Name: imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells at JoVE.com

Vi tackar Jenny-Lee Thomassin för hennes hjälp i redigering manuskriptet. Arbetet stöddes av ANR beviljar MITOPATHO och PATHIMMUN, bidrag från Labex Memolife och PSL IDEX Shigaforce. Chunhui Sun är en mottagare av en Ph.D. bidrag från Kina stipendium rådet. Laurent Combettes och Guy Tran Van Nhieu är mottagare av en WBI-Frankrike exchange Tournesol programmet N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche dans le cadre des partnerskapen Hubert Curien).

1. förberedelser
<ol><li>
Bakterier förberedelse
	<ol>
<li>Tavla bakterier —Shigella vildtyp stam att uttrycka den AfaE adhesin (M90T-AfaE) — på en trypticase soy (TCS) agar tallrik innehållande 0,01% kongorött (SP) och inkubera dem i 18 timmar vid 37 ° C. Obs: För att öka deras reproducerbarhet, Shigella plattorna erhölls i steg 1.1.1 lagras vid 4 ° C och bör användas inom en vecka, eftersom alla kolonier på CR medium blir så småningom röd över tid.</li>
		<li...

<ol>
	<li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier.">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signaling.">The versatility and universality of calcium signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Strehler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+calcium+ATPases:+from+generic+Ca(2+)+sump+pumps+to+versatile+systems+for+fine-tuning+cellular+Ca(2).">Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).</li><li>Muallem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+Ca2++signals:+a+question+of+timing.">Decoding Ca2+ signals: a question of timing.</a> Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).</li><li>Uhlen, P., Fritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+calcium+oscillations.">Biochemistry of calcium oscillations.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).</li><li>Carneiro, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+induces+mitochondrial+dysfunction+and+cell+death+in+nonmyleoid+cells.">Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).</li><li>Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+mitochondrial+destabilization+in+the+triggering+of+the+NLRP3+inflammasome.">Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome.</a> Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).</li><li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+III+secretion+systems:+specialized+nanomachines+for+protein+delivery+into+target+cells.">Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).</li><li>Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+manipulates+host+immune+responses+by+delivering+effector+proteins+with+specific+roles.">Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles.</a> Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).</li><li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion.">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567 (2013).</li><li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+PtdIns(4,5)P(2)+into+PtdIns(5)P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology.">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li><li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism.">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host &amp; Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li><li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+Ca2++requirement+of+calpain+activation.">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li><li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fluorescent+Ca2++indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2++signals.">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li><li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2++signals+during+invasion+of+epithelial+cells.">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li><li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes,+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus.">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li></ol>

Detta manuskript beskriver de protokoll som vi konstruerade för att följa lokala Ca2 + signaler under relativt kort kineticsen av en Shigella invasion, liksom globala Ca2 + svar under utökade kineticsen av Shigella. Nedan, nyckel finns problem som behöver åtgärdas för att optimera upptäckt av Ca2 + signaler samtidigt minimera eventuella störningar med de biologiska processerna.
Kemiska vs. kodade genetiskt Ca2 + sonde...

Ca2 + reglerar alla kända cellprocesser, inklusive cytoskeletal omorganisation, inflammatoriskt svar och cell death vägar besläktade med värd-patogen interaktioner1,2,3. Under fysiologiska betingelser, basal cytosoliska Ca2 + koncentrationerna är låga, i hundratals nM räckvidd, men kan bli föremål för övergående ökningar vid agonist stimulering. Dessa variationer visar ofta oscillerande beteende genom åtgärder av pumpar och kanaler på plasma och endoplasmatiska retiklet membran. Mönstret av dessa svängningar kännetecknas av tid, varaktighet och amplituden av Ca2 + ökar och dekrypteras av celler, som i sin tur utlöser specifika reaktioner i vad som kallas den Ca2 + kod4,5 . En ihållande ökning av cytosoliska Ca2 + koncentrationen under sjukdomstillstånd kan leda till celldöd som är associerad med permeabiliseringen av mitokondriell membran och frisläppandet av pro-apoptotiska eller nekrotiska faktorer6, 7.
Shigella, vilka smittämnen av bacillär dysenteri, invaderar epitelcellerna genom att injicera effektorer i värdceller använder en typ III sekretion system (T3SS)8,9. En Shigella invasion av värdceller associeras med lokala och globala Ca2 + signaler som framkallas av T3SS. När det gäller pore-bilda toxiner, den T3SS translocon som infogas i värd cellmembran och krävs för injektion av T3SS effektorer är troligen ansvarig för aktivering av PLC och inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-beroende Ca2 + släpp. Kombinationen av den lokaliserade PLC-stimuleringen och ackumulation av polymeriserat aktin på platser Shigella invasion resultat i ett onormalt långvariga InsP3-beroende Ca2 + släpp10. Den typ III effektor IpgD, en fosfatidyl 4,5 bisphosphate (PIP2) -4-fosfatas, begränsar det lokala PIP2, därmed styra mängden tillgängligt substrat för PLC att generera InsP3, vilket bidrar till förlossningen av lokala Ca2 + Svaren på bakteriell invasion platser11,12. Dessa lokala Ca2 + svar sannolikt bidra till aktin polymerisation Shigella invasion platser10. Globala Ca2 + svar som är också framkallas av Shigella, dock är överflödiga för bakteriell invasion processen men utlösa öppnandet av connexin hemichannels på plasmamembranet och lanseringen av ATP i den extracellulära fack. Släppta ATP agerar på ett sätt som parakrin, stimulerar i sin tur Ca2 + oscillerande svaren i cellerna bredvid den infektera cellen. IpgD ansvarar också för att forma globala Ca2 + svar till oberäkneligt isolerade svaren med långsam dynamik. Så småningom, efter en långvarig bakteriell infektion leder IpgD till hämning av InsP3-medierad Ca2 + signaler. Genom dess inblandning med Ca2 + signalering, IpgD försenar en Ca2 +-beroende calpain aktivering leder till demonteringen av fokal vidhäftning strukturer och den för tidig avlossning av infekterade celler13.
Medan Ca2 + signaler är inblandade i kritiska aspekter av patogenes, väcker användning av en mikroorganism en rad tekniska utmaningar som inte uppstår i klassiskt agonist studier. De protokoll som beskrivs använder här vanliga lysrör Ca2 + kemiska indikatorn Fluo-4 som vi konstruerade för att karakterisera lokala Ca2 + signaler under en Shigella infektion. Steg som är kritiska för att upptäcka dessa signaler diskuteras, liksom förfaranden som genomförts för deras kvantitativ analys som krävs för att karaktärisera rollen av bakteriell effektorer i Ca2 + signalering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="694">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fluo-4 AM</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">F14201</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Metamorph version 7.7</td>
			<td style="width:120px;">Universal Imaging</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">CoolLED illumination system pE-2</td>
			<td style="width:120px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">micro-dish 35 mm, high&#160;</td>
			<td style="width:120px;">IBIDI</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Trypticase Soy (TCS) broth</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11768</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">TCS agar</td>
			<td style="width:120px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>B11043</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Congo red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>75768</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">M90T-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">ipgD-AfaE</td>
			<td style="width:120px;">Sun et al. 2017</td>
			<td style="width:136px;">isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells

Ca2 + är en allestädes närvarande ion som är inblandade i alla kända cellulära processer. Medan globala Ca2 + svar kan påverka cell öde, reglera lokala variationer i gratis Ca2 + cytosoliska koncentrationer, kopplade för att släppa från interna butiker eller ett inflöde genom plasmamembranet kanaler, kortikal cellprocesser. Patogener som följer eller invadera värd celler utlösa en omorganisation av aktin cytoskelettet underliggande värd plasmamembranet, vilket sannolikt påverkar både globala och lokala Ca2 + signalering. Eftersom dessa händelser kan inträffa vid låga frekvenser i en pseudo stokastiska sätt över utökade kinetik, väcker analys av Ca2 + signaler induceras av patogener stora tekniska utmaningar som måste lösas.
Här rapporterar vi protokoll för detektion av globala och lokala Ca2 + signaler vid en Shigella infektion av epitelceller. I protokollen, artefakter kopplade till en långvarig exponering och åldrad hud är associerad med excitation av Ca2 + fluorescerande sonder är Felsökte genom att strikt Kontrollera parametrarna förvärv över definierade tidsperioder under en Shigella invasionen. Förfaranden genomförs för att noggrant analysera den amplitud och frekvens av globala cytosoliska Ca2 + signaler under förlängd infektion kinetik använder kemiska sonden Fluo-4.

Shigella invasion är associerade med atypiska långvariga lokala Ca2 + svaren:
Efter de protokoll som nämns ovan, Fluo-4-loaded HeLa cells utmanades med WT Shigella och stream förvärv utfördes för att analysera Ca2 + signaler. Ett representativt experiment visas i figur 1, med time-lapse bilder serie fluorescensintensiteten hos Fluo-4 sonden i genomsnitt i ...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells at JoVE.com

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Här presenterar vi protokoll för att visualisera kalcium (Ca2 +) Svaren framkallas av HeLa celler infekterade av Shigella. Genom att optimera parametrarna för bakteriell infektion och imaging med Ca2 + fluorescerande sonder, kännetecknasatypiska globala och lokala Ca 2 + signaler induceras av bakterier över ett stort spektrum av infektion kinetik.

Imaging Ca2 + Svaren under Shigella infektion av epitelceller

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In vitro-analys av bakteriell vidhäftning på däggdjur epitelceller

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Tillämpning av en mus knyts ihop Peyer s Patch Intestinal Loop-analys för att utvärdera Bakteriell Upptag av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flödescytometrisk Isolering av primära murin typ II alveolära epitelceller för Funktionella och molekylära studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Karakterisering av inflammatoriska svar under intranasal kolonisering med Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloida dendritiska celler och epitelceller från Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Användning av<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Att studera autophagy-Cytoskeleton interaktioner

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering av Salmonella typhimurium-innehållande Phagosomes från makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Utvärdering av extracellulära vesikler funktion under malariainfektion

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolering av Peritoneum-derived mastceller och deras funktionella karakterisering med Ca2 +-imaging och degranulering analyser

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En hög genomströmning plattform för Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...