Name: retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

デンマーク ルンドベック財団によって資金が供給された研究。

プロトコルは、最適化され、男性大人の白子のラットで示されます。すべての実験手順で動物は ARVO ステートメントで眼科と視覚に関する研究における動物の使用のための規則に従って扱われました。動物を二酸化炭素とそれに続く頚部転位によって安楽死させ。
1. ラット網膜のティッシュの準備
<ol><li>
低温セクション
	<ol>
<li>メスのラットの眼瞼の後部?...

<ol>
	<li>Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+Breaking+the+barrier.">Diabetic retinopathy: Breaking the barrier.</a> Pathophysiology. , (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+Brain+Injury+and+Repair+After+Ischemic+Stroke.">Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke.</a> Translational Stroke Research. , (2016).</li><li>Trost, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+and+Retinal+Pericytes:+Origin,+Function+and+Role.">Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).</li><li>Ramos, D., Lagali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Confocal+Laser+Microscopy+to+Analyze+Mouse+Retinal+Blood+Vessels.">The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels.</a> Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).</li><li>Moran, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+cross+talk+in+diabetic+retinopathy:+Pathophysiological+roles+and+therapeutic+implications.">Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).</li><li>Henkind, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+the+peripapillary+retina.">Microcirculation of the peripapillary retina.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte?.">What is a pericyte?.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36, 451-455 (2016).</li><li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+Characterization+of+Retina+Neuroglia+Modifications+in+Diabetic+Zucker+Diabetic+Fatty+Rats.">Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).</li><li>Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characteristics+of+the+retinal+and+choroidal+vasculature.">Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).</li><li>Allen, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity+of+middle+cerebral+artery+occlusion+determines+retinal+deficits+in+rats.">Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats.</a> Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).</li><li>Kyhn, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+retinal+ischemia+caused+by+controlled+low+ocular+perfusion+pressure+in+a+porcine+model.+Electrophysiological+and+histological+characterisation.">Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation.</a> Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).</li><li>Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+CGRP+and+its+receptor+components+CLR+and+RAMP1+in+the+rat+retina.">Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina.</a> Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).</li><li>Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renin-angiotensin+system+and+the+developing+retinal+vasculature.">The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).</li><li>Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+and+characterization+of+putative+mesenchymal+stem+cell+markers+in+the+retinal+capillary+network+of+rodents.">Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents.</a> Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).</li><li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier.">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nature Communications. 8, 15296 (2017).</li><li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo.">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).</li><li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+injection+of+the+heparin+analog+5-amino-2-naphthalenesulfonate+reduces+retinal+neovascularization+in+mice.">Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice.</a> Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).</li><li>Higgins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diltiazem+reduces+retinal+neovascularization+in+a+mouse+model+of+oxygen+induced+retinopathy.">Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy.</a> Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).</li><li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model.">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).</li><li>Hazra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+X+receptor+modulates+diabetic+retinopathy+outcome+in+a+mouse+model+of+streptozotocin-induced+diabetes.">Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes.</a> Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).</li><li>Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antioxidant+gene+therapy+on+the+development+of+diabetic+retinopathy+and+the+metabolic+memory+phenomenon.">Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+degradation+of+VE-cadherin+alters+the+blood-retinal+barrier+in+diabetes.">Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes.</a> Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).</li><li>Gustavsson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+cellular+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+expression+in+mice+retinal+vessels+is+affected+by+both+hyperglycemia+and+hyperlipidemia.">Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia.</a> PLoS One. 5, e12699 (2010).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+retinal+trilaminar+vascular+network.">Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network.</a> Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).</li></ol>

微小血管網膜血管の研究に適用できる 3 つの網膜の調製技術を提案します。以下、それぞれの方法を比較し、プロトコルで重要な手順を強調表示。
網膜は矢状セクションのカットを用いて、電子顕微鏡で、したがって、同じ網膜から多数の標本を得ることが可能です。このメソッドから生じる数字のセクションでは、抗体の特異性と滴定試験動物の不必要な犠牲を防ぐ?...

網膜の血管は、これらの細胞は、血管系の整合性に大きな役割を果たす多くの研究所の焦点です。糖尿病網膜症1、虚血2緑内障3など病態ペリサイトの関数を含む血管の特徴であります。ペリサイトは内側の網膜毛細血管叢で発見されます。毛細血管叢の 2 つの層に内部の網膜を供給する網膜中心動脈の枝.内側の血管床が神経節細胞と内部の核層の間に位置しています。深い層はより濃厚で複雑と内側と外側核層4,5間ローカライズされます。さらに、網膜の一部には、放射状の脈絡毛細血管と呼ばれる 3 番目のネットワークも含まれています。これらの長い、そして稀に神経線維間でうそをつくストレート毛細血管が別の 1 つまたは他の 2 つの叢6と吻合します。毛細血管の壁内ペリサイトは基底膜に埋め込まれているし、血管内皮細胞の abluminal 側のラインします。
これまで、他の血管の細胞と区別することができますこれらのペリサイトのユニークな生物学的マーカーはありません。血小板由来増殖因子受容体 β (PDGFRβ) 神経・ グリア抗原 2 (NG2) は、また他の血管細胞ですが血管に存在する一般的に使用されるマーカー。ペリサイトの同定は、形態および蛋白質の表現7で異なる周皮細胞サブセットの存在によってさらに複雑です。現在、最高の識別は、蛋白質のマーカーの組み合わせと血管壁の周皮細胞の特徴的な位置に依存します。免疫 PDGFRβ/NG2 ラット網膜血管ペリサイト、すなわち、低温セクション、全体-マウント、および血管ネットワークの低張性分離の汚損のための 3 つの異なる組織準備テクニックをここで紹介します。
低温セクション、網膜と強膜は視神経を通ってカットされます。ニューロンのすべて層状構造の可視化が可能になります。網膜の異なる 10 層ヘマトキシリン ・ エオシンや蛍光核 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8などの汚れを視覚化できる核や軸索・樹状突起の構造を交換として明らかにされます。層9と代謝の要件とは異なる特定の層の厚さまたは合計の不在を決定するメソッドを提供します (例えば、網膜神経節細胞の損失は網膜虚血10、認刻極印の 1 つ 11)。横を通り過ぎるそれぞれ網膜層12,13内毛細血管叢を個別に研究することが可能となって、網膜血管は明らか。
従来より、網膜血管ネットワークの調査は、網膜全体のマウントで実行されます。このティッシュの準備と網膜はカットして花状の構造として平ら。メソッドは、全体的なアーキテクチャの網膜血管を強調表示することができます比較的高速な組織の準備法としたがってしばしばマウス網膜血管新生の調査で適用。全体に取り付けられた網膜の血管の正常な可視化は発展途上の新生児マウスとラット網膜14,15,16,17,18,で報告も19. これらの研究は新生児網膜14に比べて大人に大きいキャピラリー自由な区域でより多くの定義 pericytic 活動を明らかにします。
可視化する別の方法は、低張性分離後網膜血管です。この組織作製手法で網膜血管と神経細胞の解放されて毛細血管。孤立した網膜血管ネットワークの二次元画像のこのタイプは通常網膜のトリプシン消化20後に実行、糖尿病性網膜症の周皮細胞の損失、毛細血管などの血管異常を評価するために使用変性20,21,22。低張性分離法は、彼らは、RT-PCR および西部のしみが付く23,24,25で行われている網膜血管遺伝子やタンパク質規制対応の調査を提供しています。我々 はここで微小血管を調べるトリプシンの消化力の代替として低張性孤立した網膜血管系の浮動免疫組織化学染色プロトコルを提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Geletin from porcine skin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">G2625-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5253-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D5025-15KU</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:165px;">0332-100G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Normal donkey serum</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">017-000-121, lot 129348</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Rabbit anti-PDGFR&#946;</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:165px;">sc-432</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Mouse anti-NG2</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:165px;">ab50009</td>
			<td style="width:171px;">1:500</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-585-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-095-151</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-225-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-165-150</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D9542-1MG</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:165px;">154526</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes

網膜血管は目の多くの疾患で重要な役割を果たします。免疫組織化学的染色技術網膜血管と血管ペリサイト眼科研究の中心であります。微小血管を可視化する適切な方法を選ぶことが大切です。網膜血管周皮細胞免疫組織化学的染色クライオ セクション、全体-マウント、および血小板由来増殖因子受容体 β (PDGFRβ) と 2 (NG2) 神経・ グリア抗原抗体を用いた分離の低張性の血管について述べる。これは利点と網膜の微小血管の可視化の 3 つのティッシュの準備のそれぞれの欠点を強調する私たちことができます。低温セクションすべての網膜の層の transsectional 可視化がだけいくつか時折横のカット、血管を含みます。全体マウント全体の網膜血管の概要を説明しますが、血管の可視化は面倒なことができます。低張性の分離は、神経細胞の除去による全体の網膜血管を可視化するメソッドを提供しますが、これは非常に壊れやすい組織になります。

成功したプロトコルは、微小血管を可視化する 3 つの異なる網膜準備を提供します。これらの各メソッドは、PDGFRβ と NG2 陽性の共局在と血管内皮の区分の周りを包むペリサイトの固有の位置を使用します。
低温セクション、DAPI ラベル核と内側の蛍光の密度によって神経細胞の層を識別できるし、深い毛細血管叢が含ま?...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

ラット網膜血管ペリサイト、すなわち、低温セクション、全体-マウント、および血管ネットワークの低張性分離の免疫組織化学的可視化のための 3 つの異なったティッシュ準備テクニックを紹介します。

網膜の低温電子顕微鏡セクション全体-マウント、および微小血管の免疫組織化学的可視化の低張性分離血管準備

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

これらの方法は、眼科の分野での、例:ペリサイトの増殖や移動などの重要な質問に答える助けとなる。これらの手順の主な利点は、さまざまな視覚化オプションを提供することです。手順を実証するのは、カリン・ドレイシグとフランク・W・ブリクスト、私たちの研究室での2つのポストドキュメントです。眼を引き起こすには、まずメスを使ってラットのまぶたに約0.5センチメートルの後部および前部スリットを作ります。鉗子で目をつかみ、周囲の組織を露出させるために慎重に側面に傾けます。結合組織と筋肉組織の解剖ハサミで切り傷を作ることによって目を引き起こす。目を4%ホルムアルデヒドとリン酸緩衝生理食塩分に1~2分間短時間入れます。メスの先端に軽い圧力をかけることで角膜の手足に穴を開ける前に、ナトリウムバッファーで短時間すすぐるみます。角膜の手足を解剖用はさみで切り、角膜とレンズを鉗子で取り除きます。残りの組織を4%ホルムアルデヒドで2〜4時間PBSに残りの組織を浸す。クライオは、10%スクロースを含むソレンソンのリン酸緩衝液に浸漬し、その後25%スクロースを浸すことによって組織を保護する。容器の底に沈んだ組織を移す。豚皮から3%ゼラチン、鶏卵白から30%アルブミンを調製したヤズラ培地に埋め込みます。次に、ゼラチン埋め込み型レチナの垂直凍結分を視神経に切断する。ガラススライドの上に凍結セクションを置き、最低1時間乾燥させます。乾いたら、スライドを0.25%Triton-X 100で15分間浸します。次に、PBSTの1:100 PDGF受容体ベータと1:500 NG2一次抗体と1%BSAの混合物を凍結切除部に滴下し、一晩摂氏4度で湿ったチャンバーに入れます。翌日、スライドをPBSTに2回15分間浸漬して切片を洗浄する。その後、1:100抗マウスアレクサFluor 594リンクと1:100の抗ウサギFITCリンク二次抗体の混合物をPBSTで希釈し、3%BSAを凍結セクションに滴下し、暗闇の中で1時間インキュベートします。インキュベーション後、PBSTでガラススライドを15分間2回すすいでください。DAPIとカバースリップを含むアンチフェージングマウントメディアで染色されたクライオセクションをマウントします。第2のレチン組織調製技術は、全マウントである。角膜の除去に続いて、鉗子の小さな開口部の動きを使用して網膜を網膜色素上皮から視神経に向かって分離する。解剖はさみで視神経のレチナを解放し、視神経の頭部に向かって数ミリメートルの長さの3〜4つのスリットを作る。ガラススライドにレティナを広げ、5〜10分間乾燥させます。4%ホルムアルデヒドをレティナにドリップし、20〜30分間固定します。固定後、PBSでリンスします。最適な結果を得るには、リンス直後に免疫染色剤を使用してください。まず、PBSTを全マウントに滴下し、室温で15分間インキュベートします。PBSTを注ぎ、一次抗体溶液を加え、一晩摂氏4度の湿ったチャンバーにインキュベートします。翌日、一次抗体を注ぎ、PBSTに滴下し、毎回15分間2回レチナをすすいだ。2回目の洗浄を流した後、二次抗体溶液をレティナに滴下し、暗闇の中で室温で湿ったチャンバーに1時間インキュベートします。二次抗体インキュベーションに続き、PBSTで以前のように2回洗浄する。DAPIとカバースリップを含むアンチフェージングマウントメディアで染色された全マウントをマウントします。全型のレチナを取り付ける代わりに、低調性分離によって血管系の残性を分離することができる。まず、24ウェルプレートに1ミリリットルの脱イオン水にレチナを入れ、室温で1.5ミリメートルの振動軌道で200rpmで振り、次に200単位のDNAse 1を加えて、レチナル血管構造からリセド細胞の破片を解離し、室温でさらに30分間振ります。150~300rpmで揺れ、それぞれ5分間、脱イオン水でレチナを3回リンスし、神経細胞の破片を取り除きます。レチナは、神経細胞の破片の除去を示す、各すすいで、より透明になるはずです。洗い込んだ後、4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルにレチナを固定し、室温で10分間PBSを行います。PBSで3回リンスします。免疫染色に進む場合は、100rpmで振盪してPBSで1時間希釈した10%ロバ血清の500マイクロリットルで低張性単離血管系をブロックします。ブロッキング後、1:100 PDGF受容体ベータおよび10%ロバ血清およびPBSで希釈された1:500 NG2一次抗体からなる一次抗体溶液の600マイクロリットルで一晩レティナをインキュベートする。翌日、PBSでレチナルネットワークを毎回5分間3回洗い流し、1:100抗マウスアレクサフルオール594thリンクと1:100抗ウサギFITCリンク二次抗体でインキュベートし、10%ロバ血清とPBSで10%のロバ血清とPBSで希釈し、室温で100rpmで暗中に100rpmで揺れます。PBSTで5分間の洗浄に続き、0.2ナノグラム/ミリリットルDAPIとPBSTで15分間インキュベートします。光から保護しながらPBSTで5分間3回洗浄します。次に、プラスチック製のパスツールピペットの先端を切ります。ピペットチップを使用して鋭いエッジを取り除き、PBSTでパスツールピペットを湿らせ、その後、ピペットにレチナル血管系を吸引し、4ウェルガラスチャンバースライドに分配します。湿潤ステップは、パスツールピペットの内側に付着する眼管炎を避けるために重要です。チャンバースライドを前後に傾けることで、レティナル血管構造を配置します。チャンバースライドの井戸から培地を取り外します。液体の表面張力は、スライドの底に脈管を平らにします。必要に応じて、液体の滴を眼管の血管系に滴下して展開する。チャンバースライドからプラスチック井戸を取り外す前に、顕微鏡下で正しく展開することを確認してください。アンチフェージング実装媒体とカバースリップで染色された血管系を取り付けます。NG2免疫検査は、内の正の血管を明らかにする。矢印は、血管内の円形および馬蹄形の免疫反応性を示す。矢印は縦方向に切断された容器を指しています。PDGF受容体ベータ免疫体化学はNG2と同様の免疫反応性を示す。再び矢印と矢頭は血管内の免疫反応性を示す。この画像は、緑色のNG2、赤のPDGF受容体ベータ、および青色のDAPIの結合を示しています。3つの異なるフィルタを重ね合わせることにより、NG2とPDGF受容体ベータが共局化することが明らかになっている。この画像は、NG2染色を赤色で行った免疫染色型全実装製剤を示す。免疫反応性は、アブルミナルペリサイトで強烈な染色を伴う表面血管ネットワークに沿って見える。ニューロン細胞は、NG2染色された微小血管間のDAPI青色核として可視である。この画像は、緑色でNG2とPDGF受容体βで赤色で染色された低張性単離されたラットのレチナル血管ネットワークを示す。完全なネットワークはNG2免疫反応性を示した。PDGF受容体ベータ免疫反応性は細胞ソマで発見された。より高い倍率では、PDGF受容体ベータ染色が血管ネットワーク内の細胞ソマにのみ見られることは明らかであり、ペリサイト免疫反応性を示す。NG2およびPDGF受容体ベータと共にDAPI染色を含むこの高倍率画像における2つの未定義の血管壁細胞における3つのペリサイトを明らかにする。これらの手順に従って、平滑筋細胞または内皮染色のような他の免疫染色は、追加の質問に答えるために使用することができる。例えば、家管系の細胞は虚血に続いてどのように見えるのでしょうか?

Research

JoVE Journal

Biology

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

免疫組織化学のためのスライス標本の薄いセクショニング

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

体外で分離された神経細胞を操作するためのレーザーピンセットを使用して

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

胚肢の皮膚の血管系のためのホールマウント免疫組織化学的解析：胚における血管分岐形態形成を研究するモデルシステム

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

解離調製物から胚および幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋線維の分析

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;精巣

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

運動の時空間マッピングで<em&gt;エクスビボ</em腸の&gt;準備

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

免疫組織化学および免疫蛍光分析のための腸組織の調製のための改良されたスイス・ローリングテクニック

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

孤立した塊茎プロトプ ラストのフローサイトメトリーによる表現を測定

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

眼小血管血管新生のエキビボロイド発芽アッセイ

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...