Name: calorespirometry: a powerful, noninvasive approach to investigate cellular energy metabolism
Uploaded: 2018-05-31T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de National Science Foundation subsidie CHE-160944 Mary E. Konkle en Michael A. Menze.

1. de celkweek
<ol><li>Handhaven van menselijke hepatocellulaire carcinoom (HepG2) cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) en extra substraten (10 mM glucose, 2 mM glutamine en 1 mM pyruvaat) bij 37 ° C in een cel cultuur incubator (5% CO2 , 95% lucht, vochtigheid van 100%). Opmerking: Gebruik de bovenstaande DMEM formulering als DMEM in latere stappen voor respirometrie en Calorimetrie wordt verwezen.</li>
	<li>Plaat van de cellen in 1 x 106 celle...

<ol>
	<li>Gnaiger, E., Kemp, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+metabolism+in+aerobic+mammalian+cells:+information+from+the+ratio+of+calorimetric+heat+flux+and+respirometric+oxygen+flux.">Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).</li><li>Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+the+specific+rate+of+catabolic+activity+(Ac)+from+the+heat+flow+rate+of+soil+microbial+reactions+measured+by+calorimetry:+significance+and+applications.">Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).</li><li>Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbicide+and+estrogen+effects+on+the+metabolic+activity+of+Elliptio+complanata+measured+by+calorespirometry.">Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).</li><li>Wadso, L., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorespirometry+of+terrestrial+organisms+and+ecosystems.">Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems.</a> Methods. 76, 11-19 (2015).</li><li>Gnaiger, E., Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+energetics+at+very+low+oxygen:+information+from+calorimetry+and+respirometry.">Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry.</a> Strategies for Gas Exchange and Metabolism. , 149-171 (1991).</li><li>Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+calorespirometric+ratios+of+soil+microbial+metabolism.">Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism.</a> Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).</li><li>Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+preconditioning+of+cells+with+AICAR-riboside:+improved+cryopreservation+and+cell-type+specific+impacts+on+energetics+and+proliferation.">Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation.</a> Cryobiology. 61, 79-88 (2010).</li><li>Webb, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Calorimetry. , (1985).</li><li>Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+modified+atmospheres+on+diapausing+5th+instar+codling+moth+metabolism.">Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism.</a> Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).</li><li>Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+application+of+tunable+diode+laser+absorption+spectroscopy+and+isothermal+micro-calorimetry+for+calorespirometric+analysis.">A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).</li><li>Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ascorbic+acid+and+light+on+reactions+in+fresh-cut+apples+by+microcalorimetry.">Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry.</a> Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).</li><li>Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+metabolic+heat+rate,+CO2+production,+and+O2+consumption+by+microcalorimetry.">Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).</li><li>Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+calorimetric+and+respirometric+measurements+on+plant-tissues.">Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues.</a> Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).</li><li>Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+cellular+energetics+by+galactose+and+pioglitazone.">Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone.</a> Cell and Tissue Research. , (2017).</li><li>Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+calorespirometric+ratios,+heat+per+CO2+and+heat+per+O2,+to+quantify+metabolic+paths+and+energetics+of+growing+cells.">Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells.</a> Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).</li><li>Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetric+determination+of+energy+expenditure+due+to+active+sodium-potassium+transport+in+the+soleus+muscle+and+brown+adipose+tissue+of+the+rat.">Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat.</a> The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).</li><li>Paul, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+biochemical+energy+balance+during+an+isometric+tetanus+and+steady+state+recovery+in+frog+sartorius+at+0+degree+C.">Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C.</a> Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Kemp, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+calorimetric-respirometric+ratio+in+studying+intermediary+metabolism+of+cultured+mammalian+cells.">Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells.</a> Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).</li><li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+pharmaceutical+industry+reduce+attrition+rates?.">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).</li><li>Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+HepG2+cells+to+identify+direct+mitochondrial+dysfunction+in+the+absence+of+cell+death.">The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death.</a> Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).</li><li>Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+substrate+modulates+mitochondrial+structure+and+oxidative+capacity+in+cancer+cells.">Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells.</a> Cancer Research. 64, 985-993 (2004).</li><li>Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetric+measurement+of+aerobic+cell-metabolism+in+unstirred+cell-cultures.">Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures.</a> Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).</li></ol>

Het doel van calorespirometry is aan de bijdragen van aërobe en anaërobe emissieroutes naar de metabole activiteit kwantitatief te evalueren en het verkrijgen van een samengestelde weergave van cellulaire energie flux. Dit wordt bereikt door een gelijktijdige meting van de warmteafgifte en zuurstof flux gevolgd door een vergelijking van de berekende CR-verhouding met de theoretische oxycaloric gelijkwaardig. Verschillende kritische stappen moeten worden overwogen voor reproduceerbare en betrouwbare gegevens. Het onderh...

In biologische systemen, de warmte-release of enthalpie verandering tijdens de stofwisseling is doorgaans bewaakt ofwel direct (via directe calorimetrie) of indirect via O2 verbruik en/of CO2 productie (via respirometrie). Helaas, wanneer deze technieken worden gebruikt in isolatie, kritische informatie gaat verloren, zoals de bijdrage van anaërobe emissieroutes naar de cellulaire metabolisme. Calorespirometry is een krachtige techniek die op de gelijktijdige meting van zowel de warmteafgifte en de ademhaling berust. Calorespirometric pionierswerk de anaërobe metabolisme in volledig zuurstofrijk zoogdiercellen onderzocht en aangetoond gelijktijdige bijdragen van zowel aerobe en anaerobe emissieroutes naar energie homeostase ondanks de veranderde cellen worden een volledig zuurstofrijk milieu1. Calorespirometry heeft inmiddels een breed scala aan biologische vragen vereffend. Enkele voorbeelden zijn de studie van dierlijke energetics op lage zuurstofniveaus, de effecten van zowel oestrogeen als herbicide op de kieuwen van tweekleppigen, het metabolisme van terrestrische organismen en de microbiële afbraak van organische bodem zaak2, 3 , 4 , 5 , 6. verder calorespirometry heeft geopenbaard hoe metabole conditionering vóór bevriezing verbetert de cryopreservatie van zoogdier-7cellen. Elk aanpak, zowel calorimetrie en respirometrie, toegenomen zelfstandig onze kennis van cellulaire en organisch Bioenergetica. Fundamentele biologische vragen die beantwoord kunnen worden door het gebruik van calorespirometry blijven echter relatief onontgonnen.
Hess de wet bepaalt dat de totale enthalpie verandering van een reactie onafhankelijk van het pad tussen de eerste en laatste Staten is. Bijvoorbeeld, is de totale enthalpie verandering voor een biochemische weg de sommatie van de verandering van enthalpie van alle reacties binnen het traject. Calorimetrie biedt een real-time aanpak voor het meten van cellulaire warmteproductie, die lukraak zowel aërobe en anaërobe trajecten detecteert. Dit is gebaseerd op het fundament dat geen energie in het systeem, behalve door de muren van de experimentele ampul8wordt uitgewisseld. Een verandering in de warmteafgifte is gelijk aan de verandering in enthalpie verlost van alle metabole reacties in de ampul. Dus correleert een negatieve enthalpie met een verlies van warmte uit het systeem. Uitputtend onderzoek in de afgelopen vier decennia heeft gekenmerkt de thermodynamische landschap van zowel katabolisme en anabolisme. Deze omgeving wordt voorgesteld door een gestage stijging van de onderzoeksartikelen vinden onder de zoektermen "biologische" en "calorimetrie" als geïndexeerd door de Verenigde Staten nationale bibliotheek van geneeskunde (NLM) op de National Institutes of Health (PubMed). De zoekopdracht blijkt dat vóór 1970, een totaal van 27 publicaties referentie biologische calorimetrie; Ondertussen, in 2016 alleen, 546 publicaties gebruikt de techniek.
Colorimetrische methoden zijn gevestigde om warmteproductie. Echter wordt meer flexibiliteit verleend voor het oplossen van de respirometrische waarde. De respirometrische meting kan bestaan uit O2CO2, of zowel O2 en CO2. Verder, het meten van O2 of CO2 kan worden bereikt door verschillende technieken, waaronder optrodes, Clark-type elektroden en afstembare diode laser Absorptie spectroscopie7,9,10 ,11. Terwijl de CO2 productie is een waardevolle metriek in vele respirometrische studies, het medium voor gekweekte cellen vaak maakt gebruik van een bicarbonic buffersysteem voor pH control12,13. Voorkom complicaties van CO2 meting in het bicarbonaat-systeem, het volgende protocol voor de calorespirometry van cellen in cultuur maakt gebruik van O2 als de enige respirometrische parameter.
Gelijktijdig met het meten van zuurstof flux, bepaalde respirometers (Zie Tabel van materialen) zijn ontworpen voor gedetailleerde evaluaties van mitochondriale functie. Substraat-uncoupler-remmer-TITRATIES (SUIT) protocollen zijn goed ingeburgerd en zijn compatibel met experimenten ontworpen voor het meten van membraan potentiële of reactieve zuurstof soorten (ROS) vorming14. Het gepresenteerde protocol voor calorespirometry van cellen intact is compatibel met de invoering van chemische uncouplers zoals carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) en de F0F1ATP - synthase remmer oligomycin. Door de toevoeging van FCCP, kan zuurstofverbruik worden afgekoppeld van de ATP productie, wat handig is om de impact van potentiële therapeutics op mitochondriale peformance15. Bovendien, de toevoeging van oligomycin verlicht de omvang van de ademhaling van de lek. Dus, de respirometrische metingen tijdens calorespirometry zijn compatibel met uitgebreide protocollen ter verdere verheldering mitochondriale fysiologie.
De gelijktijdige meting van zowel warmteafvoer en zuurstof flux zorgt voor de berekening van de verhouding tussen de calorespirometric (CR). Deze verhouding wordt vervolgens vergeleken met de Thornton's constante of de theoretische oxycaloric equivalent, die tussen-430 te-480 kJ mol-1 afhankelijk van het cellijn of weefsel van belang en de aangevuld koolstof substraten1, varieert 16. dus, een meer negatieve CR verhouding onthult grotere bijdragen van anaërobe trajecten voor algemene metabole activiteit. Bijvoorbeeld, is de CR-verhouding voor routinematige spier weefsel ademhaling zonder de actieve uitvoering van werk varieert van-448 tot-468 kJ mol-1 die binnen het bereik valt van de theoretische oxycaloric gelijkwaardig17,18. Ondertussen, zoogdieren kankercellen gekweekt in medium dat is hoog in glucose weer verbeterde melkzuur gisting na de glycolyse en relatief lage mitochondriale betrokkenheid19. De resultaten van dit fenotype in CR verhoudingen in het bereik van-490 naar-800 kJ mol-1, tonen een verhoogde betrokkenheid van de anaërobe trajecten in het cellulaire metabolisme zoals aangegeven door negatiever CR verhoudingen1,7, 16,20.
Zowel commerciële als non-profit cel- en weefseltransplantaties distributeurs momenteel aanbod cellijnen uit meer dan 150 soorten, met bijna 4000 cellijnen afgeleid van mensen. Vereeuwigd cellijnen zijn handige hulpmiddelen voor het snel beoordelen van de toxiciteit van potentiële therapeutics, waarvan vele direct of indirect mitochondriale functies storen. Getransformeerde cuvetten tijdens drug screening kunnen beperkte voorspellende waarde gedeeltelijk vanwege het Warburg effect, een kenmerk van veel kankers. Vaak kankers ATP genereren van substraat-niveau fosforylatie en redox evenwicht door de productie van lactaat zonder volledig het mitochondrion onder aërobe omstandigheden19. Farmaceutische ontwikkeling is notoir dure en inefficiënte, met ongeveer 8 uit 9 verbindingen getest in menselijke klinische proeven niet bereikt markt goedkeuring21. Terwijl potentiële therapeutics eerste screening als gevolg van lage cytotoxiciteit cellijnen doorgeeft kan, is het mogelijk dat sommige van deze verbindingen mitotoxic zijn. Zonder een geschikte methode om te ontdekken hoe deze toxines kunnen afbreuk doen aan de energiebalans in primaire cellen die het Warburg effect niet weergeven, is kritische informatie vaak overdreven keek, blokkeringen therapeutische ontwikkeling in de vroege stadia.
Calorespirometry is een praktische, noninvasive benadering voor het analyseren van de metabole activiteit in een verscheidenheid van biologische monsters, met inbegrip van cellen en weefsels. De kern van het voorgestelde protocol is compatibel met een scala aan toepassingen. Een complicatie, echter, is geconstateerd. Vereeuwigd cellen worden vaak gekweekt in een glucose-gratis medium aangevuld met galactose te vergroten van de bijdrage van oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) voor de productie van energie, om het sensibiliseren van de cellen aan potentiële mitotoxins22, 23. Dit metabole herprogrammering lijkt te verdoezelen analyse wanneer monsters worden geplaatst in de stimulatiedosis van het roestvrij staal gebruikt door de calorimeter15. Cellen gekweekt in een glucose medium blijven streven naar hoge metabole activiteit gedurende enkele uren. Ondertussen, cellen gekweekt in galactose medium verlagen de warmteproductie binnen 30 min van hun plaatsing in de ampul, beperkt tot vroege experimentele tijdstippen metingen te maken. Dit gedrag is helaas belemmert de gelegenheid om te evalueren van de cellulaire proliferatie. Ondanks deze specifieke beperking, de meeste toepassingen zijn compatibel met calorespirometric analyse en metabole Detailgegegevens verkregen kan worden door deze aanpak.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HepG2 Cells</td>
			<td style="width:125px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">HB-8065</td>
			<td style="width:167px;">Cells used for calorespirometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">O2k-Respirometer</td>
			<td style="width:125px;">Oroboros Instruments</td>
			<td style="width:119px;">10022-02</td>
			<td>Respirometer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermometric AB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thermometric was purchased by TA Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>100x solution added to DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum - Premiuim Select</td>
			<td style="width:125px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Added to 10% in DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsn-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">O4876</td>
			<td>Mitochondrial Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2920</td>
			<td>Mitochondrial Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td style="width:125px;">Corning Corporation</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td>Tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glucose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15023021</td>
			<td>Glucose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galactose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP656500</td>
			<td>Galactose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Glutamine for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, no glucose</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11966025</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calorespirometry: a powerful, noninvasive approach to investigate cellular energy metabolism

Veel gebruikt in de biologische en biomedische basisonderzoek cellijnen handhaven energie homeostase door een combinatie van zowel aërobe en anaërobe ademhaling. De mate waarin beide trajecten tot het landschap van cellulaire energieproductie bijdragen is echter consequent over het hoofd gezien. Getransformeerde cellen gekweekt in het verzadigen van de niveaus van de glucose vaak Toon een verminderde afhankelijkheid op oxidatieve fosforylatie voor ATP productie, die wordt gecompenseerd door een toename van de substraat-niveau fosforylering. Deze verschuiving in metabole poise kunt cellen te verspreiden ondanks de aanwezigheid van mitochondriale toxines. De gewijzigde metabole poise getransformeerde cellen negeren, resultaten van een farmaceutische screening kunnen worden geïnterpreteerd sinds de potentieel mitotoxic effecten niet worden gedetecteerd met behulp van model cellijnen gekweekte in aanwezigheid van hoge glucose concentraties. Dit protocol beschrijft de koppeling van twee krachtige technieken, respirometrie en calorimetrie, waarmee voor de beoordeling van het kwantitatieve en noninvasive van zowel aerobe en anaerobe bijdragen aan cellulaire productie van ATP. Zowel aërobe en anaërobe ademhalingen genereren van warmte, die gecontroleerd via calorimetrie worden kan. Ondertussen, het meten van de snelheid van zuurstofverbruik kan beoordelen in welke mate van aërobe ademhaling. Wanneer zowel warmteafvoer en zuurstofverbruik gelijktijdig gemeten worden, kan de verhouding van de calorespirometric worden bepaald. De experimenteel verkregen waarde kan vervolgens worden vergeleken met de theoretische oxycaloric gelijkwaardig en de omvang van de anaërobe ademhaling kan worden beoordeeld. Calorespirometry biedt dus een unieke methode om een breed scala aan biologische vragen, met inbegrip van de Geneesmiddelenontwikkeling, microbiële groei en fundamentele Bioenergetica onder zowel normoxic als hypoxische voorwaarden te analyseren.

De reproduceerbaarheid van de metingen van de calorespirometric is afhankelijk van een goede en consequente monstervoorbereiding. Monsters van celcultuur bereid mag niet dienen als de platen zijn begroeid, zoals cellen onjuist als gevolg van samendoen worden kunnen. Verdere, verlaagde warmte stromen als gevolg van de beperkte substraat diffusie in de geklonterd cellen kunnen optreden. Bij het gebruik van Adherente cellen, daarom kritisch te selecteren van een plaat met de confluentie tussen 60-80% en het medium 24 h vó?...

Watch this Scientific Journal Video about Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism at JoVE.com

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: Een krachtige, Noninvasive benadering onderzoeken van cellulaire energiemetabolisme

Dit protocol beschrijft calorespirometry, de directe en gelijktijdige meting van zowel warmteafvoer en ademhaling, waarmee een noninvasive aanpak om te beoordelen van de energie-stofwisseling. Deze techniek wordt gebruikt ter beoordeling van de bijdrage van zowel aerobe en anaerobe emissieroutes naar energie gebruik door toezicht op de totale cellulaire energiestroom.

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

De driedimensionale menselijke huid Reconstrueer model: een instrument om de normale huid en melanoomprogressie Study

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Gericht Cellular Self-Assembly to Cell-Derived weefsel Rings fabriceren voor Biomechanische Analyse en Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellulaire vetextractie voor gerichte stabiele isotopen Verdunning vloeistofchromatografie-massaspectrometrie Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

Oprichting van een chirurgisch geïnduceerde Model in Muizen naar de beschermende rol van progranuline in Artrose Onderzoek

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS-enabled Noninvasive metabole

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Van Voxels to Knowledge: Een praktische gids voor de segmentatie van Complex Electron Microscopy 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar Gradient Diffusion System Chemotaxis onderzoeken in een 3D collageenmatrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Een experimentele en Finite Element Protocol bij het vervoer van neutrale en geladen opgeloste stoffen over gewrichtskraakbeen Onderzoek

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Workflow gebaseerd op de combinatie van isotopische tracerproeven te onderzoeken van de microbiële metabolisme van meerdere nutriënten bronnen

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...