Name: retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

अनुसंधान Lundbeck फाउंडेशन, डेनमार्क द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

प्रोटोकॉल अनुकूलित और वयस्क पुरुष albino चूहों पर प्रदर्शन किया गया था । सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं में, पशुओं नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में पशुओं के उपयोग के लिए ARVO बयान में नियमों के अनुसार इलाज किया गया । ...

<ol>
	<li>Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+Breaking+the+barrier.">Diabetic retinopathy: Breaking the barrier.</a> Pathophysiology. , (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+Brain+Injury+and+Repair+After+Ischemic+Stroke.">Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke.</a> Translational Stroke Research. , (2016).</li><li>Trost, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+and+Retinal+Pericytes:+Origin,+Function+and+Role.">Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).</li><li>Ramos, D., Lagali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Confocal+Laser+Microscopy+to+Analyze+Mouse+Retinal+Blood+Vessels.">The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels.</a> Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).</li><li>Moran, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+cross+talk+in+diabetic+retinopathy:+Pathophysiological+roles+and+therapeutic+implications.">Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).</li><li>Henkind, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+the+peripapillary+retina.">Microcirculation of the peripapillary retina.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diltiazem+reduces+retinal+neovascularization+in+a+mouse+model+of+oxygen+induced+retinopathy.">Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy.</a> Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).</li><li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. 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G., Menicucci, G., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+degradation+of+VE-cadherin+alters+the+blood-retinal+barrier+in+diabetes.">Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes.</a> Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).</li><li>Gustavsson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+cellular+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+expression+in+mice+retinal+vessels+is+affected+by+both+hyperglycemia+and+hyperlipidemia.">Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia.</a> PLoS One. 5, e12699 (2010).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+retinal+trilaminar+vascular+network.">Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network.</a> Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).</li></ol>

हम तीन रेटिना तैयार करने की तकनीक है कि microvascular रेटिना pericytes के अध्ययन में लागू किया जा सकता पेश करते हैं । नीचे, हम प्रत्येक विधि के बीच तुलना प्रदान करते हैं और प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों को हाइलाइट कर?...

रेटिना pericytes कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं का ध्यान केंद्रित कर रहे हैं के रूप में इन कोशिकाओं vasculature की अखंडता में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं. ऐसे मधुमेह रेटिनोपैथी1, ischemia2के रूप में रोग की स्थिति, और मोतियाबिंद3 संवहनी विशेषताओं है कि pericytes के समारोह में शामिल है । Pericytes भीतरी रेटिना केशिका जाल में पाए जाते हैं । केंद्रीय रेटिना धमनी कि केशिका जाल के दो परतों में भीतरी रेटिना शाखाओं की आपूर्ति. भीतरी संवहनी बिस्तर नाड़ीग्रंथि सेल और भीतरी परमाणु परतों के बीच स्थित है । गहरी परत और अधिक घने और जटिल है और भीतरी और बाहरी परमाणु परतों के बीच स्थानीयकृत है4,5। इसके अलावा, रेटिना के कुछ भागों में भी एक तिहाई नेटवर्क रेडियल parapapillary केशिकाओं का कार्यकाल शामिल है । ये लंबे, सीधे केशिकाओं कि तंत्रिका तंतुओं के बीच झूठ और शायद ही कभी एक दूसरे या अंय दो जाल6के साथ anastomose हैं । केशिका दीवार के भीतर, pericytes तहखाने झिल्ली में एंबेडेड और संवहनी endothelial कोशिकाओं के abluminal पक्ष लाइन कर रहे हैं ।
इस तिथि के लिए, इन pericytes के कोई अद्वितीय जैविक मार्कर है कि उंहें अंय संवहनी कोशिकाओं से अंतर कर सकते हैं । प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर β (PDGFRβ) और तंत्रिका/glial प्रतिजन 2 (NG2) आमतौर पर दोनों pericytes पर भी मौजूद है जो मार्करों इस्तेमाल कर रहे हैं, लेकिन अन्य संवहनी कोशिकाओं. pericytes की पहचान और pericyte उपसमुच्चय है कि आकृति विज्ञान और प्रोटीन अभिव्यक्ति7में भिंनता के अस्तित्व से आगे जटिल है । वर्तमान में, सबसे अच्छी पहचान प्रोटीन मार्करों और संवहनी दीवार में pericyte की विशेषता स्थिति का एक संयोजन पर निर्भर करता है । हम यहां immunohistochemical PDGFRβ के लिए तीन अलग ऊतक तैयार करने की तकनीक का प्रदर्शन/NG2 चूहा रेटिना microvascular pericytes, यानी, क्रायो-वर्गों, पूरे mounts के धुंधला, और संवहनी नेटवर्क के hypotonic अलगाव ।
क्रायो-वर्गों के साथ, रेटिना और श्वेतपटल ऑप्टिक तंत्रिका के माध्यम से काट रहे हैं । यह ंयूरॉंस के सभी स्तरित संरचनाओं के दृश्य के लिए अनुमति देता है । रेटिना की अलग दस परतों परमाणु और axonal/वृक्ष संरचनाओं कि hematoxylin/eosin या फ्लोरोसेंट परमाणु 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8के रूप में दाग के साथ कल्पना की जा सकती है कि बदलते के रूप में स्पष्ट कर रहे हैं । चयापचय आवश्यकताओं परतों9 के बीच अलग है और यह एक विशिष्ट परत की मोटाई या कुल अनुपस्थिति का निर्धारण करने के लिए एक विधि प्रदान करता है (उदाहरणके लिए, रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं का नुकसान रेटिना10ischemia की पहचान में से एक है, 11). vasculature रेटिना के माध्यम से अनुप्रस्थ कटौती के रूप में स्पष्ट है, यह अलग से संबंधित रेटिना परतों के भीतर केशिका जाल का अध्ययन करने के लिए संभव बनाने12,13.
अधिक परंपरागत रूप से, रेटिना vasculature नेटवर्क की जांच रेटिना पूरे माउंट में प्रदर्शन कर रहे हैं. इस ऊतक तैयारी के साथ, रेटिना कट और एक फूल के आकार का संरचना के रूप में समतल है । विधि एक अपेक्षाकृत तेजी से ऊतक तैयारी तकनीक है कि समग्र वास्तुकला रेटिना vasculature को उजागर कर सकते है और यह इसलिए अक्सर murine रेटिना में neovascularization की जांच में लागू किया जाता है । पूरे घुड़सवार रेटिना में microvasculature के सफल दृश्य भी विकासशील नवजात चूहे और चूहे रेटिना में सूचना दी है14,15,16,17,18, 19. ये अध्ययन नवजात रेटिना14की तुलना में वयस्क में बड़े केशिका-मुक्त क्षेत्रों के साथ एक अधिक परिभाषित pericytic गतिविधि प्रकट करते हैं ।
visualizing का एक और तरीका है hypotonic अलगाव के बाद रेटिना microvasculature है । यह ऊतक तैयारी तकनीक परिणाम में रेटिना रक्त वाहिकाओं और केशिकाओं न्यूरॉन्स कोशिकाओं से मुक्त किया जा रहा. अलग रेटिना संवहनी नेटवर्क के दो आयामी इमेजिंग के इस प्रकार आमतौर पर रेटिना trypsin पाचन20 के बाद किया जाता है और pericyte हानि और केशिका सहित मधुमेह रेटिनोपैथी के संवहनी विषमताओं का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया अध२०,२१,२२. hypotonic आइसोलेशन विधि रेटिना संवहनी जीन और प्रोटीन विनियामक प्रतिक्रियाओं की जांच प्रदान करता है के रूप में वे आरटी के साथ किया गया है-पीसीआर और पश्चिमी सोख्ता23,24,25। हम यहां के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान मुक्त फ्लोट immunohistochemical धुंधला hypotonic पृथक रेटिना vasculature के लिए एक विकल्प के रूप में trypsin पाचन microvascular pericytes की जांच करने के लिए ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Geletin from porcine skin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">G2625-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5253-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D5025-15KU</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:165px;">0332-100G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Normal donkey serum</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">017-000-121, lot 129348</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Rabbit anti-PDGFR&#946;</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:165px;">sc-432</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Mouse anti-NG2</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:165px;">ab50009</td>
			<td style="width:171px;">1:500</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-585-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-095-151</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-225-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-165-150</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D9542-1MG</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:165px;">154526</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes

रेटिना pericytes आंख के कई रोगों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । रेटिना वाहिकाओं और microvascular pericytes के Immunohistochemical धुंधला तकनीक नेत्र विज्ञान अनुसंधान के लिए केंद्रीय हैं । यह microvascular pericytes visualizing की एक उपयुक्त विधि का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है । हम रेटिना microvascular pericyte immunohistochemical क्रायो में दाग-वर्गों, पूरे-माउंट, और hypotonic अलग vasculature प्लेटलेट के लिए एंटीबॉडी का उपयोग कर वृद्धि कारक रिसेप्टर β (PDGFRβ) और तंत्रिका/glial प्रतिजन 2 (NG2) का वर्णन. यह हमें लाभ और रेटिना microvascular pericytes के दृश्य के लिए तीन ऊतक तैयार करने में से प्रत्येक की कमियों को उजागर करने की अनुमति देता है । क्रायो-वर्गों सभी रेटिना परतों के transsectional दृश्य प्रदान करते हैं, लेकिन केवल microvasculature के कुछ सामयिक अनुप्रस्थ कटौती होते हैं. पूरे-माउंट पूरे रेटिना vasculature का एक सिंहावलोकन प्रदान करता है, लेकिन microvasculature के दृश्य परेशानी हो सकती है । Hypotonic अलगाव ंयूरॉन कोशिकाओं को हटाने के द्वारा पूरे रेटिना vasculature कल्पना करने के लिए एक विधि प्रदान करता है, लेकिन यह बहुत नाजुक ऊतक बनाता है ।

सफल प्रोटोकॉल microvascular pericytes visualizing के लिए तीन अलग रेटिना तैयारियां प्रदान करते हैं । इन विधियों में से प्रत्येक PDGFRβ और NG2 immunoreactivity सह स्थानीयकरण और pericytes की अद्वितीय स्थिति है कि केशिका endothelium foridentification चारो?...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

हम चूहे रेटिना microvascular pericytes के immunohistochemical दृश्य के लिए तीन अलग ऊतक तैयार करने की तकनीक का प्रदर्शन, यानी, क्रायो-वर्गों, पूरे माउंट, और संवहनी नेटवर्क के hypotonic अलगाव.

रेटिना क्रायो-वर्गों, पूरे mounts, और Hypotonic Microvascular Pericytes के Immunohistochemical दृश्य के लिए अलग Vasculature तैयारी

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

इन तरीकों से नेत्र विज्ञान क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों जैसे पेरिसाइट प्रसार या माइग्रेशन में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद मिल सकती है । इन प्रक्रियाओं का मुख्य लाभ यह है कि वे विभिन्न प्रकार के दृश्य विकल्प प्रदान करते हैं। प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करिन Dreisig और फ्रैंक डब्ल्यू Blixt, दो के बाद हमारी प्रयोगशाला में डॉक्स होगा ।आंख को परमाणु बनाने के लिए, सबसे पहले चूहे की पलक में लगभग 0.5 सेंटीमीटर के पीछे और पूर्वकाल स्लिट बनाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें। संदंश के साथ आंख पकड़ो और आसपास के ऊतकों को बेनकाब करने के लिए ध्यान से पक्ष को झुकाव । कनेक्टिव और मांसपेशियों के ऊतकों में विच्छेदन कैंची के साथ कटौती करके आंख को न्यूलेट करें।संक्षेप में एक से दो मिनट के लिए 4% फॉर्मलडिहाइड और फॉस्फेट-बफर नमकीन में आंख रखें। स्केलपेल की नोक के साथ प्रकाश दबाव लागू करके कॉर्नियल लिम्बस में छेद करने से पहले सोडियम बफर में संक्षेप में कुल्ला करें। कॉर्निया और लेंस को संदंश के साथ हटाने के लिए विच्छेदन कैंची के साथ कॉर्नियल लिम्बस के साथ काटें।दो से चार घंटे के लिए पीबीएस में 4% फॉर्मलडिहाइड में रेटिना के साथ शेष ऊतक जलमग्न करें। क्रायो-सोरेनसन के फॉस्फेट बफर में विसर्जित करके ऊतक की रक्षा करें जिसमें 10% सुक्रोज और फिर 25% सुक्रोज होते हैं। टिश्यू को ट्रांसफर करने के बाद एक बार यह कंटेनर के नीचे तक डूब जाता है।याज़ुल्ला माध्यम में एम्बेड करें जो पोर्सिन त्वचा से 3% जिलेटिन और चिकन अंडे के सफेद से 30% एल्बुमिन के साथ तैयार किया जाता है। इसके बाद, ऑप्टिक तंत्रिका के माध्यम से जिलेटिन-एम्बेडेड रेटिना के 10-माइक्रोन ऊर्ध्वाधर क्रायोसेक्शन काटें। एक ग्लास स्लाइड पर क्रायोस्ेक्शन रखें और कम से कम एक घंटे तक सूखने दें।एक बार सूखने के बाद, 15 मिनट के लिए 0.25% ट्राइटन-एक्स 100 के साथ पीबीएस में स्लाइड को जलमग्न करें। फिर, पीबीएसटी में 1:100 पीडीजीएफ रिसेप्टर बीटा और 1:500 एनजी 2 प्राथमिक एंटीबॉडी और क्रायोसेक्शन पर 1% बीएसए का मिश्रण ड्रिप करें और रात चार डिग्री सेल्सियस पर एक नम कक्ष में रखें। अगले दिन, हर बार 15 मिनट के लिए दो बार पीबीएसटी में स्लाइड विसर्जित करके खंडों को धोएं।फिर 1:100 एंटी-माउस एलेक्सा फ्लोर 594-लिंक्ड और 1:100 एंटी-रैबिट फिटसी से जुड़े माध्यमिक एंटीबॉडी का मिश्रण ड्रिप करें, जो पीबीएसटी में 3% बीएसए के साथ क्रायोस्क्यूज पर पतला होता है और अंधेरे में एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करता है। इनक्यूबेशन के बाद, हर बार 15 मिनट के लिए दो बार पीबीटीएसटी में ग्लास स्लाइड कुल्ला करें। डैपी और एक कवरस्लिप युक्त एंटी-लुप्त होती बढ़ते माध्यम के साथ दाग वाले क्रायोसेक्शन माउंट करें।एक दूसरी रेटिना ऊतक तैयारी तकनीक पूरे माउंट है। कॉर्निया को हटाने के बाद, रेटिना वर्णक एपिथेलियम से ऑप्टिक तंत्रिका की ओर रेटिना को अलग करने के लिए संदंश के छोटे उद्घाटन आंदोलनों का उपयोग करें। विच्छेदन कैंची के साथ ऑप्टिक तंत्रिका पर रेटिना मुक्त करें और रेटिना परिधि से ऑप्टिक तंत्रिका सिर की ओर कुछ मिलीमीटर की लंबाई के तीन से चार स्लिट बनाएं।रेटिना को एक ग्लास स्लाइड पर फैलाएं और पांच से 10 मिनट तक सूखने दें। रेटिना पर 4% फॉर्मलडिहाइड ड्रिप करें और 20 से 30 मिनट के लिए ठीक करें। निर्धारण के बाद, पीबीएस के साथ कुल्ला।इष्टतम परिणामों के लिए, रिंसिंग के बाद सीधे इम्यूनोदाता। सबसे पहले, पूरे माउंट पर ड्रिप पीबीएएसटी और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। पीबीएसटी से डालो, फिर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर एक नम कक्ष में इनक्यूबेट करें।अगले दिन, हर बार 15 मिनट के लिए रेटिना को दो बार कुल्ला करने के लिए पीबीएएसटी पर प्राथमिक एंटीबॉडी और ड्रिप डालें। दूसरी धोने को डालने के बाद, रेटिना पर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान ड्रिप करें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर एक नम कक्ष में एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद, पहले की तरह पीबीएएसटी के साथ दो बार धोएं।दापी और एक कवर स्लिप युक्त एंटी-लुप्त होती बढ़ते माध्यम के साथ दाग पूरे माउंट माउंट। पूरे बढ़ते रेटिना के लिए विकल्प, रेटिना वाक्यूलेचर हाइपोटोनिक अलगाव से अलग किया जा सकता है। सबसे पहले, रेटिना को 24-अच्छी तरह से प्लेट में डिओनाइज्ड पानी के एक मिलीलीटर में रखें और कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए 1.5 मिलीमीटर कंपन कक्षा के साथ 200 आरपीएम पर हिलाएं, फिर रेटिना वैक्यूलेचर से lysed सेल मलबे को अलग करने के लिए DNAse 1 की 200 इकाइयों को जोड़ें और कमरे के तापमान पर एक और 30 मिनट के लिए हिलाएं।न्यूरोनल सेल मलबे को हटाने के लिए 150 से 300 आरपीएम पर मिलाते हुए पांच मिनट के लिए तीन बार के लिए डिओनाइज्ड पानी में रेटिना कुल्ला। रेटिना प्रत्येक कुल्ला के साथ और अधिक पारदर्शी हो जाना चाहिए, न्यूरोनल सेलुलर मलबे को हटाने का संकेत है। कुल्ला करने के बाद, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड और पीबीएस के एक मिलीलीटर में रेटिना को ठीक करें।पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला। इम्यूनोस्टेपिंग के लिए आगे बढ़ने, 10% गधा सीरम के ५०० माइक्रोलीटर के साथ हाइपोटोनिक-अलग वाक्यूलेचर ब्लॉक १०० आरपीएम पर मिलाते हुए एक घंटे के लिए PBS में पतला । अवरुद्ध करने के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 600 माइक्रोलीटर में रात भर रेटिना को इनक्यूबेट करें जिसमें 1:100 पीडीजीएफ-रिसेप्टर बीटा और 1:500 एनजी2 प्राथमिक एंटीबॉडी 10% गधे सीरम और पीबीएस में पतला होते हैं।अगले दिन, रेटिना नेटवर्क पीबीएस में तीन बार पांच मिनट के लिए हर बार कुल्ला, तो 1:100 एंटी माउस Alexa फ्लोर 594-लिंक्ड और 1:100 विरोधी खरगोश FITC से जुड़े माध्यमिक एंटीबॉडी में इनक्यूबेट, 10% गधा सीरम और PBS में पतला अंधेरे में एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मिलाते हुए के साथ । पीबीएसटी में पांच मिनट के वॉश के बाद 0.2 नैनोग्राम-प्रति-मिलीलीटर डीएपीआई और पीबीएसटी में 15 मिनट तक इनक्यूबेट करें। प्रकाश से सुरक्षित रहते हुए पीबीएएसटी के साथ पांच मिनट के लिए तीन बार धोएं।इसके बाद, प्लास्टिक पाश्चर पिपेट की नोक काटें। एक पिपेट टिप का उपयोग करके तेज किनारों को हटा दें, और पीबीएसटी के साथ पाश्चर पिपेट को गीला करें, फिर रेटिना वेक्यूलेचर को पिपेट में जाता है और चार-अच्छी ग्लास ग्लास स्मसेम में वितरित करता है। पाश्चर पिपेट के अंदर से चिपके रेटिना वेक्यूलेचर से बचने के लिए गीला कदम महत्वपूर्ण है।कक्ष स्लाइड को आगे-पीछे झुकाकर रेटिना वैक्यूलेचर की स्थिति रखें। चेंबर स्लाइड के कुओं से माध्यम निकालें। तरल की सतह तनाव स्लाइड के नीचे पर वाक्यूलेचर को समतल कर देगा।यदि आवश्यक हो, तो रेटिना वैक्यूलेचर पर तरल की ड्रिप बूंदें प्रकट करने के लिए। चैंबर स्लाइड से प्लास्टिक के कुओं को हटाने से पहले एक माइक्रोस्कोप के नीचे सही खुलासा सुनिश्चित करें । एंटी-लुप्त होती बढ़ते मध्यम और एक कवर स्लिप के साथ दाग वाले वाक्यूलेचर को माउंट करें।NG2 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री रेटिना के भीतरी हिस्से के भीतरी हिस्से के भीतर सकारात्मक जहाजों का पता चलता है। तीर जहाजों में गोलाकार और घोड़े की नाल के आकार की इम्यूनोएक्टिविटी का संकेत देते हैं। तीर सिर एक देशांतर-कट पोत बताते हैं ।पीडीजीएफ-रिसेप्टर बीटा इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एनजी 2 के समान इम्यूनोरेएक्टिविटी दिखाता है। फिर से तीर और तीर सिर जहाजों में इम्यूनोएक्टिविटी का संकेत देते हैं। यह छवि हरे रंग में NG2 का विलय, लाल रंग में पीडीजीएफ-रिसेप्टर बीटा और नीले रंग में DAPI दिखाती है।तीन अलग-अलग फिल्टरों को सुपरइम्पोज करके, यह पता चला है कि एनजी 2 और पीडीजीएफ-रिसेप्टर बीटा सह-स्थानीयकृत हैं। इस छवि को लाल रंग में NG2 धुंधला के साथ एक इम्यूनो दाग पूरे माउंट तैयारी से पता चलता है । इम्यूनोरेएक्टिविटी सतही संवहनी नेटवर्क के साथ दिखाई देती है जिसमें एब्ल्यूमिनल पेरिसाइट्स में तीव्र धुंधला होता है।न्यूरोनल कोशिकाएं एनजी 2-दाग माइक्रोवासकुलेचर के बीच DAPI नीले नाभिक के रूप में दिखाई देती हैं। इस छवि को हरी और PDGF-रिसेप्टर बीटा में लाल रंग में NG2 के साथ दाग हाइपोटोनिक अलग चूहा रेटिना संवहनी नेटवर्क से पता चलता है । पूरे नेटवर्क ने NG2-इम्यूनोरेएक्टिविटी दिखाई ।सेल सोमास में पीडीजीएफ-रिसेप्टर बीटा इम्यूनोरेएक्टिविटी पाई गई। उच्च आवर्धन पर, यह स्पष्ट है कि पीडीजीएफ-रिसेप्टर बीटा धुंधला केवल संवहनी नेटवर्क में सेल सोमास में देखा जाता है, जो पेरिसाइट इम्यूनोरेएक्टिविटी का संकेत देता है। NG2 और PDGF-रिसेप्टर बीटा के साथ एक साथ DAPI धुंधला सहित इस उच्च आवर्धन छवि में दो अपरिभाषित पोत दीवार कोशिकाओं में तीन pericytes से पता चलता है ।इन प्रक्रियाओं का पालन करते हुए, अतिरिक्त प्रश्नों का उत्तर देने के लिए चिकनी मांसपेशी कोशिका या एंडोथेलियल स्टेनिंग जैसे अन्य इम्यूनोस्टेटिंग का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, रेटिना वैक्यूलेचर में कोशिकाएं इस्केमिया का पालन कैसे करती हैं?

Research

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Biology

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