Name: retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

A pesquisa foi financiada pela Fundação Lundbeck, Dinamarca.

O protocolo foi otimizado e demonstrado em ratos adultos machos albino. Em todos os procedimentos experimentais, os animais foram tratados de acordo com os regulamentos na instrução ARVO para o uso de animais em oftalmologia e Vision Research. Os animais foram sacrificados por dióxido de carbono e subsequente deslocamento cervical.
1. preparações de tecido Retinal do rato
<ol><li>
Cryo-seção
	<ol>
<li>Fazer fendas cm de ~0.5 anterior e posterior na pálpebra rato com ...

<ol>
	<li>Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+Breaking+the+barrier.">Diabetic retinopathy: Breaking the barrier.</a> Pathophysiology. , (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+Brain+Injury+and+Repair+After+Ischemic+Stroke.">Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke.</a> Translational Stroke Research. , (2016).</li><li>Trost, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+and+Retinal+Pericytes:+Origin,+Function+and+Role.">Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).</li><li>Ramos, D., Lagali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Confocal+Laser+Microscopy+to+Analyze+Mouse+Retinal+Blood+Vessels.">The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels.</a> Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).</li><li>Moran, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+cross+talk+in+diabetic+retinopathy:+Pathophysiological+roles+and+therapeutic+implications.">Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).</li><li>Henkind, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+the+peripapillary+retina.">Microcirculation of the peripapillary retina.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte?.">What is a pericyte?.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36, 451-455 (2016).</li><li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+Characterization+of+Retina+Neuroglia+Modifications+in+Diabetic+Zucker+Diabetic+Fatty+Rats.">Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).</li><li>Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+retinal+ischemia+caused+by+controlled+low+ocular+perfusion+pressure+in+a+porcine+model.+Electrophysiological+and+histological+characterisation.">Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation.</a> Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).</li><li>Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+CGRP+and+its+receptor+components+CLR+and+RAMP1+in+the+rat+retina.">Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina.</a> Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).</li><li>Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renin-angiotensin+system+and+the+developing+retinal+vasculature.">The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).</li><li>Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+and+characterization+of+putative+mesenchymal+stem+cell+markers+in+the+retinal+capillary+network+of+rodents.">Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents.</a> Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).</li><li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier.">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nature Communications. 8, 15296 (2017).</li><li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo.">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).</li><li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+injection+of+the+heparin+analog+5-amino-2-naphthalenesulfonate+reduces+retinal+neovascularization+in+mice.">Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice.</a> Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).</li><li>Higgins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diltiazem+reduces+retinal+neovascularization+in+a+mouse+model+of+oxygen+induced+retinopathy.">Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy.</a> Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).</li><li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model.">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).</li><li>Hazra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+X+receptor+modulates+diabetic+retinopathy+outcome+in+a+mouse+model+of+streptozotocin-induced+diabetes.">Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes.</a> Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).</li><li>Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antioxidant+gene+therapy+on+the+development+of+diabetic+retinopathy+and+the+metabolic+memory+phenomenon.">Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+degradation+of+VE-cadherin+alters+the+blood-retinal+barrier+in+diabetes.">Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes.</a> Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).</li><li>Gustavsson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+cellular+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+expression+in+mice+retinal+vessels+is+affected+by+both+hyperglycemia+and+hyperlipidemia.">Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia.</a> PLoS One. 5, e12699 (2010).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+retinal+trilaminar+vascular+network.">Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network.</a> Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).</li></ol>

Apresentamos três técnicas de preparação da retina que podem ser aplicadas no estudo de pericitos da retina microvasculares. Abaixo, fornecemos uma comparação entre cada um dos métodos e destacar os passos críticos nos protocolos.
Com cryo-seccionamento, a retina é cortada em secções sagitais e, portanto, é possível obter inúmeros espécimes da retina mesma. As numerais seções resultantes deste método é fazem uma escolha ideal para a especificidade do anticorpo e testes de ti...

Perícitos da retina são o foco de muitos laboratórios de pesquisa como estas células desempenham um papel importante na integridade da vasculatura. Condições patológicas como retinopatia diabética1, isquemia2e glaucoma3 têm características vasculares que envolvem a função de pericitos. Pericitos são encontrados nos interiores plexos capilares da retina. Artéria central da retina que abastece os ramos de retina interna em duas camadas de plexos capilares. A cama vascular interna situa-se entre as células ganglionares e camadas nucleares internas. A camada mais profunda é mais denso e complexo e está localizada entre o interior e exterior camadas nucleares4,5. Além disso, algumas partes da retina também contêm uma terceira rede denominada os capilares parapapillary radial. Estas são longas, retos capilares que se encontram entre as fibras nervosas e raramente se anastomosam com um outro ou os outros dois plexos6. Dentro da parede capilar, pericitos são incorporados na membrana do porão e linha do lado de abluminal das células endoteliais vasculares.
Até esta data, não há nenhum marcador biológico exclusivo destas pericitos que pode diferenciá-las das outras células vasculares. Fator de crescimento derivado de plaquetas do receptor β (PDGFRβ) e nervo/gliais antígeno 2 (NG2) são comumente utilizados marcadores que ambos apresentam em pericitos mas também outras células vasculares. Identificação de pericitos é ainda mais complicada pela existência de subconjuntos Pericito que variam em morfologia e proteínas de expressão7. Atualmente, a melhor identificação depende de uma combinação de marcadores de proteína e o posicionamento característico do Pericito na parede vascular. Demonstramos aqui três técnicas de preparação de tecidos diferentes para coloração imuno-histoquímica PDGFRβ/NG2 de pericitos microvascular da retina do rato, ou seja, crio-seções, todo-montagens e hipotônica isolamento da rede vascular.
Com cryo-seções, a retina e a esclera são cortados através do nervo óptico. Isto permite a visualização de todas as estruturas em camadas de neurônios. As distintas dez camadas da retina são aparentes como intercâmbio nucleares e axonal/dendríticas estruturas que podem ser visualizadas com manchas como hematoxilina/eosina ou nuclear fluorescente 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. As exigências metabólicas diferem entre as camadas de9 e fornece um método para determinar a espessura ou a total ausência de uma camada específica (por exemplo, a perda de células ganglionares da retina é uma das marcas registradas de isquemia da retina10, 11). O sistema vascular é evidente como transversal corta através da retina, tornando possível estudar separadamente os plexos capilares dentro as respectivas camadas da retina12,13.
Mais tradicionalmente, as investigações da rede vasculatura da retina são realizadas em retinais todo-montagens. Com esta preparação do tecido, a retina é cortada e achatada como uma estrutura em forma de flor. O método é uma técnica de preparação do tecido relativamente rápida que pode realçar a vasculatura da retina de arquitetura global e, portanto, é muitas vezes aplicado na investigação da neovascularização na retina murino. Visualização bem sucedida da microvasculatura em retinas todo montado também é relatada no desenvolvimento neonatal rato e rato retina14,15,16,17,18, 19. estes estudos revelam uma atividade pericytic mais definida com áreas maiores capilar-livre no adulto em comparação com a retina neonatal14.
Outra maneira de Visualizar é a microvasculatura retiniana após isolamento hipotônica. Esta técnica de preparação do tecido resulta em embarcações de sangue retinais e capilares sendo liberados das células neuronais. Este tipo de imagem bidimensional da rede vascular retiniana isolada é geralmente realizado após a digestão de tripsina da retina20 e usado para avaliar as anormalidades vasculares da retinopatia diabética, incluindo capilar e perda de Pericito degeneração de21,20,22. O método de isolamento hipotônica oferece as investigações do gene vascular da retina e respostas regulatórias de proteína, como tem sido feito com RT-PCR e ocidental mancha23,24,25. Nós fornecemos aqui um protocolo para a coloração imuno-histoquímica livre flutuante da vasculatura da retina hipotônica isolada, como uma alternativa para a digestão do trypsin para examinar os pericitos microvasculares.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Geletin from porcine skin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">G2625-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5253-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D5025-15KU</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:165px;">0332-100G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Normal donkey serum</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">017-000-121, lot 129348</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Rabbit anti-PDGFR&#946;</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:165px;">sc-432</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Mouse anti-NG2</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:165px;">ab50009</td>
			<td style="width:171px;">1:500</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-585-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-095-151</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-225-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-165-150</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D9542-1MG</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:165px;">154526</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes

Perícitos da retina desempenham um papel importante em muitas doenças do olho. Imuno-histoquímica coloração técnicas dos vasos da retina e microvasculares pericitos são centrais para pesquisas oftalmológicas. É fundamental escolher um método apropriado de visualizar os pericitos microvasculares. Descrevemos a imuno-histoquímica da retina Pericito microvascular coloração em crio-seções, todo-montagens e hipotônica vasculatura isolada usando anticorpos para fator de crescimento derivado de plaquetas do receptor β (PDGFRβ) e nervo/gliais antígeno 2 (NG2). Isso nos permite destacar as vantagens e limitações de cada um dos preparativos para a visualização das retina pericitos microvasculares três tecido. Cryo-seções fornecem transsectional visualização de todas as camadas da retina, mas contêm apenas alguns cortes transversais ocasionais da microvasculatura. Toda a montagem fornece uma visão geral da vasculatura da retina inteira, mas visualização da microvasculatura pode ser problemática. Hipotônica isolamento fornece um método para visualizar a vasculatura da retina inteira pela remoção de células neuronais, mas isso faz com que o tecido muito frágil.

Os bem sucedidos protocolos fornecem três diferentes preparações da retina para a visualização de pericitos microvasculares. Cada um desses métodos usa PDGFRβ e NG2 imunorreatividade co localização e posição única de pericitos que envolvem a identificação do endotélio capilar.
Com cryo-seções, as camadas neuronais podem ser identificadas pela densidade fluorescente dos núcleos DAPI-rotulados e o interior e prof...

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Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Vamos demonstrar três técnicas de preparação de tecidos diferentes para visualização de imuno-histoquímica de pericitos microvascular da retina do rato, ou seja, crio-seções, todo-montagens e hipotônica isolamento da rede vascular.

Cryo-seções da retina, todo-montagens e hipotônica vasculatura isolada preparações para visualização de imuno-histoquímica de pericitos Microvascular

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Esses métodos podem ajudar a responder a perguntas-chave no campo da oftalmologia, como a proliferação de pericílitos ou a migração. A principal vantagem deste procedimento é que eles fornecem uma variedade de opções de visualização. Demonstrando os procedimentos serão Karin Dreisig e Frank W.Blixt, dois pós-doutores em nosso laboratório.Para enuclear o olho, primeiro use um bisturi para fazer as fendas posteriores e anteriores de aproximadamente 0,5 centímetros na pálpebra de rato. Pegue o olho com fórceps e incline cuidadosamente para o lado para expor o tecido circundante. Enuclear o olho fazendo cortes com tesoura de dissecção no tecido conjuntivo e muscular.Coloque brevemente o olho em 4% de formaldeído e salina tamponada com fosfato por um a dois minutos. Enxágüe brevemente no tampão de sódio antes de fazer um furo no limbus da córnea aplicando pressão leve com a ponta de um bisturi. Corte ao longo do limbus da córnea com uma tesoura de dissecção para remover a córnea e a lente com fórceps.Submergir o tecido restante com retina em 4% de formaldeído na PBS por duas a quatro horas. Crio-proteger o tecido imergindo no tampão fosfato de Sorenson contendo 10% de sacarose e, em seguida, 25% de sacarose. Transfira o tecido uma vez que tenha afundado para o fundo do recipiente.Embutido em yazulla médio preparado com 3% de gelatina de pele suína e 30% albumina de clara de ovo de galinha. Em seguida, corte crioseções verticais de 10 mícrons da retina incorporada à gelatina até o nervo óptico. Coloque as crioseções em um escorregador de vidro e deixe secar por pelo menos uma hora.Uma vez seco, submergir o slide em PBS com 0,25% Triton-X 100 por 15 minutos. Em seguida, gotejar uma mistura de 1:100 PDGF receptor beta e 1:500 NG2 anticorpos primários em PBST e 1%BSA na criosecção e colocar em uma câmara úmida a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave as seções imergindo o slide no PBST duas vezes por 15 minutos cada vez.Em seguida, gotejar uma mistura de 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594-linked e 1:100 Anticorpos secundários ligados ao FITC anti-coelho diluídos em PBST com 3%BSA nas crioseções e incubar por uma hora no escuro. Após a incubação, enxágue o deslizamento de vidro em PBST duas vezes por 15 minutos cada vez. Monte as crioseções manchadas com meio de montagem anti-desbotamento contendo DAPI e um deslizamento de tampa.Uma segunda técnica de preparação de tecido retiniano é de montagem total. Após a remoção da córnea, use pequenos movimentos de abertura de fórceps para separar a retina do epitélio pigmento da retina em direção ao nervo óptico. Liberte a retina no nervo óptico com uma tesoura de dissecção e faça de três a quatro fendas de alguns milímetros da periferia da retina em direção à cabeça do nervo óptico.Espalhe a retina em uma lâmina de vidro e deixe secar por cinco a 10 minutos. Gotejar 4% de formaldeído na retina e fixe por 20 a 30 minutos. Após a fixação, enxágue com PBS.Para obter resultados ideais, imunostain diretamente após a lavagem. Primeiro, gotejar PBST sobre o monte inteiro e incubar em temperatura ambiente por 15 minutos. Despeje o PBST, em seguida, adicione a solução de anticorpos primários e incubar em uma câmara úmida a quatro graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, despeje o anticorpo primário e gotejamento no PBST para enxaguar a retina duas vezes por 15 minutos cada vez. Depois de derramar a segunda lavagem, gotejar a solução de anticorpos secundários na retina e incubar por uma hora em uma câmara úmida à temperatura ambiente no escuro. Após a incubação de anticorpos secundários, lave duas vezes com PBST como antes.Monte o conjunto manchado inteiro com meio de montagem anti-desbotamento contendo DAPI e um deslizamento de cobertura. Alternativa à montagem integral da retina, a vasculatura da retina pode ser isolada pelo isolamento hipotônico. Primeiro, coloque a retina em um mililitro de água deionizada em uma placa de 24 poços e agite a 200 rpm com uma órbita de vibração de 1,5 milímetros por uma hora à temperatura ambiente, depois adicione 200 unidades de DNAse 1 para dissociar os detritos celulares da vasculatura da retina e agitar por mais 30 minutos em temperatura ambiente.Enxágüe a retina em água deionizada por três vezes por cinco minutos cada, tremendo a 150 a 300 rpm para remover detritos de células neuronais. A retina deve ficar mais transparente a cada enxágue, indicativo da remoção de detritos celulares neuronais. Após a lavagem, fixe a retina em um mililitro de 4% de paraformaldeído e PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.Enxágüe com PBS três vezes. Se continuar para a imunossucultura, bloqueie a vasculatura hipotônica isolada com 500 microlitres de soro de burro de 10% diluídos na PBS por uma hora com tremor a 100 rpm. Após o bloqueio, incubar a retina durante a noite em 600 microliters de solução de anticorpos primários consistindo de 1:100 PDGF-receptor beta e 1:500 NG2 anticorpos primários diluídos em 10% de soro de burro e PBS.No dia seguinte, enxágue a rede de retina três vezes na PBS por cinco minutos cada vez, depois incubar em 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594-ligado e 1:100 anticorpos secundários ligados ao FITC anti-coelho, diluídos em 10% de soro de burro e PBS com agitação a 100 rpm à temperatura ambiente por uma hora no escuro. Após uma lavagem de cinco minutos no PBST, incubar em 0,2 nanogramas por mililitro DAPI e PBST por 15 minutos. Lave três vezes por cinco minutos com PBST enquanto estiver protegido contra a luz.Em seguida, corte a ponta de uma pipeta pasteur de plástico. Remova as bordas afiadas usando uma ponta de pipeta e umedeça a pipeta Pasteur com PBST, depois aspire a vasculatura de retina na pipeta e dispense em um slide de câmara de vidro de quatro poços. O passo umedecido é importante para evitar que a vasculatura de retina grude no interior da pipeta Pasteur.Posicione a vasculatura da retina inclinando o deslizamento da câmara para frente e para trás. Remova o meio dos poços do deslizamento da câmara. A tensão superficial do líquido achatará a vasculatura na parte inferior do slide.Se necessário, gotejamento de gotas de líquido sobre a vasculatura da retina para se desdobrar. Certifique-se de desdobrar corretamente sob um microscópio antes de remover os poços de plástico do escorregador da câmara. Monte a vasculatura manchada com meio de montagem anti-desbotamento e um deslizamento de cobertura.A imunohistoquímica NG2 revela vasos positivos na parte interna da retina. As setas indicam imuno-reatividade circular e em forma de ferradura nos vasos. A ponta da flecha aponta um vaso longitudinalmente cortado.A imunohistoquímica beta do receptor PDGF mostra imunoreatividade semelhante ao NG2. Novamente as flechas e a ponta da flecha indicam imunoreatividade nos vasos. Esta imagem mostra uma fusão de NG2 em verde, beta receptor PDGF em vermelho e DAPI em azul.Ao sobrepor os três filtros diferentes, é revelado que o NG2 e o receptor beta do PDGF são co-localizados. Esta imagem mostra uma preparação de montagem completa imunostained com coloração NG2 em vermelho. A imunoreatividade é visível ao longo da rede vascular superficial com manchas intensas em pericítos abluminais.As células neuronais são visíveis como núcleos azuis DAPI entre a microvasculatura manchada de NG2. Esta imagem mostra a rede vascular de retina de rato isolado hipotônico manchada com NG2 em verde e pdgf-receptor beta em vermelho. A rede completa mostrou NG2-imunoreatividade.A imunoreatividade beta do receptor PDGF foi encontrada em somas celulares. Em maior ampliação, é claro que a coloração beta do receptor PDGF só é vista em somas celulares na rede vascular, indicando imunoreatividade pericíte. Incluindo a coloração da DAPI juntamente com NG2 e PDGF-receptor beta revela três pericílitos em duas células de parede de vasos indefinidas nesta imagem de alta ampliação.Após esses procedimentos, outras imunostenções como células musculares lisas ou manchas endoteliais podem ser usadas para responder a perguntas adicionais. Por exemplo, como as células da vasculatura da retina parecem seguir a isquemia?

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