Name: imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00
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Agradecemos a Jenny Lee Thomassin por su ayuda en editar el manuscrito. El trabajo fue financiado por la ANR otorga MITOPATHO y PATHIMMUN, subvenciones de la Labex Memolife y PSL IDEX Shigaforce. Chunhui sol es un recipiente de una beca de doctorado del Consejo de becas de China. Laurent Combettes y Guy Tran Van Nhieu reciben de un intercambio de WBI-Francia Tournesol programa N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministerio de l ' enseignement supérieur et des de la Recherche dans le cadre dificultaría Hubert Curien).

1. preparaciones
<ol><li>
Preparación de bacterias
	<ol>
<li>Las bacterias de la placa: cepa de tipo salvaje deShigella expresando la adhesina de AfaE (M90T-AfaE) — en un tripticasa agar de soja (TCS) placa que contiene 0.01% Congo rojo (CR) e incubar de 18 h a 37 ° C. Nota: Para aumentar su reproducibilidad, las placas de Shigella obtenidas en el paso 1.1.1 se almacenan a 4 ° C y deben ser usadas dentro de una semana, porque todas las colonias en medio de CR se pondrá rojas ...

<ol>
	<li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier.">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signaling.">The versatility and universality of calcium signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Strehler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+calcium+ATPases:+from+generic+Ca(2+)+sump+pumps+to+versatile+systems+for+fine-tuning+cellular+Ca(2).">Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).</li><li>Muallem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+Ca2++signals:+a+question+of+timing.">Decoding Ca2+ signals: a question of timing.</a> Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).</li><li>Uhlen, P., Fritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+calcium+oscillations.">Biochemistry of calcium oscillations.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).</li><li>Carneiro, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+induces+mitochondrial+dysfunction+and+cell+death+in+nonmyleoid+cells.">Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).</li><li>Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+mitochondrial+destabilization+in+the+triggering+of+the+NLRP3+inflammasome.">Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome.</a> Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).</li><li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+III+secretion+systems:+specialized+nanomachines+for+protein+delivery+into+target+cells.">Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).</li><li>Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+manipulates+host+immune+responses+by+delivering+effector+proteins+with+specific+roles.">Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles.</a> Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).</li><li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion.">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567 (2013).</li><li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+PtdIns(4,5)P(2)+into+PtdIns(5)P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology.">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li><li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism.">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host &amp; Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li><li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+Ca2++requirement+of+calpain+activation.">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li><li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fluorescent+Ca2++indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2++signals.">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li><li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2++signals+during+invasion+of+epithelial+cells.">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li><li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes,+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus.">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li></ol>

Este manuscrito describe el protocolo que hemos diseñados para seguir Ca2 + señales locales durante las cinéticas relativamente corto de una invasión de Shigella , así como Ca2 + respuestas globales durante la cinética extendida de Shigella. A continuación, clave se encuentran cuestiones que deben abordarse para optimizar la detección de Ca2 + señales y reducir al mínimo cualquier interferencia con los procesos biológicos.
Química <em...

CA2 + regula todos los procesos de células conocidas, incluyendo la reorganización del citoesqueleto, las respuestas inflamatorias y vías de muerte celular relacionadas con las interacciones huésped-patógeno1,2,3. En condiciones fisiológicas, basal Ca2 + las concentraciones citosólicas son bajas, en los cientos de rango nM, pero pueden ser sometidas a aumentos transitorios sobre el estímulo del agonista. Estas variaciones demuestran a menudo comportamiento oscilatorio a través de la acción de las bombas y canales en las membranas del retículo endoplásmico y plasma. El patrón de estas oscilaciones se caracteriza por el período de duración y amplitud de Ca2 + aumenta y es desencriptado por las células que, a su vez, desencadenan respuestas específicas en lo que se conoce como el Ca2 + código4,5 . Un aumento sostenido en la citosólica Ca2 + concentración en condiciones patológicas puede conducir a la muerte celular asociada a la permeabilización de las membranas mitocondriales y la liberación de pro-apoptóticos o necróticos factores6, 7.
Shigella, el agente causal de la disentería bacilar, invade las células epiteliales mediante la inyección de efectores en las células del huésped utilizando un tipo III secreción sistema (T3SS)8,9. Una invasión de Shigella de las células huésped se asocia a locales y globales Ca2 + señales sacadas por el T3SS. En cuanto a la formación de poro las toxinas, el translocon T3SS que inserta en las membranas de la célula huésped y es necesario para la inyección de T3SS efectores es probable responsable de la activación de PLC y el trifosfato de inositol (1, 4, 5) (InsP3)-dependiente de Ca2 + lanzamiento. La combinación de la estimulación localizada del PLC y la acumulación de actina polimerizada en los sitios de un resultado de la invasión de Shigella en una anormalmente larga duración InsP3 dependiente de Ca2 + liberación10. Tipo III generador de efectos IpgD, una fosfatidil 4,5 bifosfato (PIP2) -4-fosfatasa, limita la cantidad local de PIP2, controlando así la cantidad de sustrato disponible para el PLC generar InsP3, que contribuye a la reclusión de local Ca2 + respuestas en los sitios de invasión bacteriana11,12. Estos Ca2 + respuestas locales probablemente contribuyen a la polimerización de la actina en la invasión de Shigella sitios10. Ca2 + respuestas globales que también son sacadas por Shigella, sin embargo, son prescindibles para el proceso de invasión bacteriana sino desencadenar la apertura de connexin hemichannels en la membrana plasmática y la liberación de ATP en el medio extracelular compartimiento. Lanzado ATP actúan de manera paracrina, a su vez, estimula la Ca2 + oscilatorias respuestas en las células al lado de la célula infectada. También es responsable de formar global Ca2 + respuestas erráticas respuestas aisladas con dinámica lenta IpgD. Finalmente, a una infección bacteriana prolongada, IpgD lleva a la inhibición de señales de InsP3 mediada por Ca2 + . A través de su interferencia con la Ca2 + señalización IpgD retrasa un Ca2 +-activación de calpaínas dependiente hacia el desmontaje de estructuras de adhesión focal y la separación prematura de infectado las células13.
Mientras que el Ca2 + señales están implicadas en aspectos críticos de la patogénesis, el uso de un microorganismo plantea una serie de desafíos técnicos que no se encuentran en estudios clásicos agonista. Los protocolos descritos aquí usan el utilizados fluorescente Ca2 + químico indicador Fluo-4 que hemos diseñados para caracterizar señales de Ca2 + locales durante una infección por Shigella . Pasos críticos para la detección de estas señales se discuten, así como procedimientos para su análisis cuantitativo que es necesaria para caracterizar el papel de efectores bacterianas en la señalización de Ca2 + .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="694">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluo-4 AM</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">F14201</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Metamorph version 7.7</td>
			<td style="width:120px;">Universal Imaging</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">CoolLED illumination system pE-2</td>
			<td style="width:120px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">micro-dish 35 mm, high&#160;</td>
			<td style="width:120px;">IBIDI</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Trypticase Soy (TCS) broth</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11768</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">TCS agar</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11043</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Congo red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>75768</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">M90T-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">ipgD-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells

CA2 + es un ion omnipresente en todos los procesos celulares conocidos. Aunque global Ca2 + respuestas pueden afectar el destino de la célula, variaciones locales en libre Ca2 + citosólicas concentraciones, ligadas a la liberación de tiendas interiores o un flujo a través de canales de la membrana plasmática, regulan procesos celulares corticales. Patógenos se adhieren a o invadir el huésped células gatillo una reorganización del citoesqueleto de actina subyacente a la membrana plasmática de host, que probablemente afecta a nivel global y local de Ca2 + señalización. Porque estos eventos pueden ocurrir en frecuencias bajas de manera pseudo-estocástica sobre cinética extendida, el análisis de Ca2 + señales inducidas por patógenos plantea importantes desafíos técnicos que deben abordarse.
Aquí, Divulgamos los protocolos para la detección de Ca2 + señales globales y locales en una Shigella infección de células epiteliales. En estos protocolos, artefactos vinculados a una exposición prolongada y fotoenvejecimiento asociado con la excitación de Ca2 + fluorescentes puntas de prueba se removio controlando estrictamente los parámetros de adquisición durante períodos de tiempo definidos durante un Shigella invasión. Procedimientos se implementan para analizar rigurosamente la amplitud y la frecuencia de Ca2 + señales citosólicas globales durante la cinética de la infección extendida usando la sonda química Fluo-4.

Invasión de Shigella se asocia con anormal duradero Ca2 + respuestas locales:
Siguiendo el protocolo mencionado anteriormente, las células HeLa Fluo-4-cargado se desafiaron con WT Shigella y se realizaron adquisiciones de secuencia para analizar señales de Ca2 + . En figura 1, se muestra un experimento representativo con serie de Time-lapse de imágenes de la ...

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Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Aquí, presentamos protocolos para visualizar las respuestas de calcio (Ca2 +) provocadas por las células HeLa infectadas por Shigella. Optimización de los parámetros de infección bacteriana y la proyección de imagen con sondas fluorescentes de Ca2 + , se caracterizan atípicos globales y locales Ca2 + señales inducidas por bacterias sobre una amplia gama de cinética de la infección.

Imágenes de Ca2 + respuestas durante la infección de Shigella de células epiteliales

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

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Investigación

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