Name: retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

Forskningen blev finansieret af The Lundbeckfonden, Danmark.

Protokollen blev optimeret og demonstreret på adult mandlig albino rotter. I alle eksperimentelle procedurer, var dyr behandles i henhold til bestemmelser i sætningen ARVO for brug af dyr i Ophthalmic og Vision forskning. Dyrene blev aflivet af kuldioxid og efterfølgende cervikal dislokation.
1. rotte retinale væv præparater
<ol><li>
Cryo-afsnit
	<ol>
<li>Gøre posterior og anterior ~0.5 cm slidser af i den rotte øjenlåg med en skalpel.<ol>
<li>Valgfri: Bruger en Diat...

<ol>
	<li>Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+Breaking+the+barrier.">Diabetic retinopathy: Breaking the barrier.</a> Pathophysiology. , (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+Brain+Injury+and+Repair+After+Ischemic+Stroke.">Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke.</a> Translational Stroke Research. , (2016).</li><li>Trost, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+and+Retinal+Pericytes:+Origin,+Function+and+Role.">Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).</li><li>Ramos, D., Lagali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Confocal+Laser+Microscopy+to+Analyze+Mouse+Retinal+Blood+Vessels.">The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels.</a> Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).</li><li>Moran, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+cross+talk+in+diabetic+retinopathy:+Pathophysiological+roles+and+therapeutic+implications.">Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).</li><li>Henkind, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+the+peripapillary+retina.">Microcirculation of the peripapillary retina.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte?.">What is a pericyte?.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36, 451-455 (2016).</li><li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+Characterization+of+Retina+Neuroglia+Modifications+in+Diabetic+Zucker+Diabetic+Fatty+Rats.">Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).</li><li>Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characteristics+of+the+retinal+and+choroidal+vasculature.">Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).</li><li>Allen, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity+of+middle+cerebral+artery+occlusion+determines+retinal+deficits+in+rats.">Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats.</a> Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).</li><li>Kyhn, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+retinal+ischemia+caused+by+controlled+low+ocular+perfusion+pressure+in+a+porcine+model.+Electrophysiological+and+histological+characterisation.">Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation.</a> Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).</li><li>Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+CGRP+and+its+receptor+components+CLR+and+RAMP1+in+the+rat+retina.">Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina.</a> Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).</li><li>Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renin-angiotensin+system+and+the+developing+retinal+vasculature.">The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).</li><li>Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+and+characterization+of+putative+mesenchymal+stem+cell+markers+in+the+retinal+capillary+network+of+rodents.">Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents.</a> Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).</li><li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier.">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nature Communications. 8, 15296 (2017).</li><li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo.">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).</li><li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+injection+of+the+heparin+analog+5-amino-2-naphthalenesulfonate+reduces+retinal+neovascularization+in+mice.">Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice.</a> Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).</li><li>Higgins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diltiazem+reduces+retinal+neovascularization+in+a+mouse+model+of+oxygen+induced+retinopathy.">Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy.</a> Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).</li><li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model.">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).</li><li>Hazra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+X+receptor+modulates+diabetic+retinopathy+outcome+in+a+mouse+model+of+streptozotocin-induced+diabetes.">Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes.</a> Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).</li><li>Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antioxidant+gene+therapy+on+the+development+of+diabetic+retinopathy+and+the+metabolic+memory+phenomenon.">Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+degradation+of+VE-cadherin+alters+the+blood-retinal+barrier+in+diabetes.">Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes.</a> Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).</li><li>Gustavsson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+cellular+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+expression+in+mice+retinal+vessels+is+affected+by+both+hyperglycemia+and+hyperlipidemia.">Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia.</a> PLoS One. 5, e12699 (2010).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+retinal+trilaminar+vascular+network.">Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network.</a> Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).</li></ol>

Vi præsenterer tre retinal forberedelse teknikker, der kan anvendes i studiet af mikrovaskulære retinale pericytes. Nedenfor, vi leverer en sammenligning mellem hver af metoderne og fremhæve kritiske trin i protokollerne.
Med cryo-skæring, nethinden er skåret i sagittal sektioner og derfor er det muligt at opnå mange prøver fra de samme nethinden. De talord sektioner som følge af denne metode gør det et ideelt valg for antistof specificitet og titrering test som det forhindrer unødve...

Retinal pericytes er i fokus i mange forskningslaboratorier, som disse celler spiller en stor rolle i integriteten af Vaskulaturen. Patologiske tilstande såsom diabetisk retinopati1, iskæmi2og grøn stær3 har vaskulære karakteristika, der vedrører funktionen af pericytes. Pericytes findes i de indre nethinde kapillær plexus. Den centrale retinal arterie, der leverer den indre nethinde filialer i to lag af kapillar plexus. Den indre vaskulære seng ligger mellem ganglion celler og indre nukleare lag. De dybere lag er mere tætte og komplekse og er lokaliseret mellem indre og ydre nukleare lag4,5. Nogle dele af nethinden indeholder derudover også et tredje net betegnes radial parapapillary kapillærer. Disse er lange, lige kapillærerne, der ligger blandt nervefibre og sjældent anastomose med hinanden eller de andre to plexus6. Inden for kapillar væggen, pericytes er indlejret i basalmembranen og line abluminal siden af vascular endothelial celler.
Denne dato er der ingen entydige biologisk markør af disse pericytes, der kan skelne dem fra andre vaskulære celler. Trombocyt-afledt vækst faktor receptor β (PDGFRβ) og nerve/glial antigen 2 (NG2) er almindeligt anvendte markører, som begge findes på pericytes men også andre vaskulære celler. Identifikation af pericytes kompliceres yderligere af eksistensen af pericyte delmængder, der varierer i morfologi og protein udtryk7. I øjeblikket bygger den bedste identifikation på en kombination af protein markører og den karakteristiske placering af pericyte i det vaskulære væg. Vi viser her tre forskellige væv forberedelse teknikker til immunhistokemiske PDGFRβ/NG2 farvning af rotte retinal mikrovaskulære pericytes, dvs., cryo-sektioner, hele-mounts og hypotonic isolation af det vaskulære netværk.
Med cryo-sektioner, er nethinden og sclera skåret gennem synsnerven. Dette giver mulighed for visualisering af alle lagdelt strukturer af neuroner. De forskellige ti lag af nethinden er tilsyneladende som udveksling af nukleare og cytoskeletale/dendritiske strukturer, som kan visualiseres med pletter såsom hæmatoxylin/eosin eller fluorescerende nukleare 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. De metaboliske krav varierer mellem lag9 , og det giver en metode til at bestemme tykkelsen eller total mangel af en bestemt lag (f.eks.tab af retinal ganglion celler er et af kendetegnene ved retinal iskæmi10, 11). Vaskulaturen fremgår som tværgående skærer igennem nethinden, hvilket gør det muligt at separat studere de kapillære plexus inden for de respektive retinal lag12,13.
Mere traditionelt udføres undersøgelser af retinale Vaskulaturen netværk i retinal hele-mounts. Med dette væv forberedelse, er nethinden skåret og flad som en blomst-formet struktur. Metoden er en forholdsvis hurtig væv forberedelse teknik, der kan fremhæve den overordnede arkitektur retinale kar og det er derfor ofte anvendes i forbindelse med undersøgelsen af neovascularization i murine nethinden. Vellykket visualisering af microvasculature i hele monterede nethinder er også rapporteret i udviklingslandene neonatal mus og rotter nethinden14,15,16,17,18, 19. disse undersøgelser viser en mere defineret pericytic aktivitet med større kapillær-fri områder i den voksne i forhold til neonatal nethinden14.
En anden måde at visualisere er den retinale microvasculature efter hypotonic isolation. Dette væv forberedelse teknik resulterer i retinale blodkar og kapillærer bliver befriet af neuronale celler. Denne type af to-dimensionelle billeddannelse af den isolerede retinale vaskulære netværk er normalt udføres efter retinal trypsin fordøjelsen20 og bruges til at vurdere de vaskulære abnormaliteter af diabetisk retinopati herunder pericyte tab og kapillær degeneration20,21,22. Metoden hypotonic isolation tilbyder undersøgelser af retinal vaskulær gen og protein lovgivningsmæssige svar, som de har gjort med RT-PCR og western blotting23,24,25. Vi giver her en protokol for free-float immunhistokemisk farvning af hypotonic isoleret retinal Vaskulaturen som et alternativ til trypsin fordøjelsen at undersøge den mikrovaskulære pericytes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Geletin from porcine skin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">G2625-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5253-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D5025-15KU</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:165px;">0332-100G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Normal donkey serum</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">017-000-121, lot 129348</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Rabbit anti-PDGFR&#946;</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:165px;">sc-432</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Mouse anti-NG2</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:165px;">ab50009</td>
			<td style="width:171px;">1:500</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-585-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-095-151</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-225-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-165-150</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D9542-1MG</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:165px;">154526</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes

Retinal pericytes spille en vigtig rolle i mange sygdomme i øjet. Immunhistokemisk farvning teknikker af retinale fartøjer og mikrovaskulære er pericytes centrale for oftalmologisk forskning. Det er vigtigt at vælge en passende metode til at visualisere den mikrovaskulære pericytes. Vi beskriver retinal mikrovaskulære pericyte immunhistokemisk farvning i cryo-sektioner, hele-mounts og hypotonic isoleret Vaskulaturen ved hjælp af antistoffer for Trombocyt-afledt vækst faktor receptor β (PDGFRβ) og nerve/glial antigen 2 (NG2). Dette gør det muligt for os at fremhæve fordele og ulemper ved hver af de tre væv forberedelser for visualisering af den retinale mikrovaskulære pericytes. Cryo-sektioner giver transsectional visualisering af alle retinal lag men indeholder kun et par lejlighedsvis tværgående nedskæringer af microvasculature. Hele-mount giver et overblik over hele retinal Vaskulaturen, men visualisering af microvasculature kan være generende. Hypotonic isolation er en metode til at visualisere hele retinal Vaskulaturen ved fjernelse af neuronale celler, men dette gør vævet meget skrøbelige.

De succesfulde protokoller giver tre forskellige retinal præparater til at visualisere mikrovaskulære pericytes. Hver af disse metoder benytter PDGFRβ og NG2 immunoreactivity Co lokaliseringen og den enestående placering i den pericytes, der ombrydes omkring den kapillære endothelium foridentification.
Med cryo-sektioner, neuronal lag kan identificeres af de fluorescerende tæthed af DAPI-mærket kerner og inderste og dybt ...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Vi viser tre forskellige væv forberedelse teknikker til immunhistokemiske visualisering af rotte retinal mikrovaskulære pericytes, dvs., cryo-sektioner, hele-mounts og hypotonic isolation af det vaskulære netværk.

Retinal Cryo-sektioner, hele-Mounts og Hypotonic isoleret Vaskulaturen forberedelserne til immunhistokemiske visualisering af mikrovaskulære Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Disse metoder kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for oftalmologi, f.eks. Den største fordel ved denne procedure er, at de giver en bred vifte af visualisering muligheder. Påvisning af procedurerne vil være Karin Dreisig og Frank W.Blixt, to post-docs på vores laboratorium.For at fremkalde øjet, først bruge en skalpel til at gøre den bageste og forreste slidser på ca 0,5 centimeter i rotte øjenlåget. Grib øjet med spint og vip forsigtigt til siden for at eksponere det omgivende væv. Enucleate øjet ved at foretage nedskæringer med dissektion saks i bindevæv og muskelvæv.Kort placere øjet i 4% formaldehyd og fosfat-buffered saltvand i et til to minutter. Skyl kortvarigt i natriumbufferen, før du laver et hul i hornhinden ved at anvende let tryk med spidsen af en skalpel. Skær langs hornhinden limbus med dissektion saks til at fjerne hornhinden og linsen med stænt.Nedsænk det resterende væv med nethinden i 4% formaldehyd i PBS i to til fire timer. Cryo-beskytte vævet ved nedsænkning i Sorenson's fosfat buffer indeholder 10% saccharose og derefter 25% saccharose. Overfør vævet, når det er sunket til bunden af beholderen.Integrer i Yazulla medium tilberedt med 3% gelatine fra svinehud og 30% albumin fra kylling æggehvide. Dernæst skæres 10-mikron lodrette kryosektioner af gelatine-indlejret nethinden igennem til synsnerven. Placer kryosekterne på et glasrutsjebane og lad det tørre i mindst en time.Når det er tørt, nedsænkes diaset i PBS med 0,25% Triton-X 100 i 15 minutter. Derefter dryppe en blanding af 1:100 PDGF receptor beta og 1:500 NG2 primære antistoffer i PBST og 1% BSA på kryosektion og sted i et fugtigt kammer ved fire grader Celsius natten over. Den næste dag skal du vaske sektionerne ved at nedsænke rutsjebanen i PBST to gange i 15 minutter hver gang.Drypper derefter en blanding af 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594-forbundet og 1:100 Anti-Rabbit FITC-fortyndet sekundære antistoffer fortyndet i PBST med 3% BSA på kryosektioner og inkubere i en time i mørke. Efter inkubationen skylles glasrutsjebanen i PBST to gange i 15 minutter hver gang. Monter de farvede kryosektioner med anti-fading monteringsmedium, der indeholder DAPI og en coverslip.En anden retinal væv præparat teknik er hele mount. Efter fjernelse af hornhinden, bruge små åbning bevægelser af anpint til at adskille nethinden fra nethinde pigment epitel mod synsnerven. Befri nethinden ved synsnerven med dissektion saks og gøre tre til fire slidser af et par millimeter'længde fra retinal periferien mod synsnerven hovedet.Spred nethinden på et glas dias og lad det tørre i fem til 10 minutter. Dryp 4% formaldehyd på nethinden og fix i 20 til 30 minutter. Efter fiksering skylles med PBS.For optimale resultater, immunostain direkte efter skylning. Dryp først PBST på hele holderen og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter. Hæld PBST, tilsæt derefter den primære antistofopløsning og inkuberes i et fugtigt kammer ved fire grader Celsius natten over.Den næste dag hældes det primære antistof af, og druk på PBST for at skylle nethinden to gange i 15 minutter hver gang. Efter hælde den anden vask, dryppe sekundære antistof opløsning på nethinden og inkubere i en time i et fugtigt kammer ved stuetemperatur i mørke. Efter den sekundære antistofinkubation vaskes to gange med PBST som før.Monter den farvede hele mount med anti-fading montering medium, der indeholder DAPI og et dæksel slip. Alternativ til hele montering af nethinden, kan nethinden vaskulaturen isoleres ved hypotonisk isolation. Først skal du placere nethinden i en milliliter deioniseret vand i en 24-brøndplade og ryst ved 200 rpm med en 1,5-millimeter vibrationsbane i en time ved stuetemperatur, tilsæt derefter 200 enheder af DNAse 1 for at adskille lysnet cellerester fra retinal vaskulatur og ryst i yderligere 30 minutter ved stuetemperatur.Skyl nethinden i deioniseret vand i tre gange i fem minutter hver med omrystning ved 150 til 300 rpm for at fjerne neuronal cellerester. Nethinden bør blive mere gennemsigtig med hver skylning, hvilket indikerer fjernelse af neuronal cellulære rester. Efter skylning fastgør nethinden i en milliliter 4%paraformaldehyd og PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.Skyl med PBS tre gange. Hvis du fortsætter med immunstaining, blokeres den hypotonisolerede vaskulatur med 500 mikroliter på 10 % æselserum fortyndet i PBS i en time med omrystning ved 100 omdr./min. Efter blokering inkuberes nethinden natten over i 600 mikroliter af primær antistofopløsning bestående af 1:100 PDGF-receptor beta og 1:500 NG2 primære antistoffer fortyndet i 10% æsel serum og PBS.Den næste dag skylles nethindenetværket tre gange i PBS i fem minutter hver gang, derefter inkuberes i 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594th-linked og 1:100 Anti-Rabbit FITC-forbundne sekundære antistoffer, fortyndet i 10% æsel serum og PBS med omrystning ved 100 rpm ved stuetemperatur i en time i mørke. Efter fem minutters vask i PBST inkuberes i 0,2 nanogram pr. milliliter DAPI og PBST i 15 minutter. Vask tre gange i fem minutter med PBST, mens den er beskyttet mod lys.Dernæst skæres spidsen af en plastik Pasteur pipette. Fjern skarpe kanter ved hjælp af en pipettespids, og fugt Pasteur-pipetten med PBST, og inspirer derefter retinal vaskulaturen ind i pipetten og dispenser til en fire-brønds glaskammerslide. Den fugtgivende skridt er vigtigt at undgå retinale vaskulatur klæber til indersiden af Pasteur pipette.Placer retinal vaskulaturen ved at vippe kammeret glide frem og tilbage. Fjern mediet fra brøndene på kammersliden. Overfladen spænding af væsken vil flade vaskulaturen på bunden af diaset.Hvis det er nødvendigt, dryppe dråber væske på retinale vaskulatur at udfolde sig. Sørg for korrekt udfoldelse under et mikroskop, før du fjerner plastbængerne fra kammersliden. Monter den farvede vaskulatur med anti-fading montering medium og et dække slip.NG2 immunohistochemistry afslører positive fartøjer i den indre del af nethinden. Pilene angiver cirkulær og hesteskoformet immunoraktivitet i karrene. Pilespidsen peger på et fartøj, der er overgående.PDGF-receptor beta immunohistochemistry viser lignende immunoraktivitet til NG2. Igen pilene og pilespidsen angiver immunor aktivitet i karrene. Dette billede viser en sammenfletning af NG2 i grøn, PDGF-receptor beta i rødt, og DAPI i blåt.Ved at overlejre de tre forskellige filtre, det er afsløret, at NG2 og PDGF-receptor beta er co-lokaliseret. Dette billede viser en immunostained hele mount forberedelse med NG2 farvning i rødt. Immunoraktivitet er synlig langs det overfladiske vaskulære netværk med intens farvning i abluminale pericyter.De neuronale celler er synlige som DAPI blå kerner mellem NG2-farvede mikrovasculatur. Dette billede viser den hypotoniske isolerede rotte retinale vaskulære netværk farves med NG2 i grøn og PDGF-receptor beta i rødt. Det komplette netværk viste NG2-immunoreaktivitet.PDGF-receptor beta immunoreaktivitet blev fundet i celle somas. Ved højere forstørrelse er det klart, at PDGF-receptor beta farvning kun ses i celle somas i det vaskulære netværk, hvilket indikerer pericyt immunoreaktivitet. Herunder DAPI farvning sammen med NG2 og PDGF-receptor beta afslører tre pericytter i to udefinerede fartøj vægceller i denne høj forstørrelse billede.Efter disse procedurer, andre immunostainings som glat muskel celle eller endotel farvning kan bruges til at besvare yderligere spørgsmål. For eksempel, hvordan celler i retinal vaskulatur ser efter iskæmi?

Research

JoVE Journal

Biology

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse af embryonale og larvestadiet Zebrafisk Skeletal myofibre fra Dissocierede Forberedelser

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytologiske Analyse af Spermatogenese: Levende og Faste Tilberedt<em&gt; Drosophila</em&gt; Testikler

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Kortlægning af Motilitet i<em&gt; Ex vivo</em&gt; Forberedelser af tarmene

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Forbedret Swiss-rullende Teknik for tarmvæv Forberedelse til immunhistokemisk og Immunofluorescerende Analyser

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Måling af endoreduplikation ved flowcytometri af isolerede knold Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

En Ex Vivo Choroid Spirende Assay af okulær mikrovaskulær angiogenese

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...