Name: a flow cytometry-based assay for measuring mitochondrial membrane potential in cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation
Uploaded: 2018-07-13T13:00:00
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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da The National Key Research e programma di sviluppo della Cina (n. 2017YFC1700503), il programma nazionale di ricerca base (973 programma) della Cina (No.2012CB518602), National Natural Science Foundation of China (No. 81370223 e no. 81573957) e la Fondazione di ricerca innovativa degli specializzandi del Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).

1. preparazione dei reagenti e soluzioni
<ol><li>Preparare il supporto completo di miociti cardiaci umani (HCMs) aggiungendo 25 mL di miscela di supplemento del miocita crescita medio a 500 mL di Medium di crescita del miocita secondo le istruzioni del produttore. Conservare a 4 ° C e riscaldare a 37 ° C prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare la soluzione di Tongxinluo (TXL) sciogliendo il polvere ultrafine TXL in privo di siero e glucosio di Dulbecco modificato medio dell'Aquila (DMEM) e regolare la concentrazione di T...

<ol>
	<li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Myocardial+Infarction.">Acute Myocardial Infarction.</a> New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li><li>Ibanez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESC+Guidelines+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation:+The+Task+Force+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation+of+the+European+Society+of+Cardiology+(ESC).">ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).</li><li>Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+reperfusion+injury.">Myocardial reperfusion injury.</a> New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).</li><li>Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+its+role+in+myocardial+ischemia+reperfusion+injury.">The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).</li><li>Heusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+cardioprotection:+signal+transduction+in+ischemic+pre-,+post-,+and+remote+conditioning.">Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning.</a> Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).</li><li>Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+an+isolated+mitochondrial+population+revealed+by+cytofluorometric+analysis+at+the+single+organelle+level.">Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level.</a> Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).</li><li>Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+and+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+cerebellar+granule+cells.">Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).</li><li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient:+a+practical+usage+guide.">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).</li><li>Cossarizza, A., Salvioli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+using+JC-1.">Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1.</a> Current Protocols in Cytometry. , 14 (2001).</li><li>Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JC-1,+but+not+DiOC6(3)+or+rhodamine+123,+is+a+reliable+fluorescent+probe+to+assess+delta+psi+changes+in+intact+cells:+implications+for+studies+on+mitochondrial+functionality+during+apoptosis.">JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis.</a> FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).</li><li>Chen, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+miR-128-3p+by+Tongxinluo+Protects+Human+Cardiomyocytes+from+Ischemia/reperfusion+Injury+via+Upregulation+of+p70s6k1/p-p70s6k1.">Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).</li><li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+autophagy+by+Tongxinluo+through+the+MEK/ERK+pathway+protects+human+cardiac+microvascular+endothelial+cells+from+hypoxia/reoxygenation+injury.">Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+protects+mesenchymal+stem+cells+against+hypoxia+and+serum+deprivation-induced+apoptosis.">Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis.</a> Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+mitochondria+with+JC-1.">Labeling mitochondria with JC-1.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).</li><li>Pravdic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetic-induced+preconditioning+delays+opening+of+mitochondrial+permeability+transition+pore+via+protein+Kinase+C-epsilon-mediated+pathway.">Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway.</a> Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Excessive+Histone+Deacetylases+Activity+in+Diabetic+Hearts+Attenuates+Myocardial+Ischemia/Reperfusion+Injury+via+Mitochondria+Apoptosis+Pathway.">Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway.</a> Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).</li><li>Qiu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin-induced+melanoma+cell+death+is+associated+with+mitochondrial+permeability+transition+pore+(mPTP)+opening.">Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).</li><li>Zhen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P53+dependent+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+is+required+for+dexamethasone-induced+death+of+osteoblasts.">P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts.</a> Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).</li><li>Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox2+as+a+potential+target+of+mitochondrial+superoxide+and+its+role+in+endothelial+oxidative+stress.">Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).</li><li>Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+mitochondrial+KATP+channel+on+voltage-gated+K++channel+in+24+hour-hypoxic+human+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).</li><li>Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neuroprotective+Effects+of+Hypothermia+on+Bilirubin-Induced+Neurotoxicity+in+vitro.">The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro.</a> Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).</li><li>Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+activation+by+Jiang+Zhi+Granule+protects+against+metabolic+stress-induced+hepatocyte+injury.">Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury.</a> World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).</li><li>El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renoprotective+Effects+of+Aldose+Reductase+Inhibitor+Epalrestat+against+High+Glucose-Induced+Cellular+Injury.">Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury.</a> Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).</li><li>Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Liver+Mitochondria+Isolation,+Size+Fractionation,+and+Real-time+MOMP+Measurement.">Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement.</a> Bio-Protocols. 6 (15), (2016).</li></ol>

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza la tintura JC-1 per valutare il MMP delle cellule dopo essere stati esposti per H/R. rilevato dall'analisi di JC-1, MMP delle cellule è indipendente da fattori quali dimensione mitocondriale, forma e densità che possono influenzare la fluorescenza di singolo-componente segnali di14. Di conseguenza, i risultati dell'analisi di JC-1 sono relativamente affidabili. Inoltre, è conveniente e risparmio di tempo per eseguire l'analisi di JC-1. Questo test ha ...

Malattia coronarica è la principale causa di morte in tutto il mondo. Il trattamento della scelta per ridurre la lesione ischemica e limitando la dimensione di infarto in pazienti con ST-segmento elevato l'infarto miocardico è tempestiva ed efficace riperfusione miocardica via primaria intervento coronarico percutaneo (PCI)1, 2. Tuttavia, riperfusione determina danni aggiuntivi, che possono rappresentare fino al 30% della dimensione finale infarto3. È universalmente riconosciuto che il poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mPTP) non è solo centrale nella morte delle cellule e danno mitocondriale durante ischemia/riperfusione (I / R), ma è anche un obiettivo convergente di cardioprotective segnalazione4 , 5. come l'apertura di mPTP porterebbe a depolarizzazione della membrana mitocondriale interna potenziali (MMP)4, abbiamo rilevato mPTP apertura utilizzando 5, 5 ', 6, 6 '-Tetrachloro-1, 1 ′, 3, 3 '-tetraetile-imidacarbocyanineiodide (JC-1) dosaggio.
L'analisi di JC-1 è un metodo di citofluorimetria che è sia qualitativa che quantitativa, e che è stato ulteriormente convalidato analizzando le MMP al livello di un singolo mitocondri6. JC-1 esiste come forma aggregata, producendo un colore rosso a emissione colorata arancione (590 nm ± 17,5) nella matrice dei mitocondri con MMP normale; con la perdita di MMP, JC-1 viene convertito in forma monomerica che produce fluorescenza verde con un'emissione di 530 ± 15 nm. Di conseguenza, una diminuzione nel rapporto di intensità della fluorescenza rosso/verde potrebbe indicare la riduzione delle MMP in condizioni quali l'ischemia/riperfusione (I / R).
Oltre a JC-1, MMP è stato anche studiato con membrana permeabile cationi lipofilici quali rodamina 123 e 3, 3 '-dihexyloxadicarbocyanine ioduro [DiOC6(3)]. Tuttavia, rispetto a queste due sonde, JC-1 è più affidabile per l'analisi di MMP. Rodamina 123 ha relativamente scarsa sensibilità (soprattutto in tempra modalità7,8) e scarsa specificità. Lo spostamento in rodamina 123 a volte è così piccolo che è difficile per i ricercatori o attrezzature osservare/rilevare. Inoltre, in una singola cella, ci sono siti di legame del mitocondrio differenti per rodamina 123 e così che esso può avere fluorescenza diverse emissioni9. DiOC6(3) non è raccomandato per la rilevazione di MMP o come reagisce in maniera sensibile per la depolarizzazione della membrana plasmatica10.
Pertanto, qui usiamo l'analisi di JC-1 per valutare il MMP di HCMs dopo essere stati esposti ad ipossia/riossigenazione con o senza un agente protettivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="970">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:293px;">Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1</td>
			<td style="width:307px;">Beyodtime, China</td>
			<td style="width:80px;">C2006</td>
			<td style="width:291px;">In the kit there are JC-1 stock solution (200&#215;), stock staining buffer (5&#215;) and CCCP(10mM)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tongxinluo ultrafine powder</td>
			<td>Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China</td>
			<td>071201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:293px;">Annexin V-FITC/PI Kit</td>
			<td>Becton-Dickinson, USA</td>
			<td>556547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA</td>
			<td>11966-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human cardiac myocyte</td>
			<td>Promocell, Germany</td>
			<td>C-12810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:293px;">Myocyte Growth Medium 
			(SupplementMix)</td>
			<td>Promocell, Germany</td>
			<td>C-39275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Myocyte Growth Medium (Ready-to-use)</td>
			<td>Promocell, Germany</td>
			<td>C-22070</td>
			<td>used with Myocyte Growth Medium SupplementMix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GENbox</td>
			<td>BioM&#233;rieux, Marcy l&#8217;Etoile, France</td>
			<td>96127</td>
			<td>2.5L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catalyst (AnaeroPack)</td>
			<td>MITSUBISHI GAS CHEMICAL&#160;COMPANY, INC.&#160;, Japan</td>
			<td>&#160;C-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anaerobic indicator</td>
			<td>BioM&#233;rieux, Marcy l&#8217;Etoile, France</td>
			<td>96118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Flow cytometer</td>
			<td>Becton-Dickinson, USA</td>
			<td>FACSAria 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BD FACSDiva Software</td>
			<td>Becton-Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td>Version8.0.1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample tube</td>
			<td>Corning science, USA</td>
			<td>352054</td>
			<td>12*75mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Hyclone, USA</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based assay for measuring mitochondrial membrane potential in cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation

Tempestivo ed efficace riperfusione dell'arteria coronaria occlusa è la migliore strategia per ridurre la dimensione di infarto del miocardio in pazienti con un segmento ST elevato di infarto miocardico. Tuttavia, riperfusione di per sé può provocare ulteriore del cardiomyocyte, un fenomeno noto come lesione di riperfusione. L'apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mPTP), con la diminuzione del potenziale di membrana mitocondriale (MMP), o la depolarizzazione mitocondriale, è universalmente riconosciuto come il passaggio finale di riperfusione ed è responsabile mitocondriale e morte dei cardiomiociti. JC-1 è una tintura cationica lipofilica che si accumula in mitocondri a seconda del valore di MMP. Più alto è il MMP, più JC-1 si accumula nei mitocondri. La quantità crescente di JC-1 in mitocondri può essere riflessa da uno spostamento di emissione di fluorescenza da verde (~ 530 nm) al rosso (~ 590 nm). Quindi, la riduzione del rapporto dell'intensità di fluorescenza rosso/verde può indicare la depolarizzazione dei mitocondri. Qui, prendiamo vantaggio di JC-1 per misurare MMP, o l'apertura di mPTP in miociti cardiaci umani dopo ipossia/riossigenazione, rilevato tramite flusso cytometry.

Prima di eseguire il test di JC-1 per valutare i cambiamenti di MMP, si consiglia vivamente che gli esperimenti condotti per confermare le condizioni correttamente impostato dai ricercatori. Come dimostrano i risultati di citometria a flusso (Figura 2), rispetto al gruppo normale, ipossia/riossigenazione (H/R) significativamente indotta l'apoptosi di HCMs (Annessina V + /PI±), che indica che avevamo stabilito un modello basato su cellule di I / R (± 45.00 2...

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A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza la tintura JC-1 per valutare il potenziale di membrana mitocondriale delle cellule dopo l'esposizione all'ipossia/riossigenazione con o senza un agente protettivo.

Un'analisi basata su citometria a flusso per misurare il potenziale di membrana mitocondriale in miociti cardiaci dopo ipossia/riossigenazione

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

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