Name: calorespirometry: a powerful, noninvasive approach to investigate cellular energy metabolism
Uploaded: 2018-05-31T14:30:00
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Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla sovvenzione della National Science Foundation-160944 Mary E. Konkle e Michael A. Menze.

1. coltura cellulare
<ol><li>Mantenere cellule epatocellulari umane di carcinoma (HepG2) nel mezzo dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e ulteriori substrati (10 millimetri di glucosio, glutammina 2 mM e 1 mM piruvato) a 37 ° C in un'incubatrice di coltura delle cellule (5% CO2 , aria di 95%, 100% di umidità). Nota: Utilizzare la precedente formulazione di DMEM quando DMEM viene fatto riferimento nei passaggi successivi per manometrica e calorimetria.</li>
	<...

<ol>
	<li>Gnaiger, E., Kemp, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+metabolism+in+aerobic+mammalian+cells:+information+from+the+ratio+of+calorimetric+heat+flux+and+respirometric+oxygen+flux.">Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).</li><li>Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+the+specific+rate+of+catabolic+activity+(Ac)+from+the+heat+flow+rate+of+soil+microbial+reactions+measured+by+calorimetry:+significance+and+applications.">Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).</li><li>Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbicide+and+estrogen+effects+on+the+metabolic+activity+of+Elliptio+complanata+measured+by+calorespirometry.">Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).</li><li>Wadso, L., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorespirometry+of+terrestrial+organisms+and+ecosystems.">Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems.</a> Methods. 76, 11-19 (2015).</li><li>Gnaiger, E., Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+energetics+at+very+low+oxygen:+information+from+calorimetry+and+respirometry.">Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry.</a> Strategies for Gas Exchange and Metabolism. , 149-171 (1991).</li><li>Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+calorespirometric+ratios+of+soil+microbial+metabolism.">Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism.</a> Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).</li><li>Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+preconditioning+of+cells+with+AICAR-riboside:+improved+cryopreservation+and+cell-type+specific+impacts+on+energetics+and+proliferation.">Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation.</a> Cryobiology. 61, 79-88 (2010).</li><li>Webb, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Calorimetry. , (1985).</li><li>Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+modified+atmospheres+on+diapausing+5th+instar+codling+moth+metabolism.">Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism.</a> Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).</li><li>Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+application+of+tunable+diode+laser+absorption+spectroscopy+and+isothermal+micro-calorimetry+for+calorespirometric+analysis.">A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).</li><li>Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ascorbic+acid+and+light+on+reactions+in+fresh-cut+apples+by+microcalorimetry.">Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry.</a> Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).</li><li>Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+metabolic+heat+rate,+CO2+production,+and+O2+consumption+by+microcalorimetry.">Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).</li><li>Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+calorimetric+and+respirometric+measurements+on+plant-tissues.">Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues.</a> Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).</li><li>Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+cellular+energetics+by+galactose+and+pioglitazone.">Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone.</a> Cell and Tissue Research. , (2017).</li><li>Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+calorespirometric+ratios,+heat+per+CO2+and+heat+per+O2,+to+quantify+metabolic+paths+and+energetics+of+growing+cells.">Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells.</a> Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).</li><li>Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetric+determination+of+energy+expenditure+due+to+active+sodium-potassium+transport+in+the+soleus+muscle+and+brown+adipose+tissue+of+the+rat.">Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat.</a> The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).</li><li>Paul, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+biochemical+energy+balance+during+an+isometric+tetanus+and+steady+state+recovery+in+frog+sartorius+at+0+degree+C.">Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C.</a> Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Kemp, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+calorimetric-respirometric+ratio+in+studying+intermediary+metabolism+of+cultured+mammalian+cells.">Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells.</a> Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).</li><li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+pharmaceutical+industry+reduce+attrition+rates?.">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).</li><li>Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+HepG2+cells+to+identify+direct+mitochondrial+dysfunction+in+the+absence+of+cell+death.">The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death.</a> Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).</li><li>Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+substrate+modulates+mitochondrial+structure+and+oxidative+capacity+in+cancer+cells.">Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells.</a> Cancer Research. 64, 985-993 (2004).</li><li>Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetric+measurement+of+aerobic+cell-metabolism+in+unstirred+cell-cultures.">Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures.</a> Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).</li></ol>

L'obiettivo di calorespirometry è quello di valutare quantitativamente i contributi dei percorsi aerobici ed anaerobici di attività metabolica e ottenere una vista composta di flusso di energia cellulare. Ciò avviene mediante una misura simultanea di dissipazione del calore e flusso di ossigeno seguita da un confronto tra il rapporto CR calcolato con il teorico oxycaloric equivalente. Diversi passaggi critici devono essere considerate per dati riproducibili e affidabili. Il mantenimento di una cultura sterile cellula ...

Nei sistemi biologici, il rilascio di calore o entalpia cambiamento durante il metabolismo è in genere monitorati sia direttamente (tramite diretta calorimetria) o indirettamente tramite il consumo di O2 e/o produzione di CO2 (via manometrica). Sfortunatamente, quando queste tecniche sono utilizzate in isolamento, informazioni critiche vengono perse, come il contributo delle vie anaerobiche al metabolismo cellulare. Calorespirometry è una potente tecnica che si basa sulla misurazione simultanea di dissipazione di calore e di respirazione. Calorespirometric lavoro pionieristico studiato il metabolismo anaerobico in cellule di mammiferi completamente ossigenate e dimostrato contributi simultanei dei percorsi sia aerobici che anaerobici di omeostasi energetica nonostante le cellule trasformate in un ambiente completamente ossigenato1. Calorespirometry da allora è stato applicato a una vasta gamma di domande biologiche. Alcuni esempi includono lo studio dell'animale energetica a bassi livelli di ossigeno, gli effetti di erbicidi e di estrogeno sulle lamelle di molluschi bivalvi, il metabolismo degli organismi terrestri e la decomposizione microbica di materia organica del suolo2, 3 , 4 , 5 , 6. Inoltre, calorespirometry ha rivelato come metabolica precondizionamento prima del congelamento migliora la crioconservazione di mammiferi celle7. Ogni approccio, sia calorimetria e manometrica, indipendentemente ha aumentato la nostra conoscenza della bioenergetica cellulare e organismica. Tuttavia, fondamentali domande biologiche che possono essere risolte attraverso l'uso di calorespirometry rimangono relativamente inesplorate.
Leggi di Hess afferma che la variazione di entalpia totale di una reazione è indipendente del pathway tra gli stati iniziali e finali. Ad esempio, la variazione di entalpia totale per una via biochimica è la somma della variazione di entalpie di tutte le reazioni all'interno della via. Calorimetria offre un approccio in tempo reale per misurare la produzione di calore cellulare, che rileva indiscriminatamente vie sia aerobiche che anaerobiche. Questo si basa sul fondamento che nessuna energia viene scambiata nel sistema tranne attraverso le pareti della fiala sperimentale8. Un cambiamento nella dissipazione del calore è uguale al cambiamento di entalpia rilasciato da tutte le reazioni metaboliche in fiala. Così, un negativo entalpia correla ad una perdita di calore dal sistema. Ricerche approfondite negli ultimi quattro decenni ha caratterizzato il paesaggio termodinamico di anabolismo e catabolismo. Questo è rappresentato da un aumento costante nella ricerca articoli trovati sotto i termini di ricerca "biologici" e "calorimetria" come indicizzato dallo Stati Uniti National Library di medicina (NLM) presso il National Institutes of Health (PubMed). La ricerca rivela che prima del 1970, un totale di 27 pubblicazioni riferimento biologico calorimetria; nel frattempo, nel 2016 da solo, 546 pubblicazioni utilizzato la tecnica.
Metodi calorimetrici sono ben stabiliti per determinare la produzione di calore. Tuttavia, una maggiore flessibilità è concesso per la risoluzione il valore respirometriche. La misurazione respirometriche può consistere di O2, CO2, o O2 e CO2. Ulteriormente, la misura di O2 o CO2 può essere compiuta mediante varie tecniche, tra cui optrodes, Clark-tipo di elettrodi e diodo tunable laser assorbimento spettroscopia7,9,10 ,11. Mentre la produzione di CO2 è una metrica preziosa in molti studi respirometriche, il supporto per le cellule coltivate spesso utilizza un sistema di buffer di bicarbonic per controllo pH12,13. Per evitare complicazioni di CO2 misura nel sistema di bicarbonato, il seguente protocollo per la calorespirometry delle cellule nella cultura utilizza O2 come unico parametro respirometriche.
In concomitanza con cambiamento continuo dell'ossigeno di misurazione, alcuni respirometers (Vedi Tabella materiali) sono progettati per valutazioni dettagliate della funzione mitocondriale. Substrato-disaccoppiatore-inibitore-titolazioni (SUIT) protocolli sono ben stabiliti e sono compatibili con gli esperimenti progettati per misurare la membrana potenziale o reattive dell'ossigeno (ROS) specie formazione14. Il protocollo presentato per calorespirometry di cellule intatte è compatibile con l'introduzione della chimica uncouplers come Carbonil cianuro-p-trifluorometossifenil idrazone (FCCP) e l'inibitore oligomycin di F0F1-ATP sintasi. Attraverso l'aggiunta di FCCP, consumo di ossigeno può essere disgiunto dalla produzione di ATP, che è utile per valutare l'impatto di potenziali terapie su mitocondriale peformance15. Inoltre, l'aggiunta di oligomycin si illumina nella misura della respirazione di perdita. Così, le misure respirometriche eseguite durante calorespirometry sono compatibili con protocolli vasti progettati più ulteriormente per delucidare fisiologia mitocondriale.
La misura simultanea di dissipazione di calore e di cambiamento continuo dell'ossigeno consente il calcolo del rapporto calorespirometric (CR). Questo rapporto viene quindi confrontato con costante di Thornton o il oxycaloric teorico equivalente, che spazia tra -430 a-480 kJ mol-1 a seconda della varietà di cellula o tessuto di interesse e il carbonio completati substrati1, 16. quindi, un rapporto più negativo di CR rivela maggiori contributi da vie anaerobiche per complessivo activity. Ad esempio, il rapporto di CR per la respirazione dei tessuti muscolo routine senza l'attiva delle prestazioni di lavoro varia da-448 a-468 kJ mol-1 che è all'interno della gamma del oxycaloric teorico equivalente17,18. Nel frattempo, le cellule tumorali dei mammiferi coltivate in medium che è ad alto contenuto di glucosio visualizzare fermentazione acido lattico avanzata seguendo la glicolisi e relativamente basso coinvolgimento mitocondriale19. Questo risultati di fenotipo in rapporti di CR nell'intervallo di-490 a-800 kJ mol-1, dimostrando una maggiore partecipazione delle vie anaerobiche nel metabolismo cellulare come indicato da più negativa CR rapporti1,7, 16,20.
Distributori di cellule e tessuti sia commerciali che senza scopo di lucro attualmente offerta linee cellulari provenienti da oltre 150 specie, con quasi 4.000 linee cellulari derivano da esseri umani. Linee cellulari immortalizzate sono strumenti utili per valutare rapidamente la tossicità delle terapie potenziali, molte delle quali possono interferire direttamente o indirettamente con funzioni mitocondriali. Utilizzando cellule trasformate durante lo screening di stupefacenti può essere di limitato valore predittivo in parte a causa dell'effetto di Warburg, un segno distintivo di molti cancri. Spesso, i cancri generano ATP da fosforilazione del substrato-livello e mantengono l'equilibrio redox attraverso la produzione di lattato senza impegnarsi pienamente il mitocondrio sotto condizioni aerobiche19. Sviluppo farmaceutico è notoriamente costoso ed inefficiente, con circa 8 su 9 composti provati nei test clinici umani non riuscendo a ottenere l'approvazione del mercato21. Mentre terapeutica potenziale può passare uno screening iniziale a causa della bassa citotossicità nelle linee cellulari, è possibile che alcuni di questi composti sono mitotoxic. Senza un metodo adatto per rilevare come queste tossine possono alterare l'equilibrio di energia nelle cellule primarie che non vengono visualizzati l'effetto Warburg, informazione critica è spesso sovra-sembrava, strozzature sviluppo terapeutico nelle fasi iniziali.
Calorespirometry è un approccio pratico, non invadente per analizzare l'attività metabolica in una varietà di campioni biologici, compreso le cellule e tessuti. Il nucleo del protocollo presentato è compatibile con una gamma di applicazioni. Una complicazione, tuttavia, è stata identificata. Cellule immortalizzate sono spesso coltivate in un medium privo di glucosio, completato con galattosio per aumentare il contributo della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per la produzione di energia, al fine di sensibilizzare le cellule a potenziali mitotoxins22, 23. Questa riprogrammazione metabolico sembra oscurare analisi quando i campioni vengono inseriti nelle fiale di acciaio inossidabile utilizzate dal calorimetro15. Le cellule coltivate in un medium del glucosio continuano ad impegnarsi in alta attività metabolica per diverse ore. Nel frattempo, le cellule coltivate in medium galattosio diminuiscono la produzione di calore entro 30 min della loro collocazione in fiala, effettuare misure limitate ai punti di tempo sperimentale in anticipo. Questo comportamento, purtroppo, ostacola la possibilità di valutare la loro proliferazione cellulare. Nonostante questa limitazione specifica, la maggior parte delle applicazioni sono compatibili con l'analisi calorespirometric e dettagliate informazioni metaboliche possono essere ottenute attraverso questo approccio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HepG2 Cells</td>
			<td style="width:125px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">HB-8065</td>
			<td style="width:167px;">Cells used for calorespirometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">O2k-Respirometer</td>
			<td style="width:125px;">Oroboros Instruments</td>
			<td style="width:119px;">10022-02</td>
			<td>Respirometer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermometric AB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thermometric was purchased by TA Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>100x solution added to DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum - Premiuim Select</td>
			<td style="width:125px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Added to 10% in DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsn-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">O4876</td>
			<td>Mitochondrial Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2920</td>
			<td>Mitochondrial Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td style="width:125px;">Corning Corporation</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td>Tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glucose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15023021</td>
			<td>Glucose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galactose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP656500</td>
			<td>Galactose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Glutamine for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, no glucose</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11966025</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calorespirometry: a powerful, noninvasive approach to investigate cellular energy metabolism

Molte linee cellulari utilizzate nella ricerca biologica e biomedica di base mantengono l'omeostasi energetica attraverso una combinazione di respirazione sia aerobico che anaerobico. Tuttavia, nella misura in cui sia vie contribuiscono al paesaggio della produzione di energia cellulare è costantemente trascurata. Trasformato le cellule coltivate in saturando i livelli di glucosio spesso mostrano una dipendenza in diminuzione su fosforilazione ossidativa per la produzione di ATP, che viene compensata da un aumento nella fosforilazione del substrato-livello. Questo spostamento nell'equilibrio metabolico permette alle cellule di proliferare nonostante la presenza di tossine mitocondriali. Trascurando l'alterato equilibrio metabolico delle cellule trasformate, i risultati di uno screening farmaceutico potrebbero essere interpretata erroneamente dal potenzialmente effetti mitotoxic non possono essere rilevati utilizzando modello linee cellulari coltivate in presenza di elevati del glucosio concentrazioni. Questo protocollo descrive l'accoppiamento di due potenti tecniche, manometrica e Calorimetria, che consente la valutazione quantitativa e non invadente dei contributi sia aerobici ed anaerobici per la produzione di ATP cellulare. Respirazioni sia aerobici ed anaerobici generano calore, che può essere monitorato tramite calorimetria. Nel frattempo, la misurazione del tasso di consumo di ossigeno può valutare l'entità della respirazione aerobica. Quando sia la dissipazione di calore e consumo di ossigeno sono misurati simultaneamente, il rapporto di calorespirometric può essere determinato. Il valore ottenuto sperimentalmente può essere confrontato all'equivalente di oxycaloric teorico e nella misura della respirazione anaerobica può essere giudicata. Così, calorespirometry fornisce un metodo unico per analizzare una vasta gamma di domande biologiche, tra cui lo sviluppo di farmaci, la crescita microbica e bioenergetica fondamentale sia in normossia e in condizioni di ipossia.

La riproducibilità delle misurazioni calorespirometric dipende da una preparazione del campione corretto e coerente. Campioni preparati da coltura cellulare non devono essere utilizzati se le piastre sono invasi, come i conteggi delle cellule possono diventare imprecisi a causa di agglutinamento. Inoltre, flussi di calore ridotta a causa della diffusione di substrato limitato nelle cellule ragruppate possono verificarsi. Pertanto, quando si utilizza cellule aderenti, è fondamentale per selezionare un piatto con la conf...

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Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: Un approccio potente, non invasivo per studiare il metabolismo energetico cellulare

Questo protocollo descrive calorespirometry, la misura diretta e simultanea di dissipazione di calore e di respirazione, che fornisce un approccio non invasivo per valutare il metabolismo energetico. Questa tecnica è utilizzata per valutare il contributo delle vie sia aerobiche e anaerobiche per l'utilizzazione di energia di monitoraggio del flusso totale di energia cellulare.

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Tridimensionale pelle umana Ricostruire Modello: uno strumento per studiare la pelle normale e progressione Melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Ricerca

Bioingegneria

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Diretto Cellular Self-Assembly di fabbricare Cell-Derived Anelli tessuto per l&#39;analisi biomeccanica e di ingegneria dei tessuti

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate Stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

Istituzione di un modello chirurgicamente indotta nei topi per indagare il ruolo protettivo di progranulina in osteoartrite

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS-enabled non invasiva Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Da Voxels alla Conoscenza: Una guida pratica per la segmentazione del Complesso microscopia elettronica 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Uno Sperimentale e Finite Element protocollo per indagare il trasporto di soluti neutri e carichi attraverso cartilagine articolare

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Flusso di lavoro basato sulla combinazione di tracciante isotopico esperimenti per studiare il metabolismo microbico di più fonti di nutrienti

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...