uncoupler-inhibitor-titreringer (SUIT) protokoller er veletableret og er forenelige med forsøg på at måle membran potentielle eller reaktive ilt arter (ROS) dannelse14. Den præsenterede protokol for calorespirometry af intakt celler er kompatibel med indførelsen af kemiske uncouplers såsom carbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) og F0F1-ATP syntase hæmmer oligomycinets. Gennem tilsætning af FCCP, kan iltforbrug være frakoblet fra ATP produktion, som er nyttige til at vurdere virkningen af potentielle therapeutics mitokondrie indvinding15. Derudover belyser tilføjelsen af oligomycinets omfanget af lækage respiration. Således er respirometric målingerne udføres under calorespirometry kompatibel med omfattende protokoller designet til yderligere belyse mitokondrie fysiologi.
Samtidig måling af både varmeafledning og ilt flux giver mulighed for beregning af calorespirometric (CR) forholdet. Dette forhold er derefter sammenlignet med den Thornton konstant eller den teoretiske oxycaloric tilsvarende, som svinger mellem-430 til-480 kJ mol-1 afhængig af cellelinie eller væv af interesse og supplerede carbon substrater1, 16. således er forholdet mere negative CR afslører øgede bidrag fra anaerob veje til samlet metaboliske aktivitet. For eksempel, spænder CR-forholdet for rutinemæssig muskel væv respiration uden aktive udførelsen af arbejdet fra-448 til-468 kJ mol-1, som er inden for rækkevidde af de teoretiske oxycaloric svarende17,18. I mellemtiden, pattedyr kræftceller kulturperler i medium, der er højt indhold af glucose vise forbedrede mælkesyre gæring efter glykolyse og lav relativt mitokondrie engagement19. Denne fænotype resultater i CR nøgletal i rækken af-490 at-800 kJ mol-1, demonstrere en øget inddragelse af den anaerobe veje i den cellulære metabolisme som anført af mere negative CR nøgletal1,7, 16,20.
Både kommercielle og almennyttige celle og væv distributører i øjeblikket tilbud cellelinjer fra over 150 arter, med næsten 4.000 cellelinjer afledt af mennesker. Udødeliggjort cellelinjer er praktiske værktøjer for hurtigt vurdering af toksiciteten af potentielle therapeutics, hvoraf mange kan direkte eller indirekte forstyrre mitokondriets funktioner. Ved hjælp af transformerede celler under stof screening kan være af begrænset prædiktive værdi delvis på grund af effekten Warburg, kendetegnende for mange kræftformer. Ofte, kræftformer generere ATP fra substrat-niveau fosforylering og opretholde redox balance gennem produktion af laktat uden fuldt engagerende mitochondriet under aerobe betingelser19. Farmaceutisk udvikling er notorisk bekostelig og ineffektiv, med ca 8 ud af 9 forbindelser afprøvet i humane kliniske forsøg ikke at opnå marked godkendelse21. Mens potentielle therapeutics kan passere indledende screening på grund af lav cytotoksicitet i cellelinjer, er det muligt, at nogle af disse forbindelser er mitotoxic. Uden en passende metode til at påvise, hvordan disse toksiner kan forringe energibalancen i primærelementer, der ikke viser effekten Warburg, er kritiske oplysninger ofte over kiggede, flaskehalsproblemer terapeutisk udvikling i tidlige stadier.
Calorespirometry er en praktisk, noninvasive tilgang til at analysere metaboliske aktivitet i en bred vifte af biologiske prøver, herunder celler og væv. Kernen i den præsenterede protokol er kompatibel med en række applikationer. En komplikation, men er blevet identificeret. Udødeliggjort celler er ofte dyrkes i en glucose-frit medium suppleret med galactose at øge bidraget fra oxidativ fosforylering (OXPHOS) til energiproduktion, for at bevidstgøre celler til potentielle mitotoxins22, 23. Denne metabolisk omprogrammering synes at overskygge analyse når prøverne er placeret i rustfrit stål ampuller bruges af NA48-15. Celler dyrkes i en glucose medium fortsat at engagere sig i høje metaboliske aktivitet i flere timer. I mellemtiden, celler dyrkes i galactose medium formindske varmeproduktion inden for 30 min. af deres placering i ampule, at foretage målinger begrænset til tidlige eksperimenterende tidspunkter. Denne adfærd, hindrer desværre, mulighed for at vurdere deres cellulære spredning. Trods denne særlige begrænsninger, de fleste programmer er kompatible med calorespirometric analyse og metaboliske oplysninger kan opnås ved denne tilgang.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HepG2 Cells</td>
			<td style="width:125px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">HB-8065</td>
			<td style="width:167px;">Cells used for calorespirometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">O2k-Respirometer</td>
			<td style="width:125px;">Oroboros Instruments</td>
			<td style="width:119px;">10022-02</td>
			<td>Respirometer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermometric AB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thermometric was purchased by TA Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>100x solution added to DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum - Premiuim Select</td>
			<td style="width:125px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Added to 10% in DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsn-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">O4876</td>
			<td>Mitochondrial Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2920</td>
			<td>Mitochondrial Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td style="width:125px;">Corning Corporation</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td>Tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glucose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15023021</td>
			<td>Glucose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galactose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP656500</td>
			<td>Galactose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Glutamine for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, no glucose</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11966025</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calorespirometry: a powerful, noninvasive approach to investigate cellular energy metabolism

Mange cellelinjer anvendes i grundlæggende biologiske og biomedicinsk forskning opretholde energi homeostase gennem en kombination af både aerobe og anaerobe respiration. Det omfang, som begge veje bidrage til landskabet af cellulære energiproduktion er imidlertid konsekvent overset. Transformerede celler dyrkes i mætte niveauer af glukose ofte vise en nedsat afhængighed på oxidativ fosforylering for ATP produktion, der er udlignet af en stigning i substrat-niveau fosforylering. Dette skift i metaboliske poise tillader celler til at formere sig på trods af tilstedeværelsen af mitokondrie toksiner. I forsømme den ændrede metaboliske poise af transformerede celler, resultater fra en farmaceutisk screening kan mistolkes siden den potentielt mitotoxic virkninger kan ikke påvises ved hjælp af model cellelinjer kulturperler i overværelse af høje glukose koncentrationer. Denne protokol beskriver bindingen af to kraftfulde teknikker, respirometri og kalorimetri, som giver mulighed for kvantitative og noninvasive vurdering af både aerobe og anaerobe bidrag til cellulære ATP produktion. Både aerobe og anaerobe respirations generere varme, som kan blive overvåget via kalorimetri. I mellemtiden, måle hastigheden af iltforbrug kan vurdere omfanget af aerob respiration. Når både varmeafledning og iltforbruget måles samtidigt, kan calorespirometric forholdet bestemmes. Den eksperimentelt opnåede værdi kan derefter sammenlignes med den teoretiske oxycaloric tilsvarende og omfanget af den anaerobe respiration kan bedømmes. Således giver calorespirometry en unik metode til at analysere en bred vifte af biologiske spørgsmål, herunder udvikling af lægemidler, mikrobiel vækst og grundlæggende bioenergetik under både normoxic og hypoksiske betingelser.

Reproducerbarhed af calorespirometric målinger afhænger af en korrekt og konsekvent prøveforberedelse. Prøver forberedt fra cellekultur bør ikke anvendes hvis pladerne er tilgroet, da celletal kan blive unøjagtig på grund af sammenklumpning. Yderligere, reduceret varme strømme på grund af begrænset substrat diffusion i klumpet cellerne kan forekomme. Når du bruger vedhængende celler, er det derfor afgørende at vælge en plade med confluency mellem 60-80% og ændre medium 24 timer forud for forsøget.
<p ...

Watch this Scientific Journal Video about Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism at JoVE.com

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: En kraftfuld, Noninvasive tilgang at undersøge cellulære energimetabolisme

Denne protokol beskriver calorespirometry, direkte og samtidig måling af både varmeafledning og respiration, som giver noninvasive tilgang for at vurdere energimetabolisme. Denne teknik bruges til at vurdere bidraget fra både aerobe og anaerobe veje til energi udnyttelse ved at overvåge den samlede cellulære energi flow.

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Instrueret Cellular saml-selv at fabrikere Cell-afledt Tissue Ringe til Biomekanisk analyse og Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Ekstraktion for målrettet stabile isotoper Fortynding Liquid Chromatography-massespektrometri Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

Etablering af et kirurgisk induceret model i mus for at undersøge den beskyttende rolle i Progranulin i Slidgigt

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS-aktiverede Noninvasiv stofskifteprofil

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Fra voxel til Viden: En praktisk vejledning til opdelingen af ​​Complex Electron Microscopy 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar Gradient Diffusion System til Undersøg Chemotaxis i en 3D kollaqenmatrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

En eksperimentel og Finite Element-protokollen til undersøgelse af Transport af Neutrale og sigtet Opløste stoffer tværs Ledbrusken

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Arbejdsproces baseret på en kombination af isotopiske Tracer eksperimenter til at undersøge mikrobiel metabolisme af flere næringsstoffer kilder

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...