Name: retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

Forskningen ble finansiert av The Lundbeck Foundation, Danmark.

Protokollen var optimalisert og demonstrert på voksne mannlige albino rotter. I alle eksperimentelle prosedyrer, ble dyrene behandlet i henhold til regelverket i ARVO erklæringen for bruk av dyr i Ophthalmic og visjon forskning. Dyrene var euthanized av karbondioksid og påfølgende cervical forvridning.
1. rotte netthinnen vev forberedelser
<ol><li>
Cryo-delen
	<ol>
<li>Gjøre bakre og fremre ~0.5 cm åpninger for i rotte øyelokket med skalpell.<ol>
<li>Valgfritt: Bruker...

<ol>
	<li>Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+Breaking+the+barrier.">Diabetic retinopathy: Breaking the barrier.</a> Pathophysiology. , (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+Brain+Injury+and+Repair+After+Ischemic+Stroke.">Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke.</a> Translational Stroke Research. , (2016).</li><li>Trost, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+and+Retinal+Pericytes:+Origin,+Function+and+Role.">Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).</li><li>Ramos, D., Lagali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Confocal+Laser+Microscopy+to+Analyze+Mouse+Retinal+Blood+Vessels.">The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels.</a> Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).</li><li>Moran, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+cross+talk+in+diabetic+retinopathy:+Pathophysiological+roles+and+therapeutic+implications.">Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).</li><li>Henkind, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+the+peripapillary+retina.">Microcirculation of the peripapillary retina.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte?.">What is a pericyte?.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36, 451-455 (2016).</li><li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+Characterization+of+Retina+Neuroglia+Modifications+in+Diabetic+Zucker+Diabetic+Fatty+Rats.">Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).</li><li>Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characteristics+of+the+retinal+and+choroidal+vasculature.">Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).</li><li>Allen, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity+of+middle+cerebral+artery+occlusion+determines+retinal+deficits+in+rats.">Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats.</a> Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).</li><li>Kyhn, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+retinal+ischemia+caused+by+controlled+low+ocular+perfusion+pressure+in+a+porcine+model.+Electrophysiological+and+histological+characterisation.">Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation.</a> Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).</li><li>Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+CGRP+and+its+receptor+components+CLR+and+RAMP1+in+the+rat+retina.">Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina.</a> Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).</li><li>Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renin-angiotensin+system+and+the+developing+retinal+vasculature.">The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).</li><li>Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+and+characterization+of+putative+mesenchymal+stem+cell+markers+in+the+retinal+capillary+network+of+rodents.">Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents.</a> Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).</li><li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier.">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nature Communications. 8, 15296 (2017).</li><li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo.">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).</li><li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+injection+of+the+heparin+analog+5-amino-2-naphthalenesulfonate+reduces+retinal+neovascularization+in+mice.">Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice.</a> Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).</li><li>Higgins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diltiazem+reduces+retinal+neovascularization+in+a+mouse+model+of+oxygen+induced+retinopathy.">Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy.</a> Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).</li><li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model.">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).</li><li>Hazra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+X+receptor+modulates+diabetic+retinopathy+outcome+in+a+mouse+model+of+streptozotocin-induced+diabetes.">Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes.</a> Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).</li><li>Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antioxidant+gene+therapy+on+the+development+of+diabetic+retinopathy+and+the+metabolic+memory+phenomenon.">Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+degradation+of+VE-cadherin+alters+the+blood-retinal+barrier+in+diabetes.">Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes.</a> Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).</li><li>Gustavsson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+cellular+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+expression+in+mice+retinal+vessels+is+affected+by+both+hyperglycemia+and+hyperlipidemia.">Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia.</a> PLoS One. 5, e12699 (2010).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+retinal+trilaminar+vascular+network.">Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network.</a> Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).</li></ol>

Vi presenterer tre retinal forberedelser teknikker som kan brukes i studiet av mikrovaskulær retinal pericytes. Nedenfor vi tilbyr en sammenligning mellom hver av metodene og markere avgjørende skritt i protokoller.
Med cryo-snitting netthinnen er kuttet i sagittal deler og derfor er det mulig å få mange eksemplarer fra samme netthinnen. Numeriske delene som følge av denne metoden gjør det et ideelt valg for antistoff spesifisitet og titrering testing som det forhindrer unødvendige dyr ...

Netthinnen pericytes er fokus for mange forskningslaboratorier som disse cellene spille en viktig rolle i integritet er blodkar. Patologiske tilstander som diabetisk retinopati1, iskemi2og glaukom3 har vaskulære egenskaper som involverer funksjonen til pericytes. Pericytes finnes i de indre retinal kapillært plexuses. Den sentral retinal arterien som leverer indre netthinnen hopper inn i to lag av kapillær plexuses. Indre vaskulær sengen ligger mellom ganglion celle- og indre kjernefysiske lag. De dypere lag er mer tett og komplekse og er lokalisert mellom indre og ytre kjernefysiske lag4,5. I tillegg inneholde deler av netthinnen også en tredje nettverk kalt radial parapapillary kapillærene. Disse er lange, rette kapillærene som ligger blant nervefibrene og sjelden anastomose med hverandre eller andre to plexuses6. I kapillær veggen, pericytes er innebygd i kjelleren membranen og linje abluminal siden av vaskulær endotelceller.
Til denne datoen er det ingen unik biologiske markør for disse pericytes som kan skille dem fra andre vaskulære celler. Blodplater-avledet vekst faktor reseptor β (PDGFRβ) og nerve/glial antigen 2 (NG2) er vanlige markører som begge presenterer på pericytes men også andre vaskulære celler. Identifikasjon av pericytes kompliseres ytterligere av eksistensen av pericyte delsett som varierer i morfologi og protein uttrykk7. Foreløpig bruker best identifikasjon en kombinasjon av protein markører og karakteristiske plasseringen av pericyte i vaskulære veggen. Her viser vi tre ulike vev forberedelser teknikker for immunohistochemical PDGFRβ/NG2 farging av rotte retinal mikrovaskulær pericytes, dvs., cryo-partiene, hele-montere og hypotonisk isolasjon av vaskulære nettverket.
I cryo-deler skjære netthinnen og sclera gjennom den optiske nerven. Dette gir visualisering av alle lag strukturer av neurons. De forskjellige ti lag av netthinnen er som interchanging kjernefysiske og axonal/dendrittiske strukturer som kan visualiseres med flekker som hematoxylin/eosin eller fluorescerende kjernefysiske 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. Metabolsk kravene varierer mellom lag9 , og det gir en metode for å fastslå tykkelse eller totalt fravær av et bestemt lag (f.ekstap av netthinnen ganglieceller er ett av kjennetegnene på netthinnen iskemi10, 11). Er blodkar er tydelig som tverrgående skjærer gjennom netthinnen, som gjør det mulig å studere separat kapillært plexuses i de respektive retinal lag12,13.
Mer tradisjonelt utføres undersøkelser av netthinnen blodkar nettverk retinal hele-monteringer. Med dette vev preparatet, er netthinnen kuttet og flat som en blomst-formet struktur. Metoden er en relativt rask vev forberedelse teknikk som kan fremheve den generelle arkitekturen retinal blodkar og det er derfor ofte brukt i etterforskningen av neovascularization i murine netthinnen. Vellykket visualisering av microvasculature i hele montert Netthinne rapporteres også i utviklingsland neonatal musen og rotten netthinnen14,15,16,17,18, 19. disse studiene avsløre en mer definert pericytic aktivitet med større kapillær-fri områder i voksen sammenlignet med den nyfødte Netthinne14.
En annen måte å visualisere er netthinnen microvasculature etter hypotonisk isolasjon. Denne vev forberedelse teknikken resulterer i netthinnen blodårer og blodkar frigjort neuronal cellene. Denne typen todimensjonal avbilding av isolerte retinal vaskulære nettverket er vanligvis utført etter retinal trypsin fordøyelsen20 og brukes til å vurdere den vaskulære unormalt diabetisk retinopati inkludert pericyte tap og kapillær degenerasjon20,21,22. Metoden hypotonisk isolasjon tilbyr undersøkelser av netthinnen vaskulær genet og protein regulatoriske svar som de har blitt gjort med RT PCR og vestlige blotting23,24,25. Vi gir her en protokoll for fri-flyt immunohistochemical farging av er hypotonisk isolert retinal blodkar som et alternativ til trypsin fordøyelsen undersøke mikrovaskulær pericytes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Geletin from porcine skin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">G2625-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5253-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D5025-15KU</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:165px;">0332-100G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Normal donkey serum</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">017-000-121, lot 129348</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Rabbit anti-PDGFR&#946;</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:165px;">sc-432</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Mouse anti-NG2</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:165px;">ab50009</td>
			<td style="width:171px;">1:500</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-585-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-095-151</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-225-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-165-150</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D9542-1MG</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:165px;">154526</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes

Netthinnen pericytes spiller en viktig rolle i mange sykdommer i øyet. Immunohistochemical flekker teknikker av netthinnen fartøy og mikrovaskulær er pericytes sentrale i ophthalmological forskning. Det er viktig å velge en passende metode for å visualisere mikrovaskulær pericytes. Vi beskriver retinal mikrovaskulær pericyte immunohistochemical farging i cryo-inndelinger, hele-montere og hypotonisk isolert blodkar bruker antistoffer for blodplater-avledet vekst faktor reseptor β (PDGFRβ) og nerve/glial antigen 2 (NG2). Dette tillater oss å markere fordeler og svakheter av hver av de tre vev forberedelsene for visualisering av netthinnen mikrovaskulær pericytes. Cryo-deler gir transsectional visualisering av alle retinal lag, men inneholder bare noen sporadiske tverrgående kutt av microvasculature. Hele-mount gir en oversikt over det hele retinal blodkar, men visualisering av microvasculature kan være plagsom. Hypotonisk isolasjon gir en metode for å visualisere hele retinal blodkar ved fjerning av neuronal celler, men dette gjør vevet svært skjøre.

Vellykket protokollene gir tre forskjellige retinal forberedelser for å visualisere mikrovaskulær pericytes. Hver av disse metodene bruker den PDGFRβ og NG2 immunoreactivity co lokaliseringen og den unike posisjonen i pericytes som brytes rundt kapillær endotelet foridentification.
I cryo-deler, neuronal lagene kan identifiseres av fluorescerende tettheten av DAPI-merket kjerner og indre og dypt kapillært plexuses inneholde...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Viser vi tre ulike vev forberedelser teknikker for immunohistochemical visualisering av rotte retinal mikrovaskulær pericytes, dvs. cryo-partiene, hele-montere og hypotonisk isolasjon av vaskulære nettverket.

Netthinnen Cryo-deler, hele-monteringer, og hypotonisk isolert blodkar forberedelser for Immunohistochemical visualisering av mikrovaskulær Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Disse metodene kan bidra til å svare på viktige spørsmål i oftalmologifeltet som pericyte spredning eller migrasjon. Den største fordelen med denne prosedyren er at de gir en rekke visualiseringsalternativer. Viser prosedyrene vil være Karin Dreisig og Frank W.Blixt, to post-docs på vårt laboratorium.For å enucleate øyet, bruk først en skalpell for å gjøre bakre og fremre åpninger på ca. 0, 5 centimeter i rotteøyelokket. Ta øyet med tang og vipp forsiktig til siden for å eksponere det omkringliggende vevet. Enucleate øyet ved å gjøre kutt med disseksjon saks i bindevev og muskelvev.Plasser øyet kort i 4% formaldehyd og fosfatbufret saltvann i ett til to minutter. Skyll kort i natriumbufferen før du lager et hull på hornhinnen limbus ved å bruke lett trykk med spissen av en skalpell. Skjær langs hornhinnen limbus med disseksjon saks for å fjerne hornhinnen og linsen med tang.Senk det gjenværende vevet med netthinnen i 4% formaldehyd i PBS i to til fire timer. Kryo-beskytte vevet ved å nedsenke i Sorensons fosfat buffer som inneholder 10% sukrose og deretter 25% sukrose. Overfør vevet når det har sunket til bunnen av beholderen.Bygg inn i Yazulla medium tilberedt med 3% gelatin fra svinehud og 30% albumin fra kyllingeggehvite. Deretter kutter du 10-mikron vertikale kryoseksjoner av gelatin-innebygd netthinnen gjennom til optisk nerve. Plasser kryosene på en glasssklie og la det tørke i minst en time.Når det er tørt, senk lysbildet i PBS med 0,25% Triton-X 100 i 15 minutter. Drypp deretter en blanding av 1:100 PDGF reseptor beta og 1:500 NG2 primære antistoffer i PBST og 1% BSA på kryoseksjon og plasser i et fuktig kammer på fire grader Celsius over natten. Neste dag vasker du delene ved å senke lysbildet i PBST to ganger i 15 minutter hver gang.Drypp deretter en blanding av 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594-koblet og 1:100 Anti-Rabbit FITC-koblede sekundære antistoffer fortynnet i PBST med 3% BSA på kryoseksjonene og inkubere i en time i mørket. Etter inkubasjonen skyller du glasssklien i PBST to ganger i 15 minutter hver gang. Monter de beisede kryoseksjonene med anti-falmende monteringsmedium som inneholder DAPI og en dekkslipp.En annen retinal vev forberedelsesteknikk er hel-mount. Etter fjerning av hornhinnen, bruk små åpningsbevegelser av tang for å skille netthinnen fra retinal pigmentepitelet mot optisk nerve. Frigjør netthinnen ved synsnerven med disseksjonssaks og lag tre til fire åpninger av noen få millimeter lengde fra netthinnens periferi mot synsnervehodet.Spre netthinnen på et glasssklie og la det tørke i fem til 10 minutter. Drypp 4% formaldehyd på netthinnen og fest i 20 til 30 minutter. Etter fiksering, skyll med PBS.For optimale resultater, immunstain rett etter skylling. Drypp først PBST på hele braketten og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter. Hell av PBST, og legg deretter til den primære antistoffløsningen og inkuber i et fuktig kammer ved fire grader Celsius over natten.Neste dag, hell av det primære antistoffet og drypp på PBST for å skylle netthinnen to ganger i 15 minutter hver gang. Etter å ha strømmet av den andre vasken, drypp sekundær antistoffløsning på netthinnen og inkubere i en time i et fuktig kammer ved romtemperatur i mørket. Etter den sekundære antistoffinkubasjonen vaskes du to ganger med PBST som før.Monter den beisede helfestet med anti-falmende monteringsmedium som inneholder DAPI og en dekselslipp. Alternativ til å montere netthinnen, kan netthinnens vaskulatur isoleres ved hypotonisk isolasjon. Først plasserer du netthinnen i en milliliter av deionisert vann i en 24-brønns plate og rist ved 200 o/min med en 1,5 millimeter vibrasjonsbane i en time ved romtemperatur, og legg deretter til 200 enheter dnase 1 for å dissosiere de lysede celleavfallene fra retinal vaskulaturen og rist i ytterligere 30 minutter ved romtemperatur.Skyll netthinnen i deionisert vann i tre ganger i fem minutter hver med risting ved 150 til 300 o/min for å fjerne nevronale cellerusk. Netthinnen skal bli mer gjennomsiktig med hver skylling, noe som indikerer fjerning av nevronale cellulære rusk. Etter skylling, fikse netthinnen i en milliliter på 4% paraformaldehyd og PBS i 10 minutter ved romtemperatur.Skyll med PBS tre ganger. Hvis du går videre til immunstaining, må du blokkere den hypotonisk-isolerte vaskulaturen med 500 mikroliter på 10 % eselserum fortynnet i PBS i en time med risting ved 100 o/min. Etter blokkering inkuberer du netthinnen over natten i 600 mikroliter primær antistoffoppløsning bestående av 1:100 PDGF-reseptor beta og 1:500 NG2 primære antistoffer fortynnet i 10% esel serum og PBS.Neste dag, skyll retinal nettverk tre ganger i PBS i fem minutter hver gang, deretter inkubere i 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594th-koblet og 1:100 Anti-Rabbit FITC-koblet sekundære antistoffer, fortynnet i 10% esel serum og PBS med risting på 100 rpm ved romtemperatur i en time i mørket. Etter en fem minutters vask i PBST inkuberer du i 0,2 nanogram per milliliter DAPI og PBST i 15 minutter. Vask tre ganger i fem minutter med PBST mens den er beskyttet mot lys.Deretter kutter spissen av en plast Pasteur pipette. Fjern skarpe kanter ved hjelp av en pipettespiss, og fukt Pasteurpipetten med PBST, og aspirer deretter netthinnens vaskulatur inn i pipetten og dispenser inn i et firebrønns glasskammersklie. Det fuktende trinnet er viktig for å unngå at netthinnen stikker til innsiden av Pasteurpipetten.Plasser netthinnens vaskulatur ved å vippe kammeret gli frem og tilbake. Fjern mediet fra brønnene på kammersklien. Overflatespenningen av væsken vil flate vaskulaturen på bunnen av lysbildet.Om nødvendig drypper dråper væske på retinal vaskulatur for å utfolde seg. Sørg for riktig utfoldelse under et mikroskop før du fjerner plastbrønnene fra kammersklien. Monter den beisede vaskulaturen med anti-falmende monteringsmedium og en dekselslipp.NG2 immunohistochemistry avslører positive kar i den indre delen av netthinnen. Piler indikerer sirkulær og hesteskoformet immunoreaktivitet i karene. Pilspissen peker på et langsgående fartøy.PDGF-reseptor beta immunohistochemistry viser lignende immunoreaktivitet til NG2. Igjen pilene og pilhodet indikerer immunoreaktivitet i fartøyene. Dette bildet viser en sammenslåing av NG2 i grønn, PDGF-reseptor beta i rødt, og DAPI i blått.Ved å overlagre de tre forskjellige filtrene, det er avslørt at NG2 og PDGF-reseptor beta er co-lokalisert. Dette bildet viser et immunostained helmontert preparat med NG2-farging i rødt. Immunoreaktivitet er synlig langs det overfladiske vaskulære nettverket med intens farging i abluminelle pericytter.De nevronale cellene er synlige som DAPI blå kjerner mellom NG2-farget mikrovasulatur. Dette bildet viser hypotonisk isolert rotte retinal vaskulært nettverk farget med NG2 i grønn og PDGF-reseptor beta i rødt. Hele nettverket viste NG2-immunoreaktivitet.PDGF-reseptor beta immunoreaktivitet ble funnet i celle somas. Ved høyere forstørrelse, Det er klart at PDGF-reseptor beta farging er bare sett i celle somas i vaskulære nettverket, indikerer pericyte immunoreaktivitet. Inkludert DAPI farging sammen med NG2 og PDGF-reseptor beta avslører tre pericytes i to udefinerte fartøy veggceller i dette høyforstørrelsesbildet.Etter disse prosedyrene kan andre immunstaininger som glatt muskelcelle eller endotelfarging brukes for å svare på flere spørsmål. For eksempel, hvordan ser celler i retinal vaskulatur følgende iskemi?

Research

JoVE Journal

Biology

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse av Embryonale og Larvesebrafisk Skeletal myofibers fra Dissosierte Forberedelser

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytologisk Analyse spermatogenese: Skarp og Faste Preparater av<em&gt; Drosophila</em&gt; Testikler

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Kartlegging av Motilitet i<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Forberedelser av tarmen

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Forbedret Swiss-rullende teknikk for tarmvevet Forberedelse til Immunhistokjemisk og Immunofluorescent Analyser

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Måle Endoreduplication av flowcytometri av isolerte Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

En ex vivo choroid spirende analyse av okulær mikrovaskulær angiogenese

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...