Name: a flow cytometry-based assay for measuring mitochondrial membrane potential in cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation
Uploaded: 2018-07-13T13:00:00
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この研究は、国立キー研究と開発中国プログラム (第 2017YFC1700503) からの補助金によって支えられた国家の基本的な研究プログラム (973 プログラム) 中国 (No.2012CB518602)、中国の国家自然科学基金 (号 81370223号 81573957)、北京連合医学の大学 (2016-1002-01-02) の院生の革新的な研究財団。

1. 試薬および解決の準備
<ol><li>ひと心筋細胞 (HCMs) 完全培地を準備するには、製造元の指示に従って細胞成長培地 500 mL に細胞成長培地補足ミックスの 25 mL を追加します。4 ° C で使用する前に 37 ° C に暖かい店。</li>
	<li>Tongxinluo (TXL) ソリューションを準備 TXL 無血清/グルコースの超微粉体を溶解することによりダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) と DMEM (詳細についてを参照してください<sup...

<ol>
	<li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Myocardial+Infarction.">Acute Myocardial Infarction.</a> New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li><li>Ibanez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESC+Guidelines+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation:+The+Task+Force+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation+of+the+European+Society+of+Cardiology+(ESC).">ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).</li><li>Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+reperfusion+injury.">Myocardial reperfusion injury.</a> New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).</li><li>Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+its+role+in+myocardial+ischemia+reperfusion+injury.">The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).</li><li>Heusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+cardioprotection:+signal+transduction+in+ischemic+pre-,+post-,+and+remote+conditioning.">Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning.</a> Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).</li><li>Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+an+isolated+mitochondrial+population+revealed+by+cytofluorometric+analysis+at+the+single+organelle+level.">Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level.</a> Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).</li><li>Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+and+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+cerebellar+granule+cells.">Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).</li><li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+miR-128-3p+by+Tongxinluo+Protects+Human+Cardiomyocytes+from+Ischemia/reperfusion+Injury+via+Upregulation+of+p70s6k1/p-p70s6k1.">Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).</li><li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+autophagy+by+Tongxinluo+through+the+MEK/ERK+pathway+protects+human+cardiac+microvascular+endothelial+cells+from+hypoxia/reoxygenation+injury.">Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+protects+mesenchymal+stem+cells+against+hypoxia+and+serum+deprivation-induced+apoptosis.">Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis.</a> Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+mitochondria+with+JC-1.">Labeling mitochondria with JC-1.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).</li><li>Pravdic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetic-induced+preconditioning+delays+opening+of+mitochondrial+permeability+transition+pore+via+protein+Kinase+C-epsilon-mediated+pathway.">Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway.</a> Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Excessive+Histone+Deacetylases+Activity+in+Diabetic+Hearts+Attenuates+Myocardial+Ischemia/Reperfusion+Injury+via+Mitochondria+Apoptosis+Pathway.">Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway.</a> Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).</li><li>Qiu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin-induced+melanoma+cell+death+is+associated+with+mitochondrial+permeability+transition+pore+(mPTP)+opening.">Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).</li><li>Zhen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P53+dependent+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+is+required+for+dexamethasone-induced+death+of+osteoblasts.">P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts.</a> Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).</li><li>Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+mitochondrial+KATP+channel+on+voltage-gated+K++channel+in+24+hour-hypoxic+human+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).</li><li>Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neuroprotective+Effects+of+Hypothermia+on+Bilirubin-Induced+Neurotoxicity+in+vitro.">The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro.</a> Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).</li><li>Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+activation+by+Jiang+Zhi+Granule+protects+against+metabolic+stress-induced+hepatocyte+injury.">Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury.</a> World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).</li><li>El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renoprotective+Effects+of+Aldose+Reductase+Inhibitor+Epalrestat+against+High+Glucose-Induced+Cellular+Injury.">Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury.</a> Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).</li><li>Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Liver+Mitochondria+Isolation,+Size+Fractionation,+and+Real-time+MOMP+Measurement.">Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement.</a> Bio-Protocols. 6 (15), (2016).</li></ol>

ここでは、JC 1 染料を使用して JC 1 アッセイによって H/r. 検出にさらされた後細胞の MMP を評価するプロトコルを提案する、セルの MMP はミトコンドリアのサイズ、形状、および単一成分蛍光に影響を及ぼすかもしれない密度などの要因から独立して14をを信号します。したがって、JC 1 アッセイの結果は比較的信頼性の高いです。その上、それは、便利で JC 1 分析を実行する...

冠動脈心疾患は、死の世界の主要な原因です。治療の選択肢の虚血性損傷を減らすことと st 患者の梗塞サイズを制限する心筋梗塞を高架は via 初回経皮的冠動脈インターベンション (PCI)1、タイムリーかつ効果的な心筋再灌流 2。ただし、再灌流は、最終梗塞サイズ3の 30% までを占めることができます追加の損傷を引き起こします。それは普遍的にミトコンドリア膜透過性遷移孔 (mPTP) がだけ虚血/再灌流時のミトコンドリアの損傷および細胞死の中心ではないことを認めたが (私/R)、心保護4信号の収束先ではまた,5. mPTP 開口部は内部のミトコンドリア膜電位 (MMP)4の脱分極もたらす、我々 検出 5, 5 ', を用いた mPTP 開口 1 '6'-テトラクロロ-m--1、6、3、3 '-エチル-imidacarbocyanineiodide (JC 1) 試金。
JC 1 アッセイは、定性と定量は、cytofluorimetric メソッドと単一ミトコンドリア6のレベルで MMP を分析することによってさらに検証されています。オレンジ色発光 (590 ± 17.5 nm) マトリックスで通常 MMP; とミトコンドリアの赤を産する集計形式として存在する JC 1MMP の損失と JC 1 は 530 ± 15 nm の発光と蛍光グリーンを生成する単量体のフォームに変換されます。したがって、赤/緑の蛍光強度比の減少は、虚血/再灌流などの条件で MMP の削減可能性 (私/R)。
JC-1 に加え MMP もローダミン 123 と 3, 3 '-dihexyloxadicarbocyanine ヨウ化 [DiOC6(3)] など脂溶性陽イオン膜透過性と研究されています。しかし、これらの 2 つのプローブと比較して、JC 1 MMP の分析信頼性の高いものです。ローダミン 123 (特にモード7、8を焼入) で比較的貧しい感度と貧しい人々 の特異性があります。ローダミン 123 のシフトは時々 観察検出する研究者または機器のハードが非常に小さいです。以外にも、単一のセルにローダミン 123 の異なるミトコンドリア結合部位がある、だからそれは、異なる蛍光排出量9を必要があります。DiOC6(3) は MMP を検出するためお勧めできませんのいずれかとして、それは血しょう膜10の脱分極に敏感に反応します。
したがって、ここで我々 は保護剤の有無を低酸素/再酸素化にさらされた後 HCMs MMP を評価するために JC 1 アッセイを使用します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="970">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:293px;">Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1</td>
			<td style="width:307px;">Beyodtime, China</td>
			<td style="width:80px;">C2006</td>
			<td style="width:291px;">In the kit there are JC-1 stock solution (200&#215;), stock staining buffer (5&#215;) and CCCP(10mM)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tongxinluo ultrafine powder</td>
			<td>Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China</td>
			<td>071201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:293px;">Annexin V-FITC/PI Kit</td>
			<td>Becton-Dickinson, USA</td>
			<td>556547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA</td>
			<td>11966-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human cardiac myocyte</td>
			<td>Promocell, Germany</td>
			<td>C-12810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:293px;">Myocyte Growth Medium 
			(SupplementMix)</td>
			<td>Promocell, Germany</td>
			<td>C-39275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Myocyte Growth Medium (Ready-to-use)</td>
			<td>Promocell, Germany</td>
			<td>C-22070</td>
			<td>used with Myocyte Growth Medium SupplementMix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GENbox</td>
			<td>BioM&#233;rieux, Marcy l&#8217;Etoile, France</td>
			<td>96127</td>
			<td>2.5L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Catalyst (AnaeroPack)</td>
			<td>MITSUBISHI GAS CHEMICAL&#160;COMPANY, INC.&#160;, Japan</td>
			<td>&#160;C-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anaerobic indicator</td>
			<td>BioM&#233;rieux, Marcy l&#8217;Etoile, France</td>
			<td>96118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Flow cytometer</td>
			<td>Becton-Dickinson, USA</td>
			<td>FACSAria 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BD FACSDiva Software</td>
			<td>Becton-Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td>Version8.0.1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sample tube</td>
			<td>Corning science, USA</td>
			<td>352054</td>
			<td>12*75mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Hyclone, USA</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based assay for measuring mitochondrial membrane potential in cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation

閉塞した冠動脈のタイムリーかつ効率的な再灌流は、ST セグメント患者における心筋梗塞サイズを減らすための最善の戦略は、心筋梗塞を高架です。ただし、さらに心筋細胞死、再灌流障害として知られている現象で発生することができます再灌流自体。ミトコンドリア膜電位の低下 (MMP)、またはミトコンドリア脱分極とミトコンドリア膜透過性遷移孔 (mPTP) の開口部は再灌流障害の最後のステップとして、広く認められてを担当ミトコンドリアと心筋細胞死。JC 1 は MMP の値によってミトコンドリアに蓄積される脂溶性カチオン染料です。MMP が高いより JC 1 はミトコンドリアに蓄積されます。緑からの蛍光発光シフトによるミトコンドリアの JC 1 の増加量を反映できる (~ 530 nm) 赤 (~ 590 nm)。したがって、赤/緑の蛍光強度比の低減は、ミトコンドリアの脱分極を示すことができます。ここでは、我々 は MMP を測定する JC 1 の利点やフローサイトメトリーによる検出に再酸素化低酸素後のヒトの心筋細胞における mPTP の開口部を取る。

MMP の変化を評価する JC 1 アッセイを実行する前に、実験実施研究者によって設定条件を正常に確認するを強くお勧めします。低酸素/再酸素化 (H ・ R) が大幅 HCMs (アネキシン V +/PI±) のアポトーシスを誘導した流れ cytometry 結果 (図 2)、正常群と比較して示すように、私のセル ベースのモデルを確立した我々 を示す/R (45.00 ± 2.13% 対。11.50 正常群?...

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A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

ここでは、JC 1 染料を使用して保護エージェントの有無を低酸素/再酸素化にさらされた後細胞のミトコンドリア膜電位を評価するプロトコルを提案する.

低酸素/再酸素化後心筋細胞におけるミトコンドリア膜電位を測定するためのフロー フローサイトメトリーを用いたアッセイ

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Research

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Medicine

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