Name: imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells at JoVE.com

Vi takker Jenny-Lee Thomassin for hennes hjelp i redigering manuskriptet. Arbeidet ble støttet av ANR gir MITOPATHO og PATHIMMUN, gir Labex Memolife og PSL IDEX Shigaforce. Chunhui solen er en mottaker av en Ph.D. støtte fra Kina stipend rådet. Laurent Combettes og Guy Tran Van Nhieu er mottakere av en WBI-France utveksling Tournesol programmet N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche dans le kadre des Partenariats Hubert Curien).

1. forberedelser
<ol><li>
Bakterier forberedelse
	<ol>
<li>Plate bakterier-Shigella vill-type belastning uttrykke AfaE adhesin (M90T-AfaE), på en trypticase soya (TCS) agar plate med 0,01% Kongo rød (CR) og ruge dem 18 h på 37 ° C. Merk: For å øke deres reproduserbarhet, Shigella platene fikk i trinn 1.1.1 lagres på 4 ° C og bør brukes innen en uke, fordi alle kolonier på CR medium blir til slutt rødt over tid.</li>
		<li>Vaksinere TCS kjøttkraft pre kultur ved å plukk...

<ol>
	<li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier.">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signaling.">The versatility and universality of calcium signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Strehler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+calcium+ATPases:+from+generic+Ca(2+)+sump+pumps+to+versatile+systems+for+fine-tuning+cellular+Ca(2).">Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).</li><li>Muallem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+Ca2++signals:+a+question+of+timing.">Decoding Ca2+ signals: a question of timing.</a> Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).</li><li>Uhlen, P., Fritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+calcium+oscillations.">Biochemistry of calcium oscillations.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).</li><li>Carneiro, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+induces+mitochondrial+dysfunction+and+cell+death+in+nonmyleoid+cells.">Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).</li><li>Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+mitochondrial+destabilization+in+the+triggering+of+the+NLRP3+inflammasome.">Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome.</a> Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).</li><li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+III+secretion+systems:+specialized+nanomachines+for+protein+delivery+into+target+cells.">Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).</li><li>Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+manipulates+host+immune+responses+by+delivering+effector+proteins+with+specific+roles.">Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles.</a> Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).</li><li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion.">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567 (2013).</li><li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+PtdIns(4,5)P(2)+into+PtdIns(5)P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology.">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li><li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism.">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host &amp; Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li><li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+Ca2++requirement+of+calpain+activation.">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li><li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fluorescent+Ca2++indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2++signals.">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li><li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2++signals+during+invasion+of+epithelial+cells.">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li><li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes,+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus.">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li></ol>

Dette manuskriptet beskriver protokollen som vi utviklet for å følge lokale Ca2 + signaler i løpet av relativt kort kinetics av en Shigella invasjon, samt global Ca2 + svar under den utvidede kinetics av Shigella. Under nøkkel finner problemer som må håndteres for å optimalisere påvisning av Ca2 + signaler samtidig minimere interferens med biologiske prosesser.
Kjemisk vs kodet genetisk Ca2 + sonder:
<p class="jove...

Ca2 + regulerer alle kjente celleprosesser, inkludert cellen cytoskjelett omorganisering, inflammatorisk svar og celle død veiene gjelder host-patogen interaksjoner1,2,3. Under fysiologiske forhold, basale cytosolic Ca2 + konsentrasjoner er lav, i hundrevis av nM utvalg, men kan utsettes for forbigående øker på Agonistiske stimulering. Disse variantene viser ofte oscillasjon atferd gjennom handling av pumper og kanaler på plasma og endoplasmatiske retikulum membraner. Mønsteret av disse svingninger er preget av perioden, varighet og amplituden av Ca2 + øker, og dekrypteres av celler som utløser bestemte reaksjoner i det som kalles Ca2 + koden4,5-igjen . En vedvarende konsentrasjonsøkning cytosolic Ca2 + under patologiske forhold kan føre til celledød knyttet til permeabilization av mitokondrie membraner og utgivelsen av pro-apoptotisk eller nekrose faktorer6, 7.
Shigella, den utløsende agenten av basillær dysenteri, invaderer epitelceller ved å injisere effektor inn vertsceller ved hjelp av en type III sekresjon system (T3SS)8,9. En Shigella invasjon av verten cellene er forbundet med lokale og globale Ca2 + signaler brakt frem av T3SS. Som for pore-forming miljøgifter, den T3SS translocon som setter inn i verten celle membraner og kreves for injeksjon av T3SS effektor trolig ansvarlig for aktivering av PLC og inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-avhengige Ca2 + utgivelsen. Kombinasjonen av lokaliserte PLC stimulering og akkumulering av polymerized utgangen på steder av et Shigella invasjonen resultat i en unormalt langvarig InsP3 avhengig av Ca2 + løslate10. Type III effektor IpgD, en phosphatidyl 4,5 bisphosphate (PIP2) -4-fosfatase, begrenser lokale mengden av PIP2, og dermed kontrollere antallet tilgjengelige substrat for PLC å generere InsP3, som bidrar til confinement av lokale Ca2 + svar på bakteriell invasjonen nettsteder11,12. Disse lokale Ca2 + svar sannsynligvis bidra til utgangen polymerisasjon Shigella invasjonen nettsteder10. Globale Ca2 + svar som er også skapt av Shigella, men er unnværlig for bakteriell invasjonen prosessen men utløse åpning av connexin hemichannels i plasma membranen og utgivelsen av ATP i den ekstracellulære rommet. Frigitte ATP i en paracrine måte, stimulerer igjen Ca2 + oscillasjon svar i celler ved siden av de infiserte cellen. IpgD er også ansvarlig for å utarbeide globale Ca2 + svar til uberegnelig isolert svar med langsom dynamikk. Til slutt, på en langvarig bakteriell infeksjon fører IpgD til hemming av InsP3-mediert Ca2 + signaler. Gjennom sin innblanding Ca2 + signalering, IpgD forsinker en Ca2 +-avhengige calpain aktivisering fører til demontering av fokal vedheft strukturer og tidlig brøkdel av infiserte celler13.
Mens Ca2 + signaler er involvert i viktige aspekter av patogenesen, reiser bruk av en microorganism en rekke tekniske utfordringer som ikke er oppstått i klassisk Agonistiske studier. Protokollene beskrevet bruker her brukte lysstoffrør Ca2 + kjemisk indikatoren Fluo-4 som vi utviklet betegner lokale Ca2 + signaler under en Shigella infeksjon. Trinn kritisk for påvisning av disse signalene er diskutert, samt prosedyrer implementert for deres kvantitativ analyse som kreves for å karakterisere rollen bakteriell effektor i Ca2 + signalering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="694">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluo-4 AM</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">F14201</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Metamorph version 7.7</td>
			<td style="width:120px;">Universal Imaging</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">CoolLED illumination system pE-2</td>
			<td style="width:120px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">micro-dish 35 mm, high&#160;</td>
			<td style="width:120px;">IBIDI</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Trypticase Soy (TCS) broth</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11768</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">TCS agar</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11043</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Congo red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>75768</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">M90T-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">ipgD-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells

Ca2 + er en allestedsnærværende ion involvert i alle kjente cellulære prosesser. Mens global Ca2 + svar kan påvirke celle skjebne, regulere lokale variasjoner i gratis Ca2 + cytosolic konsentrasjoner knyttet til å løsne fra interne butikker eller en strøm gjennom plasma membranen kanaler, kortikale celleprosesser. Patogener som overholder eller invadere verten cellene utløser en omorganisering av utgangen cytoskeleton underliggende vert plasma membran, som trolig påvirker både globale og lokale Ca2 + signalering. Fordi disse hendelsene kan oppstå på lave frekvenser i en pseudo Stokastisk måte over utvidede kinetikk, reiser analyse av Ca2 + signaler av patogener store tekniske utfordringer som må håndteres.
Her rapporterer vi protokoller for påvisning av globale og lokale Ca2 + signaler på en Shigella infeksjon i epitelceller. Disse protokollene gjenstander knyttet til en langvarig eksponering og photodamage knyttet til magnetisering av Ca2 + fluorescerende sonder er utført feilsøking ved å strengt kontrollere parameterne oppkjøpet over definerte tidsrom under en Shigella invasjon. Prosedyrer er implementert nøye analysere amplituden og hyppigheten av globale cytosolic Ca2 + signaler under utvidet infeksjon kinetics ved hjelp av kjemiske sonden Fluo-4.

Shigella invasjonen er tilknyttet atypisk langvarig lokale Ca2 + svar:
Fluo-4-loaded HeLa celler ble utfordret med WT Shigella protokollen ovenfor, og strømmen oppkjøp ble utført for å analysere Ca2 + signaler. En representant eksperiment er vist i figur 1, med time-lapse bilder rekke fluorescens intensiteten av Fluo-4 sonden gjennomsnitt i en region av inter...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells at JoVE.com

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Her presenterer vi for å visualisere kalsium (Ca2 +) svar brakt frem av HeLa celler av Shigella. Optimalisere parametrene av bakteriell infeksjon og tenkelig med Ca2 + fluorescerende sonder, kjennetegnes atypisk globale og lokale Ca2 + signaler forårsaket av bakterier over et stort utvalg av infeksjon kinetics.

Imaging Ca2 + svar under Shigella infeksjon av epitelceller

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Anvendelse av en Mouse Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay å evaluere Bakteriell Opptak av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrisk Isolering av Primary Murine Type II alveolære epitelceller for Funksjonell og molekylær studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Karakterisering av inflammatoriske responser under intranasal kolonisering med streptokokker lungebetennelse

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloid dendrittiske celler og Epitelceller fra Menneskelig Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Ved å bruke<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Å studere autofagi-Cytoskjelettet Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolasjon av Salmonella typhimurium-som inneholder Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Evaluering av ekstracellulære Vesicle funksjonen under Malaria smitte

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolering av Peritoneum-avledet mastceller og deres funksjonell karakteristikk med Ca2 +-imaging og omfatter degranulering analyser

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høy gjennomstrømming plattform for Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...