Name: retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

Исследование финансировалось Lundbeck фонд, Дания.

Протокол был оптимизирован и продемонстрировал на мужских особей взрослых белых крыс. Во всех экспериментальных процедурах согласно регламенту в операторе Арво для использования животных в глазной и видение исследований относились животных. Животные были умерщвлены двуокиси углеро...

<ol>
	<li>Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+Breaking+the+barrier.">Diabetic retinopathy: Breaking the barrier.</a> Pathophysiology. , (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+Brain+Injury+and+Repair+After+Ischemic+Stroke.">Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke.</a> Translational Stroke Research. , (2016).</li><li>Trost, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+and+Retinal+Pericytes:+Origin,+Function+and+Role.">Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).</li><li>Ramos, D., Lagali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Confocal+Laser+Microscopy+to+Analyze+Mouse+Retinal+Blood+Vessels.">The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels.</a> Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).</li><li>Moran, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+cross+talk+in+diabetic+retinopathy:+Pathophysiological+roles+and+therapeutic+implications.">Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).</li><li>Henkind, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+the+peripapillary+retina.">Microcirculation of the peripapillary retina.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte?.">What is a pericyte?.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36, 451-455 (2016).</li><li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+Characterization+of+Retina+Neuroglia+Modifications+in+Diabetic+Zucker+Diabetic+Fatty+Rats.">Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).</li><li>Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characteristics+of+the+retinal+and+choroidal+vasculature.">Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).</li><li>Allen, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity+of+middle+cerebral+artery+occlusion+determines+retinal+deficits+in+rats.">Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats.</a> Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).</li><li>Kyhn, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+retinal+ischemia+caused+by+controlled+low+ocular+perfusion+pressure+in+a+porcine+model.+Electrophysiological+and+histological+characterisation.">Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation.</a> Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).</li><li>Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+CGRP+and+its+receptor+components+CLR+and+RAMP1+in+the+rat+retina.">Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina.</a> Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).</li><li>Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renin-angiotensin+system+and+the+developing+retinal+vasculature.">The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).</li><li>Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+and+characterization+of+putative+mesenchymal+stem+cell+markers+in+the+retinal+capillary+network+of+rodents.">Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents.</a> Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).</li><li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier.">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nature Communications. 8, 15296 (2017).</li><li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo.">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).</li><li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+injection+of+the+heparin+analog+5-amino-2-naphthalenesulfonate+reduces+retinal+neovascularization+in+mice.">Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice.</a> Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).</li><li>Higgins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diltiazem+reduces+retinal+neovascularization+in+a+mouse+model+of+oxygen+induced+retinopathy.">Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy.</a> Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).</li><li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model.">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).</li><li>Hazra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+X+receptor+modulates+diabetic+retinopathy+outcome+in+a+mouse+model+of+streptozotocin-induced+diabetes.">Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes.</a> Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).</li><li>Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antioxidant+gene+therapy+on+the+development+of+diabetic+retinopathy+and+the+metabolic+memory+phenomenon.">Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+degradation+of+VE-cadherin+alters+the+blood-retinal+barrier+in+diabetes.">Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes.</a> Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).</li><li>Gustavsson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+cellular+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+expression+in+mice+retinal+vessels+is+affected+by+both+hyperglycemia+and+hyperlipidemia.">Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia.</a> PLoS One. 5, e12699 (2010).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+retinal+trilaminar+vascular+network.">Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network.</a> Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).</li></ol>

Мы представляем три сетчатки подготовка техники, которые могут быть применены в исследовании микрососудистой pericytes сетчатки. Ниже мы предлагаем сравнение между каждым из методов и выделить важные шаги в протоколах.
С крио секционирование, сетчатки режется в сагиттально...

Сетчатки pericytes находятся в центре внимания многих научно-исследовательских лабораторий, как эти клетки играют важную роль в целостности сосудистую. Патологических состояний, таких как диабетическая ретинопатия1, ишемия2и глаукомы3 имеют сосудистой характеристики, которые включают функцию pericytes. Pericytes находятся в внутренний сетчатки капиллярной сплетения. Центральной артерии сетчатки, которая поставляет внутреннюю сетчатки разветвляется на два слоя капиллярного сплетений. Внутренняя сосудистого русла находится между клеток ганглия и внутренние ядерного слои. Глубокий слой более плотным и сложных и локализуется между внутренней и наружной ядерных слои4,5. Кроме того некоторые части сетчатки также содержат третья сеть называется радиальной parapapillary капилляров. Эти длинные, прямые капилляров, которые лежат среди нервных волокон и редко анастомозируют с друг с другом или другие два сплетения6. В стенке капилляров pericytes встраиваются в базальной мембраны и линии с abluminal стороны сосудистой эндотелиальных клеток.
К этой дате существует не уникальный биологический маркер эти pericytes, которые могут дифференцировать их от других сосудистых клеток. Часто используемых маркеров, которые представляют на pericytes, но и другие сосудистые клетки тромбоцитарный фактор роста рецепторов β (PDGFRβ) и нерва/глиальных антигена 2 (NG2). Выявление pericytes еще больше осложняется существование перицит подмножеств, которые различаются по морфологии и белка выражение7. В настоящее время лучшие идентификации опирается на комбинацию белковых маркеров и характерным позиционирования перицит в сосудистой стенке. Мы демонстрируем здесь три методы приготовления различных тканей для иммуногистохимическое окрашивание PDGFRβ/NG2 сетчатки микрососудистой pericytes крыса, т.е., крио секций, всего монтирует и гипотонической изоляции сосудистой сети.
С крио секции сетчатки и склера прорваться через зрительный нерв. Это позволяет для визуализации всех слоистых структур нейронов. Собственный десяти слоев сетчатки являются очевидными как Перепутывание ядерного и аксональной/дендритных структуры, которые могут быть визуализированы с пятнами как гематоксилином/эозином или флуоресцентные ядерной 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. Метаболические требования отличаются между слоями9 и он предоставляет метод для определения толщины или полное отсутствие конкретного слоя (например, потеря клеток сетчатки ганглия является одной из отличительных особенностей сетчатки ишемии10, 11). Сосудистую очевиден, как поперечный прорезает сетчатки, что делает его возможным отдельно изучить капиллярного сплетения в соответствующих слоях сетчатки12,13.
Традиционно в целом сетчатки-монтирует проводятся исследования сетчатки сосудистую сеть. С подготовкой этой ткани Сетчатка вырезать и уплощенная как цветок shaped структуры. Метод представляет собой метод подготовки сравнительно быстро ткани, который можно выделить общую архитектуру сетчатки сосудистую и поэтому он часто применяется в расследовании неоваскуляризация в мышиных сетчатки. Успешной визуализации microvasculature в целом монтируется сетчатки также сообщается в развивающихся неонатальной мыши и крысы сетчатки14,,1516,17,18, 19. Эти исследования выявили более определенным pericytic активности с больших капиллярно свободно OBLASTей в взрослого, по сравнению с новорожденным сетчатки14.
Еще один способ визуализации является microvasculature сетчатки после гипотонический изоляции. Этот метод подготовки ткани приводит к сетчатки кровеносных сосудов и капилляров, освобождается нейрональных клеток. Этот тип двумерных изображений изолированной сетчатки сосудистой сети обычно выполняется после переваривания трипсином сетчатки20 и использованы для оценки сосудистые аномалии диабетической ретинопатии, включая потерю перицит и капиллярные 20,дегенерация21,22. Гипотонический изоляции метод предлагает расследования сетчатки сосудистого генов и белков регулирования ответы, как они было сделано с RT-PCR и западных blotting23,24,25. Здесь мы предоставляем протокол для свободно плавать иммуногистохимическое окрашивание гипотонический изолированных сетчатки сосудистую как альтернатива Пищеварение трипсина для изучения микрососудистой pericytes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Geletin from porcine skin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">G2625-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5253-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D5025-15KU</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:165px;">0332-100G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Normal donkey serum</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">017-000-121, lot 129348</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Rabbit anti-PDGFR&#946;</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:165px;">sc-432</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Mouse anti-NG2</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:165px;">ab50009</td>
			<td style="width:171px;">1:500</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-585-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-095-151</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-225-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-165-150</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D9542-1MG</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:165px;">154526</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes

Сетчатки pericytes играют важную роль во многих заболеваний глаза. Иммуногистохимическое окрашивание методы сосудов сетчатки и микрососудистой pericytes являются центральными для офтальмологических исследований. Важно выбрать подходящий метод визуализации микрососудистой pericytes. Мы описываем сетчатки микрососудистой перицит иммуногистохимическое окрашивание в крио секции, всего кронштейны и гипотонической изолированных сосудистую, с использованием антител для тромбоцитарный фактор роста рецепторов β (PDGFRβ) и нерва/глиальных антигена 2 (NG2). Это позволяет нам подчеркнуть преимущества и недостатки каждого из трех ткани препаратов для визуализации сетчатки микрососудистой pericytes. Крио разделы обеспечивают transsectional визуализация всех слоев сетчатки, но содержат только несколько иногда поперечные срезы microvasculature. Целом гора обеспечивает обзор всей сетчатки сосудистую, но визуализация microvasculature может быть хлопотно. Гипотонический изоляции обеспечивает метод визуализировать всю сосудистую сетчатки, удаление нейрональных клеток, но это делает ткани очень хрупкие.

Успешный протоколы обеспечивают три различных препаратов сетчатки для визуализации микрососудистой pericytes. Каждый из этих методов использует PDGFRβ и NG2 иммунореактивности со локализации и уникальное положение pericytes, обернуть вокруг foridentification эндотелия капилляров.
<p c...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Мы показываем три методы приготовления различных тканей для визуализации иммуногистохимических сетчатки микрососудистой pericytes крыса, т.е., крио секций, всего монтирует и гипотонической изоляции сосудистой сети.

Сетчатки крио секции, целом кронштейны и гипотонический изолированных сосудистую подготовка к визуализации иммуногистохимических микрососудистой Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области офтальмологии, такие как перицитное распространение или миграция. Основным преимуществом этой процедуры является то, что они предоставляют различные варианты визуализации. Демонстрация процедур будет Карин Dreisig и Фрэнк W.Blixt, два пост-документы в нашей лаборатории.Чтобы окутать глаз, сначала используйте скальпель, чтобы сделать задние и передние щели примерно 0,5 сантиметра в веко крысы. Захватите глаз миппами и осторожно наклоните в сторону, чтобы разоблачить окружающие ткани. Enucleate глаз, делая порезы с рассечением ножницами в соединительной и мышечной ткани.Кратко поместите глаз в 4%формальдегида и фосфат-буферного солевого раствора в течение одной-двух минут. Промыть кратко в буфер натрия, прежде чем отверстие в лимбуса роговицы, применяя легкое давление с кончиком скальпеля. Вырезать вдоль роговицы лимбуса с ножницами вскрытия, чтобы удалить роговицу и хрусталик с миппами.Погрузите оставшуюся ткань с сетчаткой в 4%формальдегид в PBS в течение двух-четырех часов. Крио-защита ткани путем погружения в фосфатный буфер Соренсона, содержащий 10% сахарозы, а затем 25% сахарозы. Перенесите ткань после того, как она опустилась на дно контейнера.Вставлять в Yazulla среднего подготовлены с 3%gelatine из свиной кожи и 30%альбумин из куриного яичного белка. Затем вырежьте 10-микрон вертикальные криозеты желатин-встроенной сетчатки до зрительного нерва. Поместите cryosections на стеклянную горку и дайте высохнуть в течение как минимум одного часа.После высыхания, погрузите слайд в PBS с 0,25%Triton-X 100 в течение 15 минут. Затем капать смесь 1:100 PDGF рецептор бета и 1:500 NG2 первичных антител в PBST и 1%BSA на крик и место во влажной камере при четырех градусах Цельсия в одночасье. На следующий день, мыть разделы, погружая слайд в PBST два раза в течение 15 минут каждый раз.Затем капать смесь 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594-связанных и 1:100 Anti-Rabbit FITC связанных вторичных антител, разбавленных в PBST с 3%BSA на криозиции и инкубировать в течение одного часа в темноте. После инкубации, промыть стеклянную горку в PBST два раза в течение 15 минут каждый раз. Гора окрашенных cryosections с анти-увядание монтажа среды, содержащей DAPI и coverslip.Второй метод подготовки тканей сетчатки является цельно-монтаж. После удаления роговицы, использовать небольшие движения открытия типсов, чтобы отделить сетчатку от пигмента сетчатки эпителия к зрительному нерву. Освободите сетчатку зрительного нерва ножницами и сделайте три-четыре прорези длиной в несколько миллиметров от периферии сетчатки к голове зрительного нерва.Распредельте сетчатку на стеклянную горку и дайте высохнуть в течение пяти-десяти минут. Опустите 4%формальдегид на сетчатку и исправить в течение 20 до 30 минут. После фиксации, промыть PBS.Для достижения оптимальных результатов, иммуностина сразу после полоскания. Во-первых, капать PBST на всю гору и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут. Слейте PBST, а затем добавить первичный раствор антитела и инкубировать во влажной камере при четырех градусах по Цельсию на ночь.На следующий день, слить первичные антитела и капать на PBST для полоскания сетчатки дважды в течение 15 минут каждый раз. После заливки второй стирки, капельного вторичного раствора антитела на сетчатку и инкубировать в течение одного часа во влажной камере при комнатной температуре в темноте. После вторичной инкубации антител, мыть дважды с PBST, как и раньше.Гора окрашенных цельно-монтаж с анти-увядание монтажа среды, содержащей DAPI и крышка скольжения. Альтернативой полной монтаж сетчатки, сосуды сетчатки могут быть изолированы гипотонической изоляции. Во-первых, поместите сетчатку в один миллилитр деионизированной воды в 24-хорошо пластины и встряхнуть при 200 об /мин с 1,5-миллиметровой орбиты вибрации в течение одного часа при комнатной температуре, а затем добавить 200 единиц DNAse 1, чтобы отмежеваться от lysed клеточного мусора из сетчатки сосуда и встряхнуть еще 30 минут при комнатной температуре.Промыть сетчатку в деионизированной воде в течение трех раз в течение пяти минут каждый с встряхивания на 150 до 300 об / мин для удаления нейрональных клеток мусора. Сетчатка должна стать более прозрачной с каждым полоскать, что свидетельствует об удалении нейронального клеточного мусора. После полоскания, исправить сетчатки в один миллилитр 4%paraformaldehyde и PBS в течение 10 минут при комнатной температуре.Промыть PBS три раза. При переходе к иммуностимулятору блокируйте гипотонико-изолированную сосудообразуемую сосуды с 500 микролитров сыворотки 10%осла, разбавленной в PBS в течение одного часа при тряске при 100 об/мин. После блокирования инкубировать сетчатку на ночь в 600 микролитров первичного раствора антител, состоящий из 1:100 PDGF-рецептор бета и 1:500 NG2 первичных антител, разбавленных в 10%donkey сыворотки и PBS.На следующий день, промыть сетчатки сети три раза в PBS в течение пяти минут каждый раз, а затем инкубировать в 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594-связанных и 1:100 Anti-Rabbit FITC связанных вторичных антител, разбавленных в 10%donkey сыворотки и PBS с тряской при температуре 100 об/мин при комнатной температуре в течение одного часа в темноте. После пятиминутной стирки в PBST, инкубировать в 0,2 нанограмма на миллилитр DAPI и PBST в течение 15 минут. Вымойте три раза в течение пяти минут с PBST в то время как защищены от света.Затем вырежьте кончик пластиковой пипетки Pasteur. Удалите острые края с помощью наконечника пипетки, и смочьте пастер пипетку с PBST, а затем аспирировать сосуды сетчатки в пипетку и обойтись в четыре хорошо стеклянная камера слайд. Увлажняющий шаг имеет важное значение, чтобы избежать сосудов сетчатки прилипания к внутренней части трубы Пастера.Распоитить сосуды сетчатки, наклоняя камеру слайд вперед и назад. Удалите среду из колодцев камерного слайда. Поверхностное натяжение жидкости сгладит сосуды на дно слайда.При необходимости, капельные капли жидкости на сосуды сетчатки разворачиваться. Убедитесь, что правильно разворачивается под микроскопом, прежде чем удалить пластиковые скважины из камеры слайда. Намонтировать окрашенные сосуды с анти-увядание монтажа среды и крышки скольжения.Иммуногистохимия NG2 выявляет положительные сосуды во внутренней части сетчатки. Стрелки указывают на круговую и подковообразную иммунореактивность сосудов. Наконечник стрелы указывает на продольно разрезанное судно.PDGF-рецептор бета иммуногистохимия показывает аналогичную иммунореактивность NG2. Снова стрелки и наконечник стрелы указывают на иммунореактивность сосудов. На этом изображении показано слияние NG2 в зеленый цвет, БЕТА-рецептор PDGF - в красном, а DAPI - в синем.Путем намерить 3 по-разному фильтра, показано что бета NG2 и PDGF-рецептор co-локализованы. На этом снимке показан иммуноолентный цельно-монтажный препарат с окрашивание NG2 в красный цвет. Иммунореактивность видна вдоль поверхностной сосудистой сети с интенсивным окрашивание в аблюминальные перициты.Нейронные клетки видны как daPI синие ядра между NG2-окрашенных микроваскакулатуры. На этом снимке показана гипотоническая изолированная крысиная сосудистая сеть сетчатки, окрашенная NG2 в зеленый цвет и бета-рецептор PDGF-рецептор в красном цвете. Полная сеть показала NG2-иммунореактивность.PDGF-рецептор бета иммунореактивности был найден в клеточной сомы. При более высоком увеличении, ясно, что PDGF-рецептор бета-окрашивания наблюдается только в клеточной сомы в сосудистой сети, что указывает на перицит иммунореактивности. В том числе DAPI окрашивания вместе с NG2 и PDGF-рецептор бета показывает три перицита в двух неопределенных клеток стенки сосуда в этом высоком увеличении изображения.После этих процедур, другие иммуностимуляторы, такие как гладкая мышечная клетка или эндотелиальные окрашивания могут быть использованы для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы. Например, как клетки в сосудах сетчатки выглядят следующими ишемией?

Research

JoVE Journal

Biology

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Тонкие секционирования фрагмент Подготовка к Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

Использование лазерный пинцет для манипуляций Изолированные нейроны In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Всего монтажа иммуногистохимического анализа для Эмбриональные сосудистой кожи конечностей: модельная система для исследования сосудистой Ветвление Морфогенез в зародыше

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Анализ эмбрионального и личиночного рыбок данио скелетных мышечных волокон из диссоциированных препаратов

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Цитологического анализа сперматогенеза: Живые и Исправлены Препараты<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Семенники

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Пространственно-временная Отображение подвижности в<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Подготовка кишечника

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Улучшенная техника швейцарско-прокатка для Кишечные Подготовка ткани для иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного анализов

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Измерение Endoreduplication подачей Cytometry изолированных клубней протопласта

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Ex Vivo Choroid Прорастание анализ глазного микрососудистого ангиогенеза

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...