Name: imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells at JoVE.com

Jenny Lee Thomassin Agradecemos a ajuda em editar o manuscrito. O trabalho foi apoiado pela ANR concede MITOPATHO e PATHIMMUN, concede do Labex Memolife e PSL IDEX Shigaforce. Cristina Sun é um destinatário de uma bolsa de doutorado do Conselho da bolsa de China. Laurent Combettes e Guy Tran Van Nhieu são destinatários de uma troca de WBI-França Tournesol programa N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l'Enseignement supérieur et des de cadre de la Recherche dans le parcerias Hubert Curien).

1. preparações
<ol><li>
Preparação de bactérias
	<ol>
<li>As bactérias da placa — estirpe do selvagem-tipoShigella expressando a adesina umFAE (M90T-umFAE) — para um trypticase agar soja (TCS) placa contendo 0,01% de vermelho de Congo (CR) e incube-os por 18 h a 37 ° C. Nota: Para aumentar a sua reprodutibilidade, as placas de Shigella obtidas na etapa 1.1.1 são armazenadas a 4 ° C e devem ser usadas dentro de uma semana, porque todas as colônias em meio de CR eventua...

<ol>
	<li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier.">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signaling.">The versatility and universality of calcium signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Strehler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+calcium+ATPases:+from+generic+Ca(2+)+sump+pumps+to+versatile+systems+for+fine-tuning+cellular+Ca(2).">Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).</li><li>Muallem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+Ca2++signals:+a+question+of+timing.">Decoding Ca2+ signals: a question of timing.</a> Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).</li><li>Uhlen, P., Fritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+calcium+oscillations.">Biochemistry of calcium oscillations.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).</li><li>Carneiro, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+induces+mitochondrial+dysfunction+and+cell+death+in+nonmyleoid+cells.">Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).</li><li>Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+mitochondrial+destabilization+in+the+triggering+of+the+NLRP3+inflammasome.">Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome.</a> Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).</li><li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+III+secretion+systems:+specialized+nanomachines+for+protein+delivery+into+target+cells.">Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).</li><li>Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+manipulates+host+immune+responses+by+delivering+effector+proteins+with+specific+roles.">Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles.</a> Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).</li><li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion.">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567 (2013).</li><li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+PtdIns(4,5)P(2)+into+PtdIns(5)P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology.">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li><li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism.">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host &amp; Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li><li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+Ca2++requirement+of+calpain+activation.">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li><li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fluorescent+Ca2++indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2++signals.">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li><li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2++signals+during+invasion+of+epithelial+cells.">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li><li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes,+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus.">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li></ol>

Este manuscrito descreve o protocolo que estamos projetados para seguir Ca2 + sinais locais durante a cinética relativamente curta de uma invasão de Shigella , bem como Ca2 + respostas globais durante a cinética estendida de Shigella. Abaixo, a chave encontram problemas que precisam ser abordadas para otimizar a detecção de Ca2 + sinais minimizando qualquer interferência com os processos biológicos.
Química vs geneticamente codif...

CA2 + regula todos os processos de célula conhecida, incluindo a reorganização do citoesqueleto, respostas inflamatórias e caminhos de morte celular relacionados ao hospedeiro-patógeno interações1,2,3. Sob condições fisiológicas, basal citosólico Ca2 + as concentrações são baixas, em centenas de gama nM, mas podem ser submetidas a aumentos transitórios mediante estimulação agonista. Estas variações frequentemente apresentam comportamento oscilatório através da ação das bombas e canais em membranas do plasma e retículo endoplasmático. O padrão dessas oscilações é caracterizado pelo período, duração e amplitude de Ca2 + aumenta e é descriptografado por células que, por sua vez, provocam respostas específicas no que é conhecido como o Ca2 + código4,5 . Um aumento sustentado da citosólico Ca2 + concentração sob condições patológicas pode levar à morte celular associada a permeabilização de membranas mitocondriais e o lançamento do pro-apoptotic ou fatores necróticos6, 7.
Shigella, o agente causador da disenteria bacilar, invade células epiteliais injetando efetores em células hospedeiras, usando um tipo III secreção sistema (T3SS)8,9. Uma invasão de Shigella das células do hospedeiro é associada com o locais e globais Ca2 + sinais eliciados a T3SS. Quanto à formação de poros toxinas, o translocon T3SS que insere as membranas de pilha de anfitrião e é necessária para a injeção de efetores T3SS é provavelmente responsável para a ativação do PLC e do triphosphate do inositol (1, 4, 5) (InsP3)-dependente Ca2 + lançamento. A combinação de estimulação localizada PLC e o acúmulo de actina polimerizada em sites de um resultado de invasão de Shigella em uma Ca InsP3 dependente atipicamente longa duração2 + versão10. O efetor do III tipo IpgD, um bisfosfato fosfatidil 4,5 (PIP2) -4-fosfatase, limita a quantidade de local de PIP2, assim, controlar a quantidade de substrato disponível para PLC gerar InsP3, que contribui para o confinamento do local Ca2 + respostas em sites de invasão bacteriana11,12. Estes locais Ca 2 + respostas provavelmente contribuem para a polimerização de actina no Shigella invasão sites10. Global Ca2 + respostas que são também provocadas pela Shigella, no entanto, são dispensáveis para o processo de invasão bacteriana, mas provocar a abertura de hemichannels connexin na membrana plasmática e a liberação de ATP no extracelular compartimento. Lançado ATP agindo de forma parácrina, por sua vez, estimula aCa 2 + oscilatórias respostas nas células ao lado da célula infectada. IpgD também é responsável pela formaçãoglobais Ca 2 + respostas em erráticas respostas isoladas com dinâmica lenta. Eventualmente, após uma prolongada infecção bacteriana, IpgD leva para a inibição de InsP3 mediada por Ca2 + sinais. Através de sua interferência com sinalização de Ca2 + , IpgD atrasa um Ca2 +-ativação Calpaína dependente, levando para a desmontagem de estruturas de adesão focal e o descolamento prematuro da infectado as células13.
Enquanto Ca2 + sinais estão envolvidos em aspectos críticos da patogênese, a utilização de um microrganismo gera um número de desafios técnicos que não são encontrados em estudos clássicos agonista. Os protocolos descritos aqui usam o comumente usado fluorescente Ca2 + indicador químico impresso Fluo-4 que nós produzimos para caracterizar o local de Ca2 + sinais durante uma infecção de Shigella . Passos essenciais para a detecção destes sinais são discutidos, bem como procedimentos implementados para sua análise quantitativa que é necessário para caracterizar o papel de efetores bacterianas em sinalização de Ca2 + .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="694">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluo-4 AM</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">F14201</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Metamorph version 7.7</td>
			<td style="width:120px;">Universal Imaging</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">CoolLED illumination system pE-2</td>
			<td style="width:120px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">micro-dish 35 mm, high&#160;</td>
			<td style="width:120px;">IBIDI</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Trypticase Soy (TCS) broth</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11768</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">TCS agar</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11043</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Congo red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>75768</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">M90T-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">ipgD-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells

CA2 + é um íon ubíquo envolvido em todos os processos celulares conhecidos. Enquantoglobais Ca 2 + respostas podem mudar o destino de célula, variações locais grátis Ca2 + citosólico concentrações, ligada à liberação de lojas internas ou um influxo através dos canais da membrana plasmática, regulam processos de célula cortical. Patógenos que aderir ou invadir o hospedeiro células gatilho uma reorganização do citoesqueleto de actina subjacentes a membrana plasmática de anfitrião, que provavelmente afeta Ca2 + sinalização globais e locais. Porque esses eventos podem ocorrer em baixas frequências de forma pseudo estocástica sobre cinética estendida, a análise de Ca2 + sinais induzidos por patógenos gera grandes desafios técnicos que devem ser abordadas.
Aqui, nós relatamos protocolos para a detecção de Ca2 + sinais globais e locais em cima de uma infecção de Shigella de células epiteliais. Estes protocolos, artefatos ligados a uma exposição prolongada e Fotodano associado com a excitação de sondas fluorescentes de Ca2 + são solucionados problemas ao controlar rigorosamente os parâmetros de aquisição durante períodos de tempo definidos durante um Shigella invasão. Os procedimentos são implementados para analisar com rigor a amplitude e frequência da global citosólico Ca2 + sinais durante a cinética de infecção prolongada usando a sonda química Fluo-4.

Invasão de Shigella está associado atípica duradouro Ca2 + respostas locais:
Seguindo o protocolo mencionado acima, as células HeLa Fluo-4-carregado foram desafiadas com WT Shigella e aquisições de fluxo foram realizadas para analisar sinais de Ca2 + . Um experimento de representante é mostrado na Figura 1, com uma série de imagens de lapso de tempo da in...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells at JoVE.com

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Aqui, apresentamos os protocolos para visualizar respostas de cálcio (Ca2 +) eliciadas células HeLa infectadas por Shigella. Otimizando os parâmetros de infecção bacteriana e imagem latente com sondas fluorescentes de Ca2 + , caracterizam-se atípica globais e locais Ca2 + sinais induzidos por bactérias sobre uma escala grande da cinética da infecção.

Imagem de Ca2 + respostas durante Shigella infecção das células epiteliais

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

Ensaio in vitro da adesão bacteriana em mamíferos Células Epiteliais

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Imunologia e Infecção

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Aplicação de um rato ligado patch Peyer Assay alça intestinal para avaliar absorção pelas células bacterianas M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Avaliação da função de vesículas extracelulares durante a infecção da malária

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolamento do peritônio-derivado de mastócitos e sua caracterização funcional com Ca2 +-imagens e ensaios de degranulação

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...