Name: retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

الأبحاث بتمويل من مؤسسة Lundbeck، الدانمرك.

البروتوكول هو الأمثل، وبرهنت على الفئران ألبينو الذكور البالغين. في جميع إجراءات تجريبية، يعاملون الحيوانات وفقا للوائح في "بيان آرفو" "استخدام الحيوانات" في أوفثالميك والرؤية للبحث. وقد euthanized الحيوانات بثاني أكسيد الكربون والتفكك عنق الرحم اللاحقة.
1-فأر نسيج الشبكية الاست...

<ol>
	<li>Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+Breaking+the+barrier.">Diabetic retinopathy: Breaking the barrier.</a> Pathophysiology. , (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+Brain+Injury+and+Repair+After+Ischemic+Stroke.">Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke.</a> Translational Stroke Research. , (2016).</li><li>Trost, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+and+Retinal+Pericytes:+Origin,+Function+and+Role.">Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).</li><li>Ramos, D., Lagali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Confocal+Laser+Microscopy+to+Analyze+Mouse+Retinal+Blood+Vessels.">The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels.</a> Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).</li><li>Moran, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+cross+talk+in+diabetic+retinopathy:+Pathophysiological+roles+and+therapeutic+implications.">Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).</li><li>Henkind, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+the+peripapillary+retina.">Microcirculation of the peripapillary retina.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte?.">What is a pericyte?.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36, 451-455 (2016).</li><li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+Characterization+of+Retina+Neuroglia+Modifications+in+Diabetic+Zucker+Diabetic+Fatty+Rats.">Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).</li><li>Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characteristics+of+the+retinal+and+choroidal+vasculature.">Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).</li><li>Allen, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity+of+middle+cerebral+artery+occlusion+determines+retinal+deficits+in+rats.">Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats.</a> Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).</li><li>Kyhn, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+retinal+ischemia+caused+by+controlled+low+ocular+perfusion+pressure+in+a+porcine+model.+Electrophysiological+and+histological+characterisation.">Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation.</a> Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).</li><li>Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+CGRP+and+its+receptor+components+CLR+and+RAMP1+in+the+rat+retina.">Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina.</a> Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).</li><li>Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renin-angiotensin+system+and+the+developing+retinal+vasculature.">The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).</li><li>Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+and+characterization+of+putative+mesenchymal+stem+cell+markers+in+the+retinal+capillary+network+of+rodents.">Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents.</a> Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).</li><li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier.">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nature Communications. 8, 15296 (2017).</li><li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo.">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).</li><li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+injection+of+the+heparin+analog+5-amino-2-naphthalenesulfonate+reduces+retinal+neovascularization+in+mice.">Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice.</a> Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).</li><li>Higgins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diltiazem+reduces+retinal+neovascularization+in+a+mouse+model+of+oxygen+induced+retinopathy.">Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy.</a> Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).</li><li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model.">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).</li><li>Hazra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+X+receptor+modulates+diabetic+retinopathy+outcome+in+a+mouse+model+of+streptozotocin-induced+diabetes.">Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes.</a> Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).</li><li>Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antioxidant+gene+therapy+on+the+development+of+diabetic+retinopathy+and+the+metabolic+memory+phenomenon.">Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+degradation+of+VE-cadherin+alters+the+blood-retinal+barrier+in+diabetes.">Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes.</a> Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).</li><li>Gustavsson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+cellular+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+expression+in+mice+retinal+vessels+is+affected+by+both+hyperglycemia+and+hyperlipidemia.">Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia.</a> PLoS One. 5, e12699 (2010).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+retinal+trilaminar+vascular+network.">Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network.</a> Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).</li></ol>

نحن نقدم ثلاث تقنيات إعداد الشبكية التي يمكن تطبيقها في دراسة ميكروفاسكولار بيريسيتيس الشبكية. فيما يلي، نقدم مقارنة بين كل من الطرق وتسليط الضوء على الخطوات الحاسمة في البروتوكولات.
مع تقطيع البرد، هو قطع الشبكية في أقسام السهمي و ومن ثم فإنه من الممكن الحصول على عينات عد?...

بيريسيتيس الشبكية هي تركيز العديد من مختبرات الأبحاث هذه الخلايا تلعب دوراً كبيرا في سلامة المفرج. الحالات المرضية مثل اعتلال الشبكية السكري1والاسكيمية2و3 من الزرق بخصائص الأوعية الدموية التي تنطوي على وظيفة بيريسيتيس. تم العثور على بيريسيتيس في بليكسوسيس الشعرية الشبكية الداخلية. وفروع الشريان الشبكية المركزية التي تزود الشبكية الداخلية في طبقتين من بليكسوسيس الشعرية. سرير الأوعية الداخلية يقع بين الخلية العقدة وطبقات النووية الداخلية. طبقة أعمق أكثر كثافة وتعقيداً وهو مترجم بين طبقات النووي الداخلي والخارجي4،5. وبالإضافة إلى ذلك، تحتوي بعض أجزاء من الشبكية أيضا على شبكة ثالثة تسمى الشعيرات الدموية بارابابيلاري شعاعي. هذه طويلة، مستقيم الشعيرات الدموية التي تقع بين الألياف العصبية ونادراً ما أناستوموسي مع بعضها البعض أو بليكسوسيس اثنين الأخرى6. داخل الجدار الشعرية، بيريسيتيس المضمنة في الغشاء الطابق السفلي وخط على الجانب أبلومينال من الخلايا البطانية في الأوعية الدموية.
وحتى الآن، هناك لا علامة بيولوجية فريدة من نوعها لهذه بيريسيتيس التي يمكن تمييزها عن غيرها من الخلايا والأوعية الدموية. عامل النمو المشتقة من الصفيحات مستقبلات بيتا (PDGFRβ) والأعصاب/الدبقية مستضد 2 (NG2) هي علامات شائعة الاستخدام الذي يقدم في بيريسيتيس ولكن أيضا غيرها من الخلايا والأوعية الدموية. تحديد بيريسيتيس تعقيداً بسبب وجود مجموعات فرعية بيريسيتي التي تختلف في التعبير مورفولوجيا والبروتين7. تعتمد حاليا، تحديد أفضل مزيج من علامات البروتين وتحديد المواقع المميزة من بيريسيتي في جدار الأوعية الدموية. علينا أن نظهر هنا ثلاث تقنيات إعداد الأنسجة المختلفة للمناعي تلطيخ PDGFRβ/NG2 بيريسيتيس microvascular الشبكية الفئران، أي، cryo-أقسام، الجامع--يتصاعد، وناقص التوتر العزلة شبكة الأوعية الدموية.
مع البرد-المقاطع، يتم قطع الشبكية والصلبة عن طريق العصب البصري. وهذا يسمح للتصور من جميع هياكل طبقات من الخلايا العصبية. طبقات الشبكية عشرة متميزة الظاهر كجانب تتبادل الهياكل النووية ومحواري/الجذعية التي يمكن تصور مع بقع مثل الهيماتوكسيلين/ويوزين أو الفلورسنت النووية 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)8. تختلف متطلبات الأيض بين طبقات9 وأنه يوفر طريقة لتحديد سمك أو إجمالي غياب طبقة معينة (مثلاً، فقدان خلايا الشبكية العقدة إحدى السمات المميزة الاسكيمية الشبكية10، 11). ويتضح المفرج كما عرضية يخترق الشبكية، مما يجعل من الممكن لدراسة كل على حدة بليكسوسيس الشعرية داخل طبقات الشبكية كل منهما12،13.
أكثر تقليديا، تجري التحقيقات المتعلقة بشبكة الاتصال الشبكية المفرج في الشبكية كل--يتصاعد. مع هذا الإعداد الأنسجة، قطع شبكية العين وسويت بالأرض كبنية على شكل زهرة. الأسلوب هو أسلوب إعداد أنسجة سريعة نسبيا التي يمكن أن تسلط الضوء على المفرج الشبكية الشاملة في الهندسة المعمارية وذلك كثيرا ما تطبق في تحقيق نيوفاسكولاريزيشن في الشبكية موريني. التصور الناجح من ميكروفاسكولاتوري في الجامعة التي شنت شبكية العين يقال أيضا في وضع الماوس الولدان والفئران الشبكية14،،من1516،،من1718، 19-تكشف هذه الدراسات نشاطا بيريسيتيك أكثر تحديداً مع أكبر المناطق الخالية من شعري في الكبار مقارنة ب المواليد الشبكية14.
هو طريقة أخرى لتصور ميكروفاسكولاتوري الشبكية بعد عزلة ناقص التوتر. نتائج هذا الأسلوب إعداد الأنسجة في الأوعية الدموية الشبكية والشعيرات الدموية سراحهم من الخلايا العصبية. عادة هذا النوع من التصوير ثنائي الأبعاد لشبكة الأوعية الدموية الشبكية معزولة المنجزة بعد التربسين الشبكية الهضم20 والمستخدمة لتقييم تشوهات الأوعية الدموية اعتلال الشبكية السكري بما في ذلك فقدان بيريسيتي والشعرية تنكس20،،من2122. ويوفر طريقة العزل ناقص التوتر التحقيقات الجينات الأوعية الدموية الشبكية والاستجابات التنظيمية البروتين كما فعلوا مع RT-PCR وغرب النشاف23،،من2425. نحن نقدم هنا بروتوكولا لتلطيخ المناعي التعويم الحر للمفرج الشبكية معزولة ناقص التوتر كبديل الهضم التربسين لدراسة بيريسيتيس ميكروفاسكولار.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Geletin from porcine skin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">G2625-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5253-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D5025-15KU</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:165px;">0332-100G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Normal donkey serum</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">017-000-121, lot 129348</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Rabbit anti-PDGFR&#946;</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:165px;">sc-432</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Mouse anti-NG2</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:165px;">ab50009</td>
			<td style="width:171px;">1:500</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-585-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-095-151</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-225-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-165-150</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D9542-1MG</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:165px;">154526</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes

بيريسيتيس الشبكية دوراً هاما في العديد من أمراض العين. المناعي تلطيخ التقنيات الشبكية السفن وميكروفاسكولار بيريسيتيس المركزي لبحوث طب العيون. من المهم أن تختار طريقة مناسبة لتصور بيريسيتيس ميكروفاسكولار. يصف لنا بيريسيتي ميكروفاسكولار الشبكية المناعي تلطيخ في البرد-أقسام وكل--يتصاعد وناقص التوتر المفرج المعزولة باستخدام الأجسام المضادة لعوامل النمو المشتقة من الصفيحات مستقبلات بيتا (PDGFRβ) والأعصاب/الدبقية مستضد 2 (NG2). وهذا يسمح لنا لتسليط الضوء على مزايا وعيوب كل من الأعمال التحضيرية ثلاثة أنسجة لتصور بيريسيتيس ميكروفاسكولار الشبكية. Cryo-أقسام تقديم التصور ترانسيكشونال من جميع طبقات الشبكية لكن تحتوي على إلا عدد قليل من التخفيضات عرضية عرضية ميكروفاسكولاتوري. الجامع-جبل يوفر لمحة عامة عن المفرج الشبكية كاملة، ولكن التصور ميكروفاسكولاتوري يمكن أن تكون مزعجة. ناقص التوتر العزل يوفر طريقة لتصور المفرج الشبكية كاملة بإزالة الخلايا العصبية، ولكن هذا يجعل الأنسجة هشة للغاية.

توفر البروتوكولات الناجحة ثلاثة استعدادات الشبكية المختلفة لتصور بيريسيتيس ميكروفاسكولار. كل من هذه الأساليب تستخدم التعريب المشارك إيمونوريكتيفيتي PDGFRβ وفي NG2 وموقف بيريسيتيس الذي يلتف حول فوريدينتيفيكيشن البطانة الشعرية الفريدة.
مع...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

علينا أن نظهر ثلاث تقنيات إعداد الأنسجة المختلفة للتصور المناعي للفئران بيريسيتيس microvascular الشبكية و أي البرد-أقسام والجامع--يتصاعد والعزلة ناقص التوتر لشبكة الأوعية الدموية.

البرد الشبكية-الفروع، الجامع--يتصاعد، والتحضيرات ناقص التوتر المفرج معزولة للتصور المناعي من بيريسيتيس ميكروفاسكولار

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

يمكن أن تساعد هذه الطرق في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال طب العيون مثل انتشار البيريكيت أو الهجرة. الميزة الرئيسية لهذه الإجراءات هي أنها توفر مجموعة متنوعة من خيارات التصور. إثبات الإجراءات سيكون كارين دريسيغ وفرانك دبليو بليكست، وهما بعد المستندات في مختبرنا.لتقطير العين، أولا استخدام مشرط لجعل الشقوق الخلفية والائلة الأمامية من حوالي 0.5 سم في جفن الفئران. الاستيلاء على العين مع ملقط والميل بعناية إلى الجانب لفضح الأنسجة المحيطة بها. إنحرجي العين عن طريق إجراء التخفيضات مع مقص تشريح في النسيج الضام والعضلات.ضع العين لفترة وجيزة في 4٪ الفورمالديهايد والملوحة الفوسفات المخزنة لمدة دقيقة إلى دقيقتين. شطف لفترة وجيزة في العازلة الصوديوم قبل إجراء ثقب في limbus القرنية عن طريق تطبيق ضغط الضوء مع غيض من مشرط. قطع على طول limbus القرنية مع مقص تشريح لإزالة القرنية والعدسة مع ملقط.غمر الأنسجة المتبقية مع شبكية العين في 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة ساعتين إلى أربع ساعات. Cryo حماية الأنسجة عن طريق الغمر في سورنسون في الفوسفات العازلة التي تحتوي على 10 ٪ سكروز ثم 25 ٪ السكروز. نقل الأنسجة بمجرد أن غرقت إلى الجزء السفلي من الحاوية.تضمين في يازولا المتوسطة أعدت مع 3٪ الجيلاتين من الجلد بورسين و 30٪ من الألبومين من بياض البيض الدجاج. بعد ذلك، قطع 10 ميكرون cryosectionات الرأسية من شبكية العين الجيلاتين جزءا لا يتجزأ من خلال إلى العصب البصري. ضع الاحتياجات على شريحة زجاجية واسمح لها بالجفاف لمدة ساعة واحدة على الأقل.مرة واحدة الجافة، غمر الشريحة في برنامج تلفزيوني مع 0.25٪ تريتون-X 100 لمدة 15 دقيقة. ثم، بالتنقيط خليط من 1:100 مستقبلات PDGF بيتا و 1:500 NG2 الأجسام المضادة الأولية في PBST و 1٪ BSA على القاء الماء ووضع في غرفة رطبة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، قم بغسل المقاطع عن طريق غمر الشريحة في PBST مرتين لمدة 15 دقيقة في كل مرة.ثم بالتنقيط خليط من 1:100 المضادة للماوس اليكسا فلور 594 المرتبطة و 1:100 المضادة للأرانب فيتك الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة المخفف في PBST مع 3 ٪ BSA على cryosections واحتضان لمدة ساعة واحدة في الظلام. بعد الحضانة، شطف الشريحة الزجاجية في PBST مرتين لمدة 15 دقيقة في كل مرة. قم بتركيب الاحتياضات الملطخة مع وسط تصاعد مضاد للتلاشي يحتوي على DAPI و coverlip.تقنية إعداد الأنسجة الشبكية الثانية هي كاملة. بعد إزالة القرنية، استخدم حركات فتح صغيرة من ملقط لفصل الشبكية من ظهارة الصباغ الشبكي نحو العصب البصري. حرّر الشبكية في العصب البصري بمقص التشريح، ثم قم بعمل شقوق من 3 إلى 4 شقوق بطول بضعة ملليمترات من محيط الشبكية باتجاه رأس العصب البصري.انشر الشبكية على شريحة زجاجية واسمح لها بالجفاف لمدة خمس إلى عشر دقائق. بالتنقيط 4٪ الفورمالديهايد على شبكية العين وإصلاح لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد التثبيت، شطف مع برنامج تلفزيوني.للحصول على أفضل النتائج، كبت المثبطات مباشرة بعد الشطف. أولا، بالتنقيط PBST على جبل كامل واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. صب قبالة PBST، ثم إضافة الحل الأجسام المضادة الأولية واحتضان في غرفة رطبة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.في اليوم التالي، صب قبالة الأجسام المضادة الأولية والتنقيط على PBST لشطف شبكية العين مرتين لمدة 15 دقيقة في كل مرة. بعد صب قبالة غسل الثانية، بالتنقيط حل الأجسام المضادة الثانوية على شبكية العين واحتضان لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية، وغسل مرتين مع PBST كما كان من قبل.جبل كامل الملون مع تصاعد مضادة للتلاشي المتوسطة التي تحتوي على DAPI وزلة الغطاء. بديل لتركيب كامل في شبكية العين، يمكن عزل الأوعية الشبكية عن طريق العزلة تحت ضغط الدم. أولاً، ضع الشبكية في ملليلتر واحد من الماء الأيون في لوحة 24 بئرًا واهزها عند 200 دورة في الدقيقة مع مدار اهتزازي 1.5 ملليمتر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم أضف 200 وحدة من DNAse 1 لفك الحطام الخلوي من الأوعية الدموية في شبكية العين ويهتز لمدة 30 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة.شطف شبكية العين في المياه الأيونية لمدة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها مع اهتزاز في 150 إلى 300 دورة في الدقيقة لإزالة حطام الخلايا العصبية. وينبغي أن تصبح شبكية العين أكثر شفافية مع كل شطف، مما يدل على إزالة الحطام الخلوي العصبي. بعد الشطف، وإصلاح شبكية العين في ملليلتر واحد من 4٪ شبهفورمالدهيد وبرنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.شطف مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. إذا كان المضي قدما في المثبطة للمناعة، كتلة الأوعية الدموية المعزولة تحت ضغط الدم مع 500 ميكرولترات من مصل حمار 10٪ المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز في 100 دورة في الدقيقة. بعد حجب, احتضان شبكية العين بين عشية وضحاها في 600 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الأولية التي تتكون من 1:100 PDGF مستقبلات بيتا و 1:500 NG2 الأجسام المضادة الأولية المخففة في 10٪ مصل الحمير وبرنامج تلفزيوني.في اليوم التالي ، شطف شبكة شبكية العين ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق في كل مرة ، ثم احتضان في 1:100 المضادة للماوس اليكسا فلور 594th المرتبطة و 1:100 المضادة للأرانب FITC ، المخفف في مصل 10 ٪ حمار وبرنامج تلفزيوني مع اهتزاز في 100 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في الظلام. بعد غسل لمدة خمس دقائق في PBST ، احتضان في 0.2 نانوغرام لكل ملليلتر DAPI وBBST لمدة 15 دقيقة. غسل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع PBST بينما محمية من الضوء.المقبل، وقطع غيض من ماصة باستور البلاستيك. إزالة حواف حادة باستخدام طرف ماصة، وترطيب ماصة باستور مع PBST، ثم pirate الأوعية الدموية الشبكية في الماصات والاستغناء في شريحة غرفة زجاجية أربعة بئر. خطوة ترطيب المهم لتجنب الأوعية الشبكية التمسك داخل ماصة باستور.ضع الأوعية الدموية الشبكية عن طريق إمالة الشريحة الغرفة ذهابا وإيابا. قم بإزالة الوسيط من آبار الشريحة. سوف التوتر السطحي للسائل تسطيح الأوعية الدموية على الجزء السفلي من الشريحة.إذا لزم الأمر، قطرات بالتنقيط من السائل على الأوعية الدموية الشبكية لتتكشف. تأكد من صحة تتكشف تحت المجهر قبل إزالة الآبار البلاستيكية من الشريحة الغرفة. جبل الأوعية الدموية الملون مع مكافحة يتلاشى تصاعد المتوسطة وزلة الغطاء.NG2 علم المناعة يكشف عن الأوعية الإيجابية داخل الجزء الداخلي من شبكية العين. تشير الأسهم إلى النشاط المناعي الدائري والخوهوة على شكل حدوة حصان في الأوعية. يشير رأس السهم إلى وعاء مقطوع طولي.PDGF مستقبلات بيتا المناعة الكيمياء يظهر المناعي مماثلة لNG2. مرة أخرى تشير الأسهم و رأس السهم إلى نشاط المناعة في الأوعية. هذه الصورة تظهر دمج NG2 باللون الأخضر، بيتا مستقبلات PDGF باللون الأحمر، وDAPI باللون الأزرق.من خلال فرض مرشحات ثلاثة مختلفة ، يتم الكشف عن أن NG2 و PDGF مستقبلات بيتا هي موضعية. تُظهر هذه الصورة إعدادًا كاملًا مُثبّتًا من المُنَاع مع تلطيخ NG2 باللون الأحمر. المناعة مرئية على طول شبكة الأوعية الدموية السطحية مع تلطيخ مكثف في pericytes abluminal.الخلايا العصبية مرئية كما النوى الزرقاء DAPI بين vavasculature الملطخة ب NG2. تُظهر هذه الصورة شبكة الأوعية الدموية الشبكية الشبكية الجرذان المعزولة المهزلة الملطخة بـ NG2 باللون الأخضر وبيتا مستقبلات PDGF باللون الأحمر. وأظهرت الشبكة الكاملة NG2-المناعي.تم العثور على PDGF مستقبلات بيتا المناعية في somas الخلية. في التكبير أعلى, فمن الواضح أن يتم رؤية تلطيخ بيتا مستقبلات PDGF فقط في سوما الخلية في شبكة الأوعية الدموية, مما يدل على النشاط المناعي pericyte. بما في ذلك تلطيخ DAPI مع NG2 و PDGF مستقبلات بيتا يكشف عن ثلاثة pericytes في اثنين من خلايا جدار السفينة غير محددة في هذه الصورة عالية التكبير.بعد هذه الإجراءات، يمكن استخدام مناعة أخرى مثل خلايا العضلات الملساء أو البقع البطانية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية. على سبيل المثال، كيف تبدو الخلايا في الأوعية الدموية الشبكية بعد نقص التروية؟

Research

JoVE Journal

Biology

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Sectioning رقيقة من الاستعدادات لشريحة المناعية

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

باستخدام الملقط ليزر لمعالجة الخلايا العصبية معزولة في المختبر

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

كله يشن التحليل المناعى للالجنينية الاطراف الأوعية الدموية الجلدية : نظام نموذجي لدراسة الأوعية الدموية المتفرعة التشكل في الأجنة

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

تحليل الجنينية واليرقات الزرد الهيكل العظمي Myofibers من الاستعدادات فصلها

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

بروتوكول الأمثل لإعداد Wholemount الشبكية للتصوير والمناعية

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

تحليل الخلوي الحيوانات المنوية: الأعمال التحضيرية لايف والثابتة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخصية

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

رسم الخرائط الزمانية المكانية في القدرة على الحركة في<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; الاستعدادات للأمعاء

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

تحسين تقنيات السويسري المتداول لإعداد المعوية الأنسجة لالمناعى وتحليلات مناعي

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

قياس اندوريدوبليكيشن بقياس التدفق الدرنات المعزولة بروتوبلاستس

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Ex Vivo Choroid فحص من تكوين الأوعية الأوعية الدموية الدقيقة

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...