Name: retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

המחקר מומן על ידי קרן לונדבק, דנמרק.

הפרוטוקול היה ממוטב, הפגינו על חולדות לבקן זכרים בוגרים. בכל ההליכים ניסיוני, חיות טופלו בתקנות המשפט ארוו שימוש בבעלי חיים של לרפואת עיניים ומחקר חזון. בעלי חיים היו מורדמים על ידי פחמן דו-חמצני ו עוקבות נקע בצוואר הרחם.
1. עכברוש רקמת רשתית ההכנות
<ol><li>
הקפאה-סעיף
	...

<ol>
	<li>Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+Breaking+the+barrier.">Diabetic retinopathy: Breaking the barrier.</a> Pathophysiology. , (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+Brain+Injury+and+Repair+After+Ischemic+Stroke.">Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke.</a> Translational Stroke Research. , (2016).</li><li>Trost, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+and+Retinal+Pericytes:+Origin,+Function+and+Role.">Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).</li><li>Ramos, D., Lagali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Confocal+Laser+Microscopy+to+Analyze+Mouse+Retinal+Blood+Vessels.">The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels.</a> Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).</li><li>Moran, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+cross+talk+in+diabetic+retinopathy:+Pathophysiological+roles+and+therapeutic+implications.">Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).</li><li>Henkind, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+the+peripapillary+retina.">Microcirculation of the peripapillary retina.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte?.">What is a pericyte?.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36, 451-455 (2016).</li><li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+Characterization+of+Retina+Neuroglia+Modifications+in+Diabetic+Zucker+Diabetic+Fatty+Rats.">Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).</li><li>Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characteristics+of+the+retinal+and+choroidal+vasculature.">Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).</li><li>Allen, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity+of+middle+cerebral+artery+occlusion+determines+retinal+deficits+in+rats.">Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats.</a> Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).</li><li>Kyhn, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+retinal+ischemia+caused+by+controlled+low+ocular+perfusion+pressure+in+a+porcine+model.+Electrophysiological+and+histological+characterisation.">Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation.</a> Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).</li><li>Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+CGRP+and+its+receptor+components+CLR+and+RAMP1+in+the+rat+retina.">Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina.</a> Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).</li><li>Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renin-angiotensin+system+and+the+developing+retinal+vasculature.">The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).</li><li>Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+and+characterization+of+putative+mesenchymal+stem+cell+markers+in+the+retinal+capillary+network+of+rodents.">Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents.</a> Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).</li><li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier.">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nature Communications. 8, 15296 (2017).</li><li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo.">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).</li><li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+injection+of+the+heparin+analog+5-amino-2-naphthalenesulfonate+reduces+retinal+neovascularization+in+mice.">Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice.</a> Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).</li><li>Higgins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diltiazem+reduces+retinal+neovascularization+in+a+mouse+model+of+oxygen+induced+retinopathy.">Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy.</a> Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).</li><li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model.">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).</li><li>Hazra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+X+receptor+modulates+diabetic+retinopathy+outcome+in+a+mouse+model+of+streptozotocin-induced+diabetes.">Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes.</a> Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).</li><li>Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antioxidant+gene+therapy+on+the+development+of+diabetic+retinopathy+and+the+metabolic+memory+phenomenon.">Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+degradation+of+VE-cadherin+alters+the+blood-retinal+barrier+in+diabetes.">Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes.</a> Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).</li><li>Gustavsson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+cellular+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+expression+in+mice+retinal+vessels+is+affected+by+both+hyperglycemia+and+hyperlipidemia.">Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia.</a> PLoS One. 5, e12699 (2010).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+retinal+trilaminar+vascular+network.">Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network.</a> Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).</li></ol>

אנו מציגים שלוש טכניקות הכנה רשתית שניתן להחיל במחקר של microvascular pericytes ברשתית. להלן, אנו לספק השוואה בין כל אחת מהשיטות, לסמן את השלבים הקריטיים של הפרוטוקולים.
עם חלוקתה הקפאה, הרשתית נחתך בסעיפים הווריד, לכן, זה אפשרי להשיג דגימות רבות של הרשתית אותו. הסעיפים ספרתיות הנובע בש...

Pericytes ברשתית הם המוקד של מעבדות מחקר רבים כמו תאים אלה ממלאים תפקיד מרכזי באינטגריטי של להערכת. מצבים פתולוגיים כגון רטינופתיה סוכרתית1, איסכמיה2וגלאוקומה3 יש מאפייני וסקולרית המערבות את הפונקציה של pericytes. Pericytes ניתן למצוא את plexuses הפנימית נימי ברשתית. עורק רשתית מרכזי המספק הרשתית פנימי מסתעף שתי שכבות של plexuses נימי. המיטה כלי הדם הפנימיים ממוקם בין שכבות הגרעין הפנימי תא גנגליון. לרובד העמוק יותר צפוף ומורכב, הוא מקומי בין השכבות הפנימיות והחיצוניות גרעיני4,5. בנוסף, חלקים מסוימים של הרשתית מכילים גם לרשת השלישית כינה הנימים parapapillary רדיאלי. אלו הם ארוכים, נימים ישר שנמצאים בין סיבי העצב ולעיתים רחוקות anastomose עם אחד לשני או אחרים plexuses שני6. בתוך הקיר נימי, pericytes נעוצים קרום המרתף, קו הצד abluminal של תאי אנדותל כלי הדם.
מועד זה, יש אין סמן ביולוגי ייחודי של אלה pericytes יכול להבדיל אותם מתאי דם אחרים. Β קולטן גורם גידול נגזר טסית דם (PDGFRβ) עצב/גליה אנטיגן 2 (NG2) נפוץ סמנים אשר שניהם מציגים על pericytes אבל גם אחרים בתאי הדם בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. זיהוי של pericytes מסובך עוד יותר בקיומן של קבוצות משנה pericyte נבדלים ביטוי חלבון ומורפולוגיה7. כיום, הזיהוי הטוב ביותר מתבססת על שילוב של סמני חלבונים, את מיקום אופייני pericyte בדופן כלי הדם. נדגים כאן שלוש טכניקות להכנת רקמות שונות עבור נוגדן PDGFRβ/NG2 pericytes microvascular ברשתית עכברוש, קרי, הקפאה-סעיפים, שלם-טעינות, ו בידוד היפוטוניק של רשת כלי הדם.
עם הקפאה-חלקים, הרשתית ואת בסקלרה נחתכים דרך עצב הראייה. דבר זה מאפשר הפריט החזותי של כל מבני שכבות של נוירונים. הרבדים עשר ברורים של הרשתית נראים לעין כמו מתחלפות מבנים גרעינית, עצב/דנדריטים, ניתן לאבחן עם כתמים כגון hematoxylin/אאוזין או פלורסנט גרעיני 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי)8. הדרישות מטבוליים שונים בין שכבות9 וזה מספק שיטה לקביעת העדר עובי או סך של שכבה מסוימת (למשל, אובדן תאי גנגליון נמנה עם גולת הכותרת של איסכמיה ברשתית10, 11). להערכת מתבטא כפי רוחבי חתכים דרך הרשתית, כך שניתן ללמוד בנפרד את plexuses נימי בתוך שכבות הרשתית בהתאמה12,13.
באופן מסורתי יותר, החקירות של הרשת להערכת ברשתית מבוצעות בכל רשתית-טעינות. עם הכנת הרקמה, הרשתית לחתוך, משוטחים כמבנה בצורת פרח. השיטה היא טכניקה הכנה רקמות מהיר יחסית ניתן לסמן להערכת ברשתית הכוללת את אדריכלות והיא ולכן לעיתים קרובות חלה לגבי חקירת כורוידאלית ברשתית מאתר. ויזואליזציה מוצלח של microvasculature ב רשתית רכוב כל הוא דיווח גם העכבר neonatal המתפתח, עכברוש רשתית14,15,16,17,18, 19. מחקרים אלה לחשוף את פעילות pericytic מוגדרים יותר עם אזורים גדולים יותר ללא נימי במבוגר בהשוואה רשתית neonatal14.
דרך נוספת של ויזואליזציה של היא microvasculature ברשתית לאחר בידוד היפוטוניק. טכניקה זו הכנה רקמות התוצאה כלי הדם ברשתית נימים להיות משוחררים של תאים עצביים. סוג זה של הדמיה דו מימדי של רשת כלי הדם ברשתית מבודד הוא בדרך כלל לאחר עיכול טריפסין ברשתית20 ואין להשתמש כדי להעריך את חריגות בכלי הדם של רטינופתיה סוכרתית כולל אובדן pericyte נימי ניוון20,21,22. שיטת בידוד היפוטוניק מציעה החקירות של ג'ין כלי הדם ברשתית ותגובות חלבון רגולטורי הם סיים עם RT-PCR והמערבי סופג23,24,25. אנו מספקים כאן פרוטוקול עבור החזקות חינם נוגדן של להערכת ברשתית מבודדים היפוטוניק כחלופה טריפסין לעיכול כדי לבחון את pericytes microvascular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Geletin from porcine skin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">G2625-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5253-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D5025-15KU</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:165px;">0332-100G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Normal donkey serum</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">017-000-121, lot 129348</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Rabbit anti-PDGFR&#946;</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:165px;">sc-432</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Mouse anti-NG2</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:165px;">ab50009</td>
			<td style="width:171px;">1:500</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-585-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-095-151</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-225-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-165-150</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D9542-1MG</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:165px;">154526</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes

Pericytes ברשתית תפקיד חשוב למחלות רבות של העין. Immunohistochemical מכתים טכניקות של כלי רשתית microvascular pericytes הן גורם מרכזי מחקר ophthalmological. זה חיוני כדי לבחור שיטה המתאימה להמחיש את pericytes microvascular. אנו מתארים רשתית pericyte microvascular immunohistochemical מכתים הקפאה-סעיפים, שלם-mounts ו היפוטוניק להערכת מבודדים באמצעות נוגדנים עבור β קולטן גורם גידול נגזר טסית דם (PDGFRβ) ועצב/גליה אנטיגן 2 (NG2). זה מאפשר לנו להדגיש את היתרונות ואת החסרונות של כל אחד שלוש רקמות ההכנות החזיית pericytes microvascular ברשתית. הקפאה-סעיפים לספק transsectional ויזואליזציה של כל השכבות ברשתית אך מכיל רק כמה ומדי פעם רוחבי שמכינים microvasculature. כולה-הר מספק סקירה של להערכת ברשתית כולו, אבל ויזואליזציה של microvasculature יכול להיות בעייתי. בידוד היפוטוניק מספק שיטה כדי להמחיש את להערכת ברשתית כולו על ידי הסרת תאים עצביים, אבל זה הופך את הרקמה שברירי.

הפרוטוקולים מצליח לספק שלושה תכשירים רשתית שונות להמחשת microvascular pericytes. כל השיטות האלה משתמש PDGFRβ, NG2 immunoreactivity שיתוף הלוקליזציה של המיקום הייחודי של pericytes זה לעטוף foridentification אנדותל נימי.
עם הקפאה-מקטעים, הרבדים עצביים יכול להיות מזוהה על ידי...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

נדגים שלוש טכניקות להכנת רקמות שונות להמחשת immunohistochemical של pericytes microvascular ברשתית עכברוש, קרי, הקפאה-סעיפים, שלם-טעינות בידוד היפוטוניק של רשת כלי הדם.

הקפאה-מקטעי רשתית, שלם-טעינות, וההכנות להערכת מבודד היפוטוניק להמחשת Immunohistochemical של Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

שיטות אלה יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום רפואת העיניים כגון התפשטות pericyte או הגירה. היתרון העיקרי של הליך זה הוא שהם מספקים מגוון רחב של אפשרויות הדמיה. הדגמת ההליכים תהיה קארין דריסיג ופרנק וו.בליקסט, שני פוסט-דוקטורנטים במעבדה שלנו.כדי להפוך את העין, תחילה להשתמש באזמל כדי להפוך את חריצים האחוריים הקדמיים של כ 0.5 ס"מ העפעף חולדה. לתפוס את העין עם מדפים להטות בזהירות לצד כדי לחשוף את הרקמה שמסביב. להנהן את העין על ידי ביצוע חתכים עם מספריים ניתוח ברקמת החיבור והשרירים.מניחים בקצרה את העין ב-4% פורמלדהיד ותמיסת מלח עם אגירת פוספט למשך שעה עד שתי דקות. יש לשטוף בקצרה במאגר הנתרן לפני ביצוע חור בלימבוס הקרנית על ידי הפעלת לחץ קל עם קצה אזמל. חותכים לאורך לימבוס הקרנית עם מספריים ניתוח כדי להסיר את הקרנית ואת העדשה עם מדחפים.להטביע את הרקמה הנותרת עם רשתית ב 4% פורמלדהיד ב PBS במשך שעתיים עד ארבע שעות. Cryo-להגן על הרקמה על ידי טבילה במאגר הפוספט של סורנסון המכיל 10% סוכרוז ולאחר מכן 25% סוכרוז. להעביר את הרקמה ברגע שהוא שקע לתחתית המיכל.מטמיע במדיום Yazulla מוכן עם 3% ג'לטין מעור פורצ'ין ו 30% אלבומין מעוף ביצה לבן. לאחר מכן, חותכים 10 מיקרון קריוסקופים אנכיים של הרשתית מוטבע ג'לטין דרך לעצב הראייה. מניחים את ההקפאות על מגלשת זכוכית ומאפשרים להתייבש למשך שעה לפחות.לאחר התייבשות, הטביעו את השקופית ב-PBS עם 0.25%Triton-X 100 למשך 15 דקות. לאחר מכן, לטפטף תערובת של 1:100 קולטן PDGF בטא ו 1:500 NG2 נוגדנים ראשוניים PBST ו 1%BSA על ההקפאה ומניחים בתא לח בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת, לשטוף את החלקים על ידי טבילת השקופית PBST פעמיים במשך 15 דקות בכל פעם.ואז לטפטף תערובת של 1:100 נגד עכבר אלקסה פלואור 594 מקושר ו 1:100 אנטי ארנב FITC מקושר נוגדנים משניים מדולל PBST עם 3%BSA על קריוסקטים דגירה במשך שעה אחת בחושך. לאחר הדגירה, לשטוף את החלקת הזכוכית PBST פעמיים במשך 15 דקות בכל פעם. הר את ההקפאות המוכתמות עם מדיום הרכבה אנטי דהוי המכיל DAPI וכיסוי.טכניקת הכנה שנייה של רקמת הרשתית היא הר שלם. לאחר הסרת הקרנית, השתמש בתנועות פתיחה קטנות של ממטרים כדי להפריד את הרשתית מאפיתל הפיגמנט ברשתית לכיוון עצב הראייה. לשחרר את הרשתית בעצב הראייה עם מספריים ניתוח ולעשות שלושה עד ארבעה חריצים של כמה מילימטרים באורך מהפריפריה הרשתית לכיוון ראש עצב הראייה.מורחים את הרשתית על מגלשת זכוכית ומאפשרים להתייבש במשך חמש עד עשר דקות. מטפטף 4% פורמלדהיד על הרשתית ומתקן במשך 20 עד 30 דקות. לאחר קיבעון, לשטוף עם PBS.לקבלת תוצאות מיטביות, יש לתפוך חיסוני ישירות לאחר שטיפה. ראשית, לטפטף PBST על כל הר הדגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. יוצקים את PBST, ולאחר מכן מוסיפים את פתרון הנוגדן העיקרי דגירה בתא לח בארבע מעלות צלזיוס לילה.למחרת, לשפוך את הנוגדן העיקרי לטפטף על PBST לשטוף את הרשתית פעמיים במשך 15 דקות בכל פעם. לאחר שפיכת הכביסה השנייה, מטפטפים תטמין נוגדן משני על הרשתית ומדרגים במשך שעה בתא לח בטמפרטורת החדר בחושך. בעקבות דגירה נוגדנים משנית, לשטוף פעמיים עם PBST כמו קודם.הר את ההרכבה כולה המוכתמת עם מדיום הרכבה נגד דהיה המכיל DAPI ותרשים כיסוי. חלופה להרכבה שלמה של הרשתית, כלי הדם ברשתית יכולים להיות מבודדים על ידי בידוד היפוטוני. ראשית, מניחים את הרשתית במיליליטר אחד של מים deionized בצלחת 24 באר לנער ב 200 סל"ד עם מסלול רטט 1.5 מילימטר במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להוסיף 200 יחידות של DNAse 1 כדי לנטרל את פסולת התא lysed מן כלי הדם הרשתית לנער עוד 30 דקות בטמפרטורת החדר.לשטוף את הרשתית במים deionized במשך שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם רועד ב 150 עד 300 סל"ד כדי להסיר פסולת תאים עצביים. הרשתית צריכה להיות שקופה יותר עם כל שטיפה, המעיד על הסרת פסולת תאית עצבית. לאחר שטיפה, לתקן את הרשתית במיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde ו PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.יש לשטוף עם PBS שלוש פעמים. אם נמשיך לכשל חיסוני, חסום את כלי הדם המבודדים ההיפוטוניים עם 500 מיקרוליטרים של סרום חמור 10%מדולל ב- PBS למשך שעה עם רעידות ב-100 סל"ד. לאחר החסימה, דגירה הרשתית לילה ב 600 microliters של פתרון נוגדנים ראשוני המורכב 1:100 PDGF-קולטן בטא ו 1:500 NG2 נוגדנים ראשוניים מדולל 10% נסיוב חמור PBS.למחרת, לשטוף את רשת הרשתית שלוש פעמים PBS במשך חמש דקות בכל פעם, ולאחר מכן דגירה 1:100 נגד העכבר Alexa Fluor 594-מקושר ו 1:100 נוגדנים משניים נגד ארנב FITC מקושר, מדולל 10% נסיוב חמור PBS עם רועד ב 100 סל"ד בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת בחושך. לאחר שטיפה של חמש דקות ב- PBST, דגירה ב- DAPI ו- PBST של 0.2 ננוגרם למיליליטר ו- PBST למשך 15 דקות. יש לשטוף שלוש פעמים במשך חמש דקות באמצעות PBST בעודכם מוגנים מפני אור.לאחר מכן, חותכים את הקצה של פיפטה פסטר פלסטיק. הסר קצוות חדים באמצעות קצה פיפטה, ולהרים את פיפטה פסטר עם PBST, ולאחר מכן שאפו את כלי הדם הרשתית לתוך פיפטה ולחלק לתוך שקופית תא זכוכית ארבע היטב. הצעד המהנה חשוב כדי למנוע את כלי הדם הרשתית דבק החלק הפנימי של פיפטה פסטר.מקם את כלי הדם הרשתית על ידי הטיית החלקת התא קדימה ואחורה. הסר את המדיום מ בארות השקופית התאית. מתח פני השטח של הנוזל ישטח את כלי הדם לתחתית המגלשה.במידת הצורך, טיפות טפטוף של נוזל על כלי הדם הרשתית להתפתח. ודאו שהם נפרשים נכון תחת מיקרוסקופ לפני הסרת בארות הפלסטיק ממגלשת התא. הר את כלי הדם המוכתמים עם מדיום הרכבה אנטי דהוי ותפתק כיסוי.אימונוהיסטוכימיה NG2 מגלה כלי חיובי בתוך החלק הפנימי של הרשתית. החצים מציינים אימונואקטיביות מעגלית בצורת פרסה בכלי הדם. ראש החץ מצביע על כלי אורך חתוך.אימונוהיסטוכימיה בטא קולטן PDGF מראה אימונואקטיביות דומה NG2. שוב החצים וראש החץ מצביעים על חוסר פעילות חיסונית בכלי הדם. תמונה זו מציגה מיזוג של NG2 בבטא ירוקה, קולטן PDGF באדום ו- DAPI בכחול.על ידי העל-פילינג שלושת המסננים השונים, מתגלה כי בטא קולטן NG2 ו- PDGF הם מקומיים במשותף. תמונה זו מציגה הכנה כולה מוכתמת בחיסון עם כתמי NG2 באדום. אימונואקטיביות גלויה לאורך רשת כלי הדם השטחית עם כתמים עזים ב pericytes abluminal.התאים העצביים נראים כגרעין כחול DAPI בין microvasculature מוכתם NG2. תמונה זו מציגה את רשת כלי הדם של החולדה המבודדת ההיפוטונית המוכתמת ב- NG2 בבטא ירוקה ובטא קולטן PDGF באדום. הרשת המלאה הראתה NG2-אימונואקטיביות.אימונואקטיביות בטא קולטן PDGF נמצאה סומאס התא. בהגדלה גבוהה יותר, ברור כי כתמי בטא קולטן PDGF נראה רק somas התא ברשת כלי הדם, המציין אימונואקטיביות pericyte. כולל כתמי DAPI יחד עם בטא קולטן NG2 ו- PDGF מגלה שלושה pericytes בשני תאי קיר כלי לא מוגדרים בתמונה זו הגדלה גבוהה.בעקבות הליכים אלה, ניתן להשתמש בכשלים חיסוניים אחרים כמו תאי שריר חלקים או כתמי אנדותל כדי לענות על שאלות נוספות. לדוגמה, כיצד תאים בכלי הדם הרשתית נראים בעקבות איסקמיה?

Research

JoVE Journal

Biology

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

חתך דק של ההכנות פורסים עבור אימונוהיסטוכימיה

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

בעזרת פינצטה לייזר עבור מניפולציה נוירונים מבודד במבחנה

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

מיפוי Spatiotemporal של תנועתיות ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תכשירים מהמעיים

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

טכניקה Swiss-מתגלגל משופר עבור הכנת רקמת המעי עבור immunohistochemical ו ניתוח Immunofluorescent

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

מדידת Endoreduplication על ידי Cytometry זרימה של פקעת מבודד Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

אקס ויוו צ'רויד נבט א-סאי של אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...