Name: calorespirometry: a powerful, noninvasive approach to investigate cellular energy metabolism
Uploaded: 2018-05-31T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis finansiert av National Science Foundation grant CHE-160944 Mary E. Konkle og Michael A. Menze.

1. celle kultur
<ol><li>Opprettholde menneskelige hepatocellulært karsinom (HepG2) celler i Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) som inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS) og flere underlag (10 mM glukose, 2 mM glutamin og 1 mM pyruvate) på 37 ° C i en celle kultur inkubator (5% CO2 , 95% luft, 100% luftfuktighet). Merk: Bruk over DMEM formuleringen når DMEM er referert i senere trinn for respirometry og calorimetry.</li>
	<li>Plate cellene på 1 x 106 celler per 100 mm kultur plate o...

<ol>
	<li>Gnaiger, E., Kemp, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+metabolism+in+aerobic+mammalian+cells:+information+from+the+ratio+of+calorimetric+heat+flux+and+respirometric+oxygen+flux.">Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).</li><li>Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+the+specific+rate+of+catabolic+activity+(Ac)+from+the+heat+flow+rate+of+soil+microbial+reactions+measured+by+calorimetry:+significance+and+applications.">Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).</li><li>Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbicide+and+estrogen+effects+on+the+metabolic+activity+of+Elliptio+complanata+measured+by+calorespirometry.">Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).</li><li>Wadso, L., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorespirometry+of+terrestrial+organisms+and+ecosystems.">Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems.</a> Methods. 76, 11-19 (2015).</li><li>Gnaiger, E., Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+energetics+at+very+low+oxygen:+information+from+calorimetry+and+respirometry.">Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry.</a> Strategies for Gas Exchange and Metabolism. , 149-171 (1991).</li><li>Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+calorespirometric+ratios+of+soil+microbial+metabolism.">Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism.</a> Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).</li><li>Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+preconditioning+of+cells+with+AICAR-riboside:+improved+cryopreservation+and+cell-type+specific+impacts+on+energetics+and+proliferation.">Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation.</a> Cryobiology. 61, 79-88 (2010).</li><li>Webb, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Calorimetry. , (1985).</li><li>Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+modified+atmospheres+on+diapausing+5th+instar+codling+moth+metabolism.">Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism.</a> Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).</li><li>Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+application+of+tunable+diode+laser+absorption+spectroscopy+and+isothermal+micro-calorimetry+for+calorespirometric+analysis.">A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).</li><li>Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ascorbic+acid+and+light+on+reactions+in+fresh-cut+apples+by+microcalorimetry.">Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry.</a> Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).</li><li>Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+metabolic+heat+rate,+CO2+production,+and+O2+consumption+by+microcalorimetry.">Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).</li><li>Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+calorimetric+and+respirometric+measurements+on+plant-tissues.">Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues.</a> Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).</li><li>Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+cellular+energetics+by+galactose+and+pioglitazone.">Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone.</a> Cell and Tissue Research. , (2017).</li><li>Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+calorespirometric+ratios,+heat+per+CO2+and+heat+per+O2,+to+quantify+metabolic+paths+and+energetics+of+growing+cells.">Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells.</a> Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).</li><li>Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetric+determination+of+energy+expenditure+due+to+active+sodium-potassium+transport+in+the+soleus+muscle+and+brown+adipose+tissue+of+the+rat.">Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat.</a> The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).</li><li>Paul, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+biochemical+energy+balance+during+an+isometric+tetanus+and+steady+state+recovery+in+frog+sartorius+at+0+degree+C.">Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C.</a> Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Kemp, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+calorimetric-respirometric+ratio+in+studying+intermediary+metabolism+of+cultured+mammalian+cells.">Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells.</a> Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).</li><li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+pharmaceutical+industry+reduce+attrition+rates?.">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).</li><li>Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+HepG2+cells+to+identify+direct+mitochondrial+dysfunction+in+the+absence+of+cell+death.">The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death.</a> Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).</li><li>Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+substrate+modulates+mitochondrial+structure+and+oxidative+capacity+in+cancer+cells.">Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells.</a> Cancer Research. 64, 985-993 (2004).</li><li>Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetric+measurement+of+aerobic+cell-metabolism+in+unstirred+cell-cultures.">Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures.</a> Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).</li></ol>

Målet med calorespirometry er å evaluere kvantitativt bidrag av aerob og anaerob metabolsk aktivitet og få en sammensatt visning av celleenergien forandring. Dette oppnås ved en samtidig måling av varmespredning og oksygen flux etterfulgt av en sammenligning av beregnet CR forhold med den teoretiske oxycaloric tilsvarende. Flere kritiske trinn må vurderes for reproduserbare og pålitelige data. Vedlikehold av en steril og sunn cellekultur er avgjørende. Forurensning av bakterier eller sopp kan resultere i databesk...

I biologiske systemer, varme-release eller entalpi endringen under metabolisme er vanligvis overvåket enten direkte (via direkte calorimetry) eller indirekte via O2 forbruk og/eller CO2 produksjon (via respirometry). Dessverre, når disse teknikkene brukes i isolasjon, kritisk informasjon går tapt som bidrag av anaerob trasé til cellenes stoffskifte. Calorespirometry er en kraftfull teknikk som samtidig måling av både varmespredning og åndedrett. Banebrytende calorespirometric arbeid undersøkt den anaerob metabolismen i fullt oksygenrikt pattedyrceller og vist samtidig bidrag av både aerob og anaerob til energi homeostase tross transformert cellene i en fullt oksygenrikt miljø1. Calorespirometry har siden brukt mot et bredt spekter av biologiske spørsmål. Eksempler er studiet av dyr energi på lavt oksygennivå, effekten av både ugressmiddel og østrogen på gjellene annet muslinger, metabolismen av terrestriske organismer og mikrobiell nedbryting av organisk jord saken2, 3 , 4 , 5 , 6. videre calorespirometry har avslørt hvordan metabolske preconditioning før frysing forbedrer kryonisk bevaring av pattedyr celler7. Hver tilnærming, både calorimetry og respirometry, har uavhengig økt vår kunnskap om mobilnettet og organismebiologi bioenergi. Men fremdeles grunnleggende biologisk spørsmål som kan besvares ved hjelp av calorespirometry lite utforsket.
Hesss lov sier at den totale entalpi endringen av en reaksjon er uavhengig av veien mellom de innledende og avsluttende. Den totale entalpi endringen for en biokjemiske sti er for eksempel summering av endringen i dannelsesentalpien alle reaksjoner i veien. Calorimetry tilbyr en sanntid tilnærming for å måle mobilnettet varmeproduksjon, som ukritisk oppdager både aerob og anaerob trasé. Dette er basert på grunnlaget at ingen energi er byttet i systemet unntatt gjennom vegger av eksperimentell ampule8. En endring i varmespredning er lik endringen i entalpi løslatt fra alle metabolske reaksjoner i ampule. Dermed korrelerer en negativ entalpi til tap av varme fra systemet. Uttømmende forskning de siste fire tiårene har preget termodynamisk landskapet katabolisme og anabolism. Dette representeres av en jevn økning i forskningsartikler funnet under søkeord "biologisk" og "calorimetry" som indekseres av det USA nasjonale bibliotek av medisin (NLM) på National Institutes of Health (PubMed). Søk avslører at før 1970, totalt 27 publikasjoner referanse biologiske calorimetry; i mellomtiden, i 2016 alene, 546 publikasjoner benyttet teknikken.
Calorimetric er godt etablert å bestemme varmeproduksjon. Imidlertid gis mer fleksibilitet for å løse respirometric verdien. Respirometric måling kan bestå av O2, CO2, eller både O2 og CO2. Videre kan måling av O2 eller CO2 oppnås ved ulike teknikker, inkludert optrodes, Clark-type elektroder og tunable diode laser absorpsjon spektroskopi7,9,10 ,11. Mens CO2 produksjon er en verdifull beregning i mange respirometric studier, benytter mediet for kulturperler celler ofte en bicarbonic buffer system for pH kontroll12,13. For å unngå komplikasjoner av CO2 mål i bikarbonat systemet, benytter følgende protokollen for calorespirometry av celler i kultur O2 som eneste respirometric parameter.
Samtidig med måle oksygen flux, visse respirometers (se Tabell for materiale) er utformet for detaljerte vurderinger av mitokondrie funksjon. Substrat-uncoupler-hemmer-titrations (SUIT) protokoller er godt etablert og er kompatible med eksperimenter utviklet for å måle membran potensial eller reaktive oksygen arter (ROS) dannelse14. Presentert protokollen for calorespirometry intakt celler er kompatibel med innføringen av kjemiske uncouplers som karbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) og F0F1-ATP syntase hemmer oligomycin. Gjennom tillegg av FCCP kan oksygenforbruk montert fra ATP produksjon, som er nyttig å vurdere effekten av potensielle therapeutics på mitokondrie peformance15. Videre belyser tillegg av oligomycin omfanget av lekkasje åndedrett. Dermed er respirometric målinger utført under calorespirometry kompatibel med omfattende protokoller for ytterligere belyse mitokondrie fysiologi.
Samtidig måling av både varmespredning og oksygen flux lar for beregning av calorespirometric (CR) forholdet. Dette forholdet er deretter sammenlignet med Thorntons konstant eller den teoretiske oxycaloric tilsvarende, som varierer mellom-430 til-480 kJ mol-1 avhengig av cellen linje eller vev rundt og supplert karbon underlag1, 16. dermed negative CR forholdet avslører økt bidrag fra anaerob trasé til samlede metabolsk aktivitet. For eksempel varierer CR forholdet for rutinemessig muskel vev respirasjon uten aktive ytelsen arbeid fra-448 til-468 kJ mol-1 som er innenfor rekkevidden av den teoretiske oxycaloric tilsvarende17,18. Samtidig pattedyr kreftceller kultivert i medium som er høyt i glukose vise forbedret melkesyre gjæring etter Glykolysen og lav relativt mitokondrie engasjement19. Denne fenotypen resultatene i CR forhold i området av-490 til-800 kJ mol-1, viser en økt engasjement av de anaerob i mobilnettet metabolismen som indikert av negative CR prosenter1,7, 16,20.
Både kommersielle og non-profit celler og vev distributører for øyeblikket tilbyr linjer over 150 arter, med nesten 4000 cellelinjer avledet fra mennesker. Udødeliggjort cellelinjer er praktisk verktøy for å raskt vurdere toksisitet av potensielle therapeutics, mange av dem direkte eller indirekte forstyrre mitokondrie funksjoner. Bruke transformert celler under narkotikarelaterte screening kan skyldes begrenset prediktiv verdi delvis Warburg effekten, et kjennetegn på mange kreft. Ofte kreft generere ATP fra substrat nivå fosforylering og opprettholde redoks balanse gjennom produksjon av laktat uten fullt engasjere mitokondrie under aerobe forhold19. Farmasøytisk utvikling er svært kostbare og ineffektive, og med ca 8 av 9 forbindelser testet i menneskets kliniske forsøk ikke å oppnå markedet godkjenning21. Mens potensielle therapeutics kan passere første screening på grunn av lav cytotoksisitet i linjer, er det mulig at noen av disse forbindelsene er mitotoxic. Uten en egnet metode for å oppdage hvor disse giftstoffene kan svekke energibalansen i primære celler som ikke viser Warburg effekten, er viktig informasjon ofte over så, flaskehalser terapeutiske utvikling i tidlige stadier.
Calorespirometry er en praktisk, noninvasive tilnærming til å analysere metabolsk aktivitet i en rekke biologiske prøver, inkludert celler og vev. Kjernen i presentert protokollen er kompatibel med en rekke applikasjoner. En komplikasjon, men har blitt identifisert. Udødeliggjort celler er ofte kultivert i et glukose-fri medium med galaktose å øke bidraget av oxidative fosforylering (OXPHOS) for energiproduksjon, for å bevisstgjøre cellene til potensielle mitotoxins22, 23. Denne metabolske omprogrammering synes å skjule analyse når prøvene er plassert i rustfritt stål ampuller brukes av de calorimeter15. Celler kultivert i et glukose medium fortsette å engasjere seg i høy metabolsk aktivitet i flere timer. Samtidig redusere celler kultivert i galaktose medium varme produksjonen innen 30 min av deres plassering i ampule, å gjøre målinger begrenset til tidlige eksperimentelle tidspunkt. Denne virkemåten hindrer dessverre mulighet til å vurdere deres cellular spredning. Til tross for denne bestemte begrensninger, de fleste programmer er kompatible med calorespirometric analyse og detaljert metabolske informasjon kan fås gjennom denne tilnærmingen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HepG2 Cells</td>
			<td style="width:125px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">HB-8065</td>
			<td style="width:167px;">Cells used for calorespirometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">O2k-Respirometer</td>
			<td style="width:125px;">Oroboros Instruments</td>
			<td style="width:119px;">10022-02</td>
			<td>Respirometer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermometric AB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thermometric was purchased by TA Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>100x solution added to DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum - Premiuim Select</td>
			<td style="width:125px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Added to 10% in DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsn-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">O4876</td>
			<td>Mitochondrial Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2920</td>
			<td>Mitochondrial Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td style="width:125px;">Corning Corporation</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td>Tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glucose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15023021</td>
			<td>Glucose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galactose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP656500</td>
			<td>Galactose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Glutamine for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, no glucose</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11966025</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calorespirometry: a powerful, noninvasive approach to investigate cellular energy metabolism

Mange linjer brukes i grunnleggende biologisk og biomedisinsk forskning opprettholde energi homeostase gjennom en kombinasjon av både aerob og anaerob åndedrett. Men er omfanget som begge veier bidra til landskapet av mobilnettet energiproduksjon konsekvent oversett. Transformert celler kultivert i mette nivåer av glukose ofte viser en redusert avhengighet oxidative fosforylering for ATP produksjon, som er kompensert av en økning i underlaget nivå fosforylering. Dette skiftet i metabolske likevekt kan cellene til spredning til tross for tilstedeværelsen av mitokondrie giftstoffer. I forsømme den endrede metabolske likevekt transformert celler, resultater fra en farmasøytisk screening kan mistolkes siden den mitotoxic effekter kan ikke oppdages ved hjelp av modellen cellelinjer kulturperler i nærvær av høy glukose konsentrasjoner. Denne protokollen beskriver sammenkoblingen av to kraftige teknikker, respirometry og calorimetry, som tillater kvantitative og noninvasive vurdering av både aerob og anaerob bidrag til mobilnettet ATP produksjon. Både aerob og anaerob respirations genererer varme, som kan overvåkes via calorimetry. I mellomtiden kan måle frekvensen av oksygenforbruk vurdere omfanget av aerobic åndedrett. Når både varmespredning og oksygenforbruk måles samtidig, kan calorespirometric forholdet bestemmes. Eksperimentelt innhentet verdien kan deretter bli sammenliknet med den teoretiske oxycaloric tilsvarende og omfanget av anaerob åndedrett kan bedømmes. Dermed gir calorespirometry en unik metode for å analysere et bredt spekter av biologiske spørsmål, inkludert narkotika utvikling, mikrobiell vekst og grunnleggende bioenergi under både normoxic og hypoxic forhold.

Reproduserbarhet måleenheter calorespirometric avhenger av en korrekt og konsistent eksempel forberedelse. Prøver forberedt fra cellekultur bør ikke brukes hvis platene er overgrodd, som celletall kan bli unøyaktig på grunn av klumper. Videre, redusert varme flyter på grunn av begrenset substrat spredning i de clumped cellene kan oppstå. Derfor, når bruker tilhenger celler, er det viktig å velge en plate med confluency mellom 60-80% og endre mediet 24 timer før eksperimentet.
Riktig ...

Watch this Scientific Journal Video about Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism at JoVE.com

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: En kraftig, Noninvasive tilnærming til undersøke Cellular energi metabolisme

Denne protokollen beskriver calorespirometry, direkte og samtidig måling av både varmespredning og åndedrett, som gir en noninvasive tilnærming for å vurdere energi metabolisme. Denne teknikken brukes til å vurdere bidrag av både aerob og anaerob til å energi ved å overvåke totale cellular energiflyten.

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Regissert Cellular Self-Assembly å dikte Cell-Avledet Tissue Rings for Biomekaniske Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Uttak for Målrettet Stabil isotopfortynning Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

Etablering av et kirurgisk indusert Model i mus for å undersøke den beskyttende rollen Progranulin i Artrose

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS-aktivert Noninvasiv Metabolsk profilering

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Fra voxel til Kunnskap: En praktisk guide til Segmentering av Complex Elektronmikros 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar Gradient Diffusion System for å etterforske Chemotaxis i en 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

En eksperimentell og Finite Element-protokollen for å undersøke Transport av nøytrale og siktet Oppløste stoffer over Leddbrusk

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Arbeidsflyt basert på kombinasjonen av isotopanrikning Tracer eksperimenter for å undersøke mikrobiell metabolismen av flere næringsstoffer kilder

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...