Name: imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells at JoVE.com

ونشكر ثوماسين لي جيني ليساعدها في تحرير المخطوطة. وأيده العمل وكالة الاستخبارات الوطنية منح ميتوباثو وباثيمون، ومنح من ميموليفي لابيكس وفقدها أيدكس شيجافورسي. كوني الشمس هي المستفيدة منحة دكتوراه من "مجلس المنح الدراسية الصيني". لوران كومبيتيس، والرجل تران فإن نيو يتلقون تبادل معهد البنك الدولي-فرنسا تورنيسول برنامج N ° 31268YG (والوني بروكسل "الدولي"، Fonds de la "البحث العلمي"، وزارة الفرنسي ديس افير خارجية et الأوروبية، دي وزارة التعليم العالي et de la البحوث dans le كادر قصر كيريان أوبير بارتينارياتس).

1-الأعمال التحضيرية
<ol><li>
إعداد البكتيريا
	<ol>
<li>لوحة البكتيريا-دوسنتاريا السلالة البرية من نوع التعبير عن أدهيسين أف (M90T-أف) – على تريبتيكاسي أجار فول الصويا (TCS) لوحة تحتوي على أحمر الكونغو 0.01 ٪ (CR) واحتضانها لهم ح 18 عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: لزيادة إمكانية تكرار نتائج بهم، لو...

<ol>
	<li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier.">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signaling.">The versatility and universality of calcium signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Strehler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+calcium+ATPases:+from+generic+Ca(2+)+sump+pumps+to+versatile+systems+for+fine-tuning+cellular+Ca(2).">Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).</li><li>Muallem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+Ca2++signals:+a+question+of+timing.">Decoding Ca2+ signals: a question of timing.</a> Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).</li><li>Uhlen, P., Fritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+calcium+oscillations.">Biochemistry of calcium oscillations.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).</li><li>Carneiro, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+induces+mitochondrial+dysfunction+and+cell+death+in+nonmyleoid+cells.">Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).</li><li>Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+mitochondrial+destabilization+in+the+triggering+of+the+NLRP3+inflammasome.">Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome.</a> Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).</li><li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+III+secretion+systems:+specialized+nanomachines+for+protein+delivery+into+target+cells.">Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).</li><li>Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+manipulates+host+immune+responses+by+delivering+effector+proteins+with+specific+roles.">Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles.</a> Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).</li><li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion.">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567 (2013).</li><li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+PtdIns(4,5)P(2)+into+PtdIns(5)P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology.">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li><li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism.">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host &amp; Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li><li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+Ca2++requirement+of+calpain+activation.">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li><li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fluorescent+Ca2++indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2++signals.">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li><li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2++signals+during+invasion+of+epithelial+cells.">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li><li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes,+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus.">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li></ol>

ويصف هذه المخطوطة البروتوكول الذي نحن هندسيا لمتابعة Ca2 + إشارات المحلية خلال حركية قصيرة نسبيا من غزو دوسنتاريا ، فضلا عن Ca2 + الردود العالمية خلال حركية موسعة من دوسنتاريا. أدناه، إشارات يمكن وجدت القضايا التي يلزم التصدي لها لتحسين الكشف عن Ca2 + المفتاح مع التق?...

Ca2 + وينظم جميع عمليات الخلية المعروفة، بما في ذلك إعادة تنظيم سيتوسكيليتال والردود التحريضية ومسارات موت الخلية تتصل بالمضيف الممرض التفاعلات1،،من23. في ظل الظروف الفسيولوجية، القاعدية سيتوسوليك Ca2 + تركيزات متدنية، ومئات من شمال البحر الأبيض المتوسط المدى، ولكن يمكن إخضاعها للزيادات عابرة على تحفيز مؤثر. غالباً ما تظهر هذه الاختلافات السلوك متذبذبة من خلال عمل المضخات وقنوات في أغشية البلازما وهيولي. نمط هذه التذبذبات تتميز بهذه الفترة، والمدة، والسعة من Ca2 + الزيادات، ويتم فك تشفيرها بواسطة الخلايا التي، بدورها، تؤدي إلى استجابات محددة في ما يعرف باسم ال Ca2 + رمز4،5 . زيادة مطردة في Ca2 + تركيز سيتوسوليك في ظل الظروف المرضية قد تؤدي إلى موت الخلايا المرتبطة permeabilization أغشية الميتوكوندريا وإطلاق سراح برو--أبوبتوتيك أو، عوامل نخرية6 7.
دوسنتاريا، المسبّب للزحار العصوي، يغزو الخلايا الظهارية عن طريق حقن المستجيبة في الخلايا المضيفة باستخدام نوع الثالث إفراز نظام (T3SS)8،9. ويرتبط غزو دوسنتاريا بالخلايا المضيفة مع المحلية والعالمية Ca2 + إشارات T3SS. أما بالنسبة لتشكيل المسام السموم، ترانسلوكون T3SS أن يدخل في أغشية الخلايا المضيفة ومطلوب لحقن المستجيبة T3SS من المرجح المسؤولة عن تفعيل المجلس التشريعي الفلسطيني وتريسفوسفاتي inositol (1، 4، 5) (InsP3)--كاليفورنيا تعتمد2 + الإصدار. المزيج من تنشيط المجلس التشريعي المترجمة وتراكم أكتين مبلمرة في مواقع نتيجة غزو دوسنتاريا في يظهر طويلة الأمد تعتمد على InsP3 Ca2 + الإصدار10. المستجيب الثالث نوع إيبجد، بيسفوسفاتي الفوسفاتيديل 4، 5 (PIP2)-4-الفوسفاتيز، يحد من مقدار المحلية PIP2، وبالتالي السيطرة على كمية الركازة المتاحة للمجلس التشريعي الفلسطيني لتوليد InsP3، مما يسهم في حبس Ca المحلية2 + الردود على الغزو الجرثومي مواقع11،12. تسهم هذه Ca2 + الاستجابات المحلية المحتمل بلمرة الأكتين في دوسنتاريا غزو مواقع10. Ca2 + الردود العالمية التي أثارت أيضا دوسنتاريا, ومع ذلك، يمكن الاستغناء عنها لعملية الغزو البكتيري ولكن تؤدي إلى فتح هيميتشاننيلس كونيكسين في غشاء البلازما والإفراج عن ATP في الخلية حجرة. صدر ATP يتصرفون بطريقة paracrine، يحفز بدوره، Ca2 + متذبذبة الردود في الخلايا المجاورة للخلية المصابة. إيبجد أيضا المسؤولة عن تشكيل Ca2 + الردود العالمية إلى عدم انتظام الردود معزولة مع ديناميات بطيئة. في نهاية المطاف، على عدوى بكتيرية مطول، إيبجد يؤدي إلى تثبيط InsP3 بوساطة Ca2 + إشارات. من خلال تدخلها مع Ca2 + إشارات، يؤخر إيبجد Ca2 +-كالباين يعتمد التنشيط مما يؤدي إلى تفكيك هياكل التصاق المحورية والمفرزة سابقا لأوانه لإصابة خلايا13.
في حين تشارك Ca2 + إشارات في الجوانب الحرجة المرضية، استخدام الكائنات الدقيقة يثير عددا من التحديات التقنية التي لم تصادف في الدراسات الكلاسيكية مؤثر. استخدام البروتوكولات المذكورة هنا استخداماً الفلورسنت Ca2 + الكيميائية المؤشر فلوو-4 أن علينا إجراء هندسة عكسية لتوصيف Ca2 + إشارات المحلية أثناء مرض دوسنتاريا . وتناقش الخطوات الحاسمة للكشف عن هذه الإشارات، فضلا عن الإجراءات المنفذة للتحليل الكمي بما هو مطلوب لتوصيف دور المستجيبة البكتيرية في Ca2 + إشارات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="694">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluo-4 AM</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">F14201</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Metamorph version 7.7</td>
			<td style="width:120px;">Universal Imaging</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">CoolLED illumination system pE-2</td>
			<td style="width:120px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">micro-dish 35 mm, high&#160;</td>
			<td style="width:120px;">IBIDI</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Trypticase Soy (TCS) broth</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11768</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">TCS agar</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11043</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Congo red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>75768</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">M90T-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">ipgD-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells

Ca2 + أيون في كل مكان في جميع العمليات الخلوية المعروفة. بينما Ca2 + الردود العالمية قد تؤثر على مصير الخلية، الاختلافات المحلية في الحرة Ca2 + سيتوسوليك التركيزات، مرتبطة بإطلاق سراح من المخازن الداخلية أو تدفق من خلال قنوات غشاء البلازما، وتنظم عمليات الخلية القشرية. مسببات الأمراض التي تلتزم أو غزو الخلايا المضيفة الزناد إعادة تنظيم cytoskeleton أكتين الكامنة وراء غشاء البلازما المضيف، الذي يحتمل يؤثر على العالمية والمحلية على السواء Ca2 + إشارات. نظراً لأن هذه الأحداث قد يحدث في الترددات المنخفضة بطريقة عشوائية الزائفة عبر حركية الموسعة، وتحليل Ca2 + إشارات الناجمة عن مسببات الأمراض يثير التحديات التقنية الرئيسية التي يتعين معالجتها.
هنا، نحن تقرير البروتوكولات للكشف عن العالمية والمحلية Ca2 + إشارات عند مرض دوسنتاريا الخلايا الظهارية. في هذه البروتوكولات، والتحف الفنية المرتبطة بتعرض لفترة طويلة ويتم troubleshot د المرتبطة بالإثارة من Ca2 + نيون المسابير بصرامة مراقبة لبارامترات على مدى فترات زمنية محددة خلال دوسنتاريا الغزو. وتنفذ إجراءات لدقة تحليل السعة والتردد العالمي سيتوسوليك Ca2 + إشارات خلال حركية العدوى الموسعة باستخدام مسبار الكيميائية فلوو-4.

غزو دوسنتاريا يرتبط شاذة طويلة الأمد Ca2 + الاستجابات المحلية:
وبعد البروتوكول المذكور أعلاه، طعن خلايا هيلا فلوو-4-تحميل مع WT دوسنتاريا والمقتنيات تيار أجريت لتحليل Ca2 + إشارات. تجربة ممثل ويرد في الشكل 1...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells at JoVE.com

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

نقدم هنا، البروتوكولات تصور ردود الكالسيوم (Ca2 +) أثارت هيلا الخلايا المصابة دوسنتاريا. عن طريق تحسين معلمات العدوى البكتيرية والتصوير مع Ca2 + نيون تحقيقات، تتميز شاذة العالمية والمحلية Ca2 + إشارات الناجم عن البكتيريا على نطاق كبير من حركية العدوى.

التصوير Ca2 + الردود خلال العدوى دوسنتاريا الخلايا الظهارية

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

الفحص في المختبر من الالتصاق الجرثومي على الخلايا الظهارية الثدييات

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

توصيف الاستجابات الالتهابية خلال الاستعمار داخل الشرج مع الالتهاب الرئوي العقدي

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

استخدام<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية</em&gt; لدراسة التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

تقييم الدالة حويصلة خارج الخلية أثناء الإصابة بالملاريا

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

عزل خلايا ماست المستمدة من الغشاء البريتوني وعلى التوصيف الوظيفي مع Ca2 +-التصوير وفحوصات تحبب

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...