Name: calorespirometry: a powerful, noninvasive approach to investigate cellular energy metabolism
Uploaded: 2018-05-31T14:30:00
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Este trabajo fue financiado en parte por la subvención de la National Science Foundation 160944 Mary E. Konkle y Michael A. Menze.

1. cultivo celular
<ol><li>Mantener las células del carcinoma (HepG2) hepatocelular humano en medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y sustratos adicionales (10 mM de glucosa, glutamina 2 mM y 1 mM piruvato) a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular (5% CO2 , 95% aire, 100% de humedad). Nota: Utilice la anterior formulación de DMEM al DMEM se hace referencia en pasos posteriores para la respirometría y calorimetría.</li>
	<li>La placa de las celdas ...

<ol>
	<li>Gnaiger, E., Kemp, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+metabolism+in+aerobic+mammalian+cells:+information+from+the+ratio+of+calorimetric+heat+flux+and+respirometric+oxygen+flux.">Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).</li><li>Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+the+specific+rate+of+catabolic+activity+(Ac)+from+the+heat+flow+rate+of+soil+microbial+reactions+measured+by+calorimetry:+significance+and+applications.">Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications.</a> Chemistry &amp; Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).</li><li>Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbicide+and+estrogen+effects+on+the+metabolic+activity+of+Elliptio+complanata+measured+by+calorespirometry.">Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).</li><li>Wadso, L., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorespirometry+of+terrestrial+organisms+and+ecosystems.">Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems.</a> Methods. 76, 11-19 (2015).</li><li>Gnaiger, E., Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+energetics+at+very+low+oxygen:+information+from+calorimetry+and+respirometry.">Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry.</a> Strategies for Gas Exchange and Metabolism. , 149-171 (1991).</li><li>Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+calorespirometric+ratios+of+soil+microbial+metabolism.">Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism.</a> Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).</li><li>Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+preconditioning+of+cells+with+AICAR-riboside:+improved+cryopreservation+and+cell-type+specific+impacts+on+energetics+and+proliferation.">Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation.</a> Cryobiology. 61, 79-88 (2010).</li><li>Webb, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Calorimetry. , (1985).</li><li>Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+modified+atmospheres+on+diapausing+5th+instar+codling+moth+metabolism.">Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism.</a> Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).</li><li>Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+application+of+tunable+diode+laser+absorption+spectroscopy+and+isothermal+micro-calorimetry+for+calorespirometric+analysis.">A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).</li><li>Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ascorbic+acid+and+light+on+reactions+in+fresh-cut+apples+by+microcalorimetry.">Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry.</a> Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).</li><li>Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+metabolic+heat+rate,+CO2+production,+and+O2+consumption+by+microcalorimetry.">Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).</li><li>Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+calorimetric+and+respirometric+measurements+on+plant-tissues.">Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues.</a> Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).</li><li>Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+cellular+energetics+by+galactose+and+pioglitazone.">Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone.</a> Cell and Tissue Research. , (2017).</li><li>Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+calorespirometric+ratios,+heat+per+CO2+and+heat+per+O2,+to+quantify+metabolic+paths+and+energetics+of+growing+cells.">Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells.</a> Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).</li><li>Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetric+determination+of+energy+expenditure+due+to+active+sodium-potassium+transport+in+the+soleus+muscle+and+brown+adipose+tissue+of+the+rat.">Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat.</a> The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).</li><li>Paul, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+biochemical+energy+balance+during+an+isometric+tetanus+and+steady+state+recovery+in+frog+sartorius+at+0+degree+C.">Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C.</a> Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Kemp, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+calorimetric-respirometric+ratio+in+studying+intermediary+metabolism+of+cultured+mammalian+cells.">Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells.</a> Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).</li><li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+pharmaceutical+industry+reduce+attrition+rates?.">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).</li><li>Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+HepG2+cells+to+identify+direct+mitochondrial+dysfunction+in+the+absence+of+cell+death.">The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death.</a> Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).</li><li>Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+substrate+modulates+mitochondrial+structure+and+oxidative+capacity+in+cancer+cells.">Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells.</a> Cancer Research. 64, 985-993 (2004).</li><li>Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetric+measurement+of+aerobic+cell-metabolism+in+unstirred+cell-cultures.">Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures.</a> Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).</li></ol>

El objetivo de calorespirometry es evaluar cuantitativamente la contribución de las vías aeróbicas y anaeróbicas a actividad metabólica y obtener una vista compuesta de flujo de la energía celular. Esto se logra mediante una medición simultánea de la disipación de calor y flujo de oxígeno, seguido por una comparación de la proporción de CR calculada con la oxycaloric teórica equivalente. Deben considerarse varios pasos críticos para datos reproducibles y confiables. El mantenimiento de un cultivo celular es...

En los sistemas biológicos, el cambio de la liberación de calor o entalpia durante el metabolismo suele ser supervisado ya sea directamente (vía directa calorimetría) o indirectamente por el consumo de O2 y CO2 producción (mediante respirometría). Desafortunadamente, cuando estas técnicas se utilizan en el aislamiento, información crítica se pierde, como la contribución de las vías anaerobias al metabolismo celular. Calorespirometry es una técnica poderosa que se basa en la medición simultánea de la disipación de calor y respiración. Calorespirometric labor pionera investigó el metabolismo anaerobio en células de mamífero totalmente oxigenadas y demostrado aportes simultáneos de las vías aeróbicas y anaeróbicas a la homeostasis de la energía a pesar de las células transformadas en un ambiente completamente oxigenada1. Calorespirometry desde entonces se ha aplicado a una amplia variedad de cuestiones biológicas. Algunos ejemplos incluyen el estudio de la energía animal en niveles bajos de oxígeno, los efectos del herbicida y estrógeno en las branquias de bivalvos, el metabolismo de organismos terrestres y la descomposición microbiana del suelo orgánico materia2, 3 , 4 , 5 , 6. Además, calorespirometry ha reveló cómo metabólica preacondicionamiento antes de congelación mejora la crioconservación de mamíferos las células7. Cada enfoque, calorimetría y respirometría, independientemente se ha incrementado nuestro conocimiento de la bioenergía celular y organismo. Sin embargo, cuestiones biológicas fundamentales que pueden ser contestadas mediante el uso de calorespirometry permanecen relativamente inexploradas.
Ley de Hess establece que el cambio total de entalpía de una reacción es independiente de la vía entre los Estados iniciales y finales. Por ejemplo, el cambio de entalpía total de un camino bioquímico es la suma del cambio en entalpías de todas las reacciones dentro de la vía. Calorimetría ofrece un enfoque en tiempo real para medir la producción de calor celular, que detecta indiscriminadamente las vías aeróbicas y anaeróbicas. Esto se basa en la Fundación que ninguna energía se intercambia en el sistema excepto a través de las paredes de la ampolla experimental8. Un cambio en la disipación de calor es igual al cambio en entalpía liberada de todas las reacciones metabólicas en la ampolla. Así, una entalpía negativa se corresponde con una pérdida de calor del sistema. Investigación exhaustiva sobre las últimas cuatro décadas ha caracterizado el paisaje termodinámico de catabolismo y anabolismo. Esto está representado por un aumento sostenido en los artículos de investigación en los términos de búsqueda "biológicos" y "calorimetría" como indexadas por los Estados Unidos Biblioteca Nacional de medicina (NLM) en los institutos nacionales de salud (PubMed). La búsqueda revela antes de 1970, un total de 27 publicaciones referencia calorimetría biológica; mientras tanto, en el 2016 solo, 546 publicaciones utilizan la técnica.
Calorimétricas métodos están bien establecidos para determinar la producción de calor. Sin embargo, se otorga mayor flexibilidad para resolver el valor respirométricos. La medición respirométricos puede consistir en O2, CO2, o ambos O2 y CO2. Además, la medición de O2 o CO2 puede lograrse mediante varias técnicas, incluyendo optrodes, electrodos tipo Clark y absorción de láser de diodo sintonizable espectroscopia de9,de7,10 ,11. Mientras que la producción de CO2 es una medida valiosa en muchos estudios respirométricos, el medio para las células cultivadas a menudo utiliza un sistema bicarbonic para control de pH12,13. Para evitar las complicaciones de la medición de CO2 en el sistema del bicarbonato, el siguiente protocolo para la calorespirometry de las células en cultivo utiliza O2 como único parámetro respirométricos.
Concurrente con la medición de flujo de oxígeno, ciertos respirometers (véase Tabla de materiales) están diseñados para evaluaciones detalladas de la función mitocondrial. Protocolos (traje) de sustrato-uncoupler-inhibidor-titulaciones están bien establecidos y son compatibles con experimentos diseñados para medir la membrana potencial o reactivas de oxígeno (ROS) las especies formación14. El protocolo presentado para calorespirometry de las células intactas es compatible con la introducción de uncouplers químicos como cianuro de carbonilo-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) y el F0F1-ATP sintasa inhibidor oligomycin. Mediante la adición de FCCP, consumo de oxígeno puede ser desacoplado de la producción de ATP, que es útil para evaluar el impacto de la terapéutica potencial en el funcionamiento mitocondrial15. Además, la adición de oligomycin ilumina el grado de respiración de escape. Así, las mediciones respirométricos realizadas durante calorespirometry son compatibles con protocolos extenso diseñados para aclarar más lejos la fisiología mitocondrial.
La medida simultánea de la disipación de calor y flujo de oxígeno permite el cálculo de la relación calorespirometric (CR). Este cociente se compara constante de Thornton o la oxycaloric teórica equivalente, que oscila entre-430 a-480 kJ mol-1 dependiendo de la línea de células o tejidos de interés y el carbón suplido sustratos1, 16. por lo tanto, una relación más negativa de CR revela aumento de las contribuciones de vías anaeróbicas a la actividad metabólica general. Por ejemplo, la proporción de CR para la respiración de los tejidos musculares rutina sin el desempeño activo de trabajo oscila entre-448 y-468 kJ mol-1, que es dentro de la gama del oxycaloric teórico equivalente17,18. Mientras tanto, las células del cáncer mamíferos cultivadas en medio alto en glucosa Mostrar mayor ácido láctico fermentación después de glicolisis y relativamente baja participación mitocondrial19. Este resultados de fenotipo en las tasas de CR en la gama de-490 a-800 kJ mol-1, demostrando una mayor implicación de las vías anaerobias en el metabolismo celular como indica más negativas CR ratios1,7, 16,20.
Distribuidores de células y tejidos tanto comerciales como sin fines de lucro actualmente oferta de líneas de celulares de más de 150 especies, con casi 4.000 líneas celulares derivan de los seres humanos. Líneas celulares inmortalizadas son herramientas convenientes para la evaluación rápida de la toxicidad de la terapéutica potencial, muchos de los cuales pueden interferir directa o indirectamente con las funciones mitocondriales. Usando las células transformadas durante la detección de drogas puede ser un valor predictivo limitado en parte debido al efecto de Warburg, un rasgo distintivo de muchos cánceres. A menudo, los cánceres generan ATP fosforilación a nivel de sustrato y equilibrio redox a través de la producción de lactato sin comprometer completamente la mitocondria bajo condiciones aerobias19. Desarrollo farmacéutico es muy costoso e ineficiente, con 8 de los 9 compuestos probados en ensayos clínicos en humanos no lograr la aprobación de mercado21. Mientras que la terapéutica potencial puede pasar revisión inicial debido a la baja citotoxicidad en líneas celulares, es posible que algunos de estos compuestos son mitotoxic. Sin un método adecuado para detectar cómo estas toxinas pueden afectar el balance de energía en las células primarias que no muestran el efecto de Warburg, información crítica suele ser alto, cuellos de botella desarrollo terapéutico en fases tempranas.
Calorespirometry es un enfoque práctico, no invasivo para analizar la actividad metabólica en una variedad de muestras biológicas, incluidas las células y los tejidos. El núcleo del protocolo presentado es compatible con una gama de aplicaciones. Una complicación, sin embargo, ha sido identificada. Las células inmortalizadas a menudo se cultivan en un medio libre de glucosa con la galactosa para aumentar la contribución de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) para la producción de energía, con el fin de sensibilizar las células a potenciales mitotoxins22, 23. Esta reprogramación metabólica parece oscurecer el análisis cuando las muestras se colocan en las ampollas de acero inoxidable utilizados por el calorímetro15. Las células cultivadas en un medio de glucosa seguirán en alta actividad metabólica durante varias horas. Mientras tanto, las células cultivadas en medio de galactosa disminuyen la producción de calor dentro de 30 minutos de su colocación en la ampolla, de realizar medidas de restringido a puntos del tiempo experimental temprana. Este comportamiento, desafortunadamente, impide la oportunidad de evaluar su proliferación celular. A pesar de esta limitación específica, mayoría de las aplicaciones es compatible con el análisis de calorespirometric y toda la información metabólica puede obtenerse a través de este enfoque.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HepG2 Cells</td>
			<td style="width:125px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">HB-8065</td>
			<td style="width:167px;">Cells used for calorespirometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">O2k-Respirometer</td>
			<td style="width:125px;">Oroboros Instruments</td>
			<td style="width:119px;">10022-02</td>
			<td>Respirometer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermometric AB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Thermometric was purchased by TA Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>100x solution added to DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum - Premiuim Select</td>
			<td style="width:125px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11550</td>
			<td>Added to 10% in DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsn-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">O4876</td>
			<td>Mitochondrial Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:125px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2920</td>
			<td>Mitochondrial Uncoupler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td style="width:125px;">Corning Corporation</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td>Tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glucose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15023021</td>
			<td>Glucose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galactose, powder</td>
			<td style="width:125px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP656500</td>
			<td>Galactose for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Glutamine for DMEM medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, no glucose</td>
			<td style="width:125px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11966025</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calorespirometry: a powerful, noninvasive approach to investigate cellular energy metabolism

Muchas líneas celulares utilizadas en la investigación biológica y biomédica básica mantienen la homeostasis de la energía a través de una combinación de respiración aerobia y anaerobia. Sin embargo, la medida en que ambas vías contribuyan al paisaje de la producción de energía celular es constantemente pasado por alto. Las células transformadas se cultivan en los niveles de glucosa se satura a menudo muestran una dependencia disminuida en la fosforilación oxidativa para la producción de ATP, que es compensada por un aumento en la fosforilación a nivel de sustrato. Este cambio en el equilibrio metabólico permite a las células de proliferar a pesar de la presencia de las toxinas mitocondriales. En descuidar el equilibrio metabólico alterado de las células transformadas, los resultados de una investigación farmacéutica puedan ser mal interpretados desde el potencialmente efectos mitotoxic no pueden ser detectadas utilizando modelo de líneas de celulares cultivado en presencia de glucosa alta concentraciones. Este protocolo describe el apareamiento de dos poderosas técnicas, respirometría y calorimetría, que permite la evaluación cuantitativa y no invasiva de contribuciones aeróbicas y anaeróbicas a la producción de ATP celular. Respiración aerobia y anaerobia genera calor, que puede ser monitoreados mediante calorimetría. Mientras tanto, medir la tasa de consumo de oxígeno puede evaluar el grado de respiración aeróbica. Disipación de calor y consumo de oxígeno se miden al mismo tiempo, se puede determinar la relación calorespirometric. Puede entonces compararse con el valor experimentalmente obtenido el oxycaloric teórico equivalente y la amplitud de la respiración anaerobia puede ser juzgada. Así, calorespirometry ofrece un método único para analizar una amplia gama de cuestiones biológicas, incluyendo el desarrollo de medicamentos, crecimiento microbiano y bioenergéticas fundamentales bajo condiciones hipóxicas y normoxic.

La reproducibilidad de las mediciones de calorespirometric depende de una preparación adecuada y constante. Muestras preparadas a partir de cultivos celulares deben no utilizarse si las placas son muy crecidas, como recuentos de células pueden ser inexactos debido a la aglutinación. Además, flujos de calor reducida debido a la difusión limitada de sustrato en las células agrupadas pueden ocurrir. Por lo tanto, al utilizar células adherentes, es fundamental seleccionar una placa con la confluencia entre 60-80% y ca...

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Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: Es un enfoque potente y no invasivo para investigar el metabolismo energético celular

Este protocolo describe calorespirometry, la medición directa y simultánea de disipación de calor y la respiración, lo que proporciona un enfoque no invasivo para evaluar el metabolismo energético. Esta técnica se utiliza para evaluar la contribución de las vías aeróbicas y anaeróbicas para utilización de la energía mediante el control del flujo total de energía celular.

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

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Investigación

Bioingeniería

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Dirigida celular de auto-ensamblaje para fabricar células derivadas de tejido para el análisis de anillos de Biomecánica e Ingeniería de Tejidos

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

Establecimiento de un modelo quirúrgicamente inducida en ratones para investigar el papel de protección de progranulina en la osteoartritis

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS habilitadas no invasiva perfiles metabólicos

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Desde Voxels al Conocimiento: Una Guía Práctica para la segmentación del Complejo Microscopía Electrónica 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar Sistema de Difusión de degradado para Investigar quimiotaxis en una matriz de colágeno 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Un experimental y el Protocolo de elementos finitos para investigar el transporte de solutos neutros y cargadas a través de cartílago articular

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Flujo de trabajo basado en la combinación de trazador isotópico experimentos para investigar el metabolismo microbiano de múltiples fuentes de nutrientes

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...