Name: retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

La investigación fue financiada por la Fundación Lundbeck, Dinamarca.

El protocolo fue optimizado y demostrado en ratas albinas machos adultos. En todos los procedimientos experimentales, los animales fueron tratados según las disposiciones de la declaración de ARVO para el uso de animales en oftálmica y la investigación de la visión. Los animales fueron sacrificados por el dióxido de carbono y la dislocación cervical posterior.
1. rata tejido retiniano preparados
<ol><li>
Cryo-sección
	<ol>
<li>Hacer posterior y anterior de ~0.5 rajas...

<ol>
	<li>Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+Breaking+the+barrier.">Diabetic retinopathy: Breaking the barrier.</a> Pathophysiology. , (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+Brain+Injury+and+Repair+After+Ischemic+Stroke.">Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke.</a> Translational Stroke Research. , (2016).</li><li>Trost, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+and+Retinal+Pericytes:+Origin,+Function+and+Role.">Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).</li><li>Ramos, D., Lagali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Confocal+Laser+Microscopy+to+Analyze+Mouse+Retinal+Blood+Vessels.">The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels.</a> Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).</li><li>Moran, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+cross+talk+in+diabetic+retinopathy:+Pathophysiological+roles+and+therapeutic+implications.">Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).</li><li>Henkind, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+the+peripapillary+retina.">Microcirculation of the peripapillary retina.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte?.">What is a pericyte?.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36, 451-455 (2016).</li><li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+Characterization+of+Retina+Neuroglia+Modifications+in+Diabetic+Zucker+Diabetic+Fatty+Rats.">Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).</li><li>Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characteristics+of+the+retinal+and+choroidal+vasculature.">Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).</li><li>Allen, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity+of+middle+cerebral+artery+occlusion+determines+retinal+deficits+in+rats.">Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats.</a> Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).</li><li>Kyhn, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+retinal+ischemia+caused+by+controlled+low+ocular+perfusion+pressure+in+a+porcine+model.+Electrophysiological+and+histological+characterisation.">Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation.</a> Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).</li><li>Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+CGRP+and+its+receptor+components+CLR+and+RAMP1+in+the+rat+retina.">Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina.</a> Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).</li><li>Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renin-angiotensin+system+and+the+developing+retinal+vasculature.">The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).</li><li>Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+and+characterization+of+putative+mesenchymal+stem+cell+markers+in+the+retinal+capillary+network+of+rodents.">Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents.</a> Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).</li><li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier.">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nature Communications. 8, 15296 (2017).</li><li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo.">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).</li><li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+injection+of+the+heparin+analog+5-amino-2-naphthalenesulfonate+reduces+retinal+neovascularization+in+mice.">Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice.</a> Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).</li><li>Higgins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diltiazem+reduces+retinal+neovascularization+in+a+mouse+model+of+oxygen+induced+retinopathy.">Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy.</a> Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).</li><li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model.">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).</li><li>Hazra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+X+receptor+modulates+diabetic+retinopathy+outcome+in+a+mouse+model+of+streptozotocin-induced+diabetes.">Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes.</a> Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).</li><li>Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antioxidant+gene+therapy+on+the+development+of+diabetic+retinopathy+and+the+metabolic+memory+phenomenon.">Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+degradation+of+VE-cadherin+alters+the+blood-retinal+barrier+in+diabetes.">Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes.</a> Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).</li><li>Gustavsson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+cellular+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+expression+in+mice+retinal+vessels+is+affected+by+both+hyperglycemia+and+hyperlipidemia.">Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia.</a> PLoS One. 5, e12699 (2010).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+retinal+trilaminar+vascular+network.">Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network.</a> Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).</li></ol>

Presentamos tres técnicas retiniana que pueden ser aplicadas en el estudio del pericitos retinianos microvasculares. A continuación, ofrecemos una comparación entre cada uno de los métodos y resaltar los pasos críticos en los protocolos.
Con el seccionamiento de cryo, la retina se corta en secciones sagitales y por lo tanto, es posible obtener numerosas muestras de la misma retina. Las secciones números resultantes de este método lo hacen una opción ideal para la especificidad de antic...

Pericitos retinianos son el foco de muchos laboratorios de investigación como estas células desempeñan un papel importante en la integridad de la vasculatura. Condiciones patológicas tales como la retinopatía diabética1, isquemia2y glaucoma3 tienen características vasculares que implican la función del pericitos. Pericitos se encuentran en los plexos capilares retinianos internos. Ramas de la arteria central de la retina que suministra la retina interna en dos capas de plexos capilares. El lecho vascular interno se encuentra entre la célula del ganglio y las capas nucleares internas. La capa más profunda es más densa y compleja y se localiza entre las capas nucleares interna y externa4,5. Además, algunas partes de la retina contienen también una tercera cadena denominada los capilares parapapillary radial. Estos son largos, tubos capilares rectos que se encuentran entre las fibras nerviosas y raramente los anastomose con uno con el otro o los otros dos plexos6. Dentro de la pared capilar, pericitos están incrustadas en la membrana del sótano y la línea del lado abluminal de células endoteliales vasculares.
Hasta la fecha, no existe ningún marcador biológico único de estos pericitos que puede distinguir de otras células vasculares. Β del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRβ) y el antígeno del nervio/glial 2 (NG2) son marcadores utilizados que presentan en pericitos pero también otras células vasculares. Identificación del pericitos se complica aún más por la existencia de pericyte subconjuntos que varían en morfología y proteína expresión7. Actualmente, la mejor identificación se basa en una combinación de marcadores de proteínas y la característica de la pericyte en la pared vascular. Aquí demostramos tres técnicas de preparación de tejidos diferentes para la coloración immunohistochemical PDGFRβ/NG2 del pericitos microvasculares retina de rata, es decir, cryo-secciones, todo-montajes y aislamiento hipotónica de la red vascular.
Con secciones de cryo, la retina y la esclerótica se cortan a través del nervio óptico. Esto permite la visualización de todas las estructuras de capas de neuronas. Las diez distintas capas de la retina son evidentes como intercambio de estructuras nucleares y axonal/dendríticas que pueden visualizarse con tinciones como hematoxilina/eosina o fluorescente nuclear 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. Las necesidades metabólicas difieren entre las capas9 y ofrece un método para determinar el grueso o total ausencia de una capa específica (por ejemplo, la pérdida de células ganglionares de la retina es una de las características de la isquemia retiniana10, 11). La vasculatura es evidente como transversal atraviesa la retina, lo que es posible estudiar por separado los plexos capilares dentro de las respectivas capas retinianas12,13.
Más tradicionalmente, se realizan las investigaciones de la red de la vasculatura retiniana en retina de monturas de todo. Con esta preparación de tejido, la retina se corta y aplanada como una estructura en forma de flor. El método es una técnica de preparación de tejido relativamente rápido que se puede destacar la vasculatura retiniana de arquitectura general y por lo tanto se aplica a menudo en la investigación de neovascularización de la retina murina. Visualización exitosa de la microvascularización en retinas todo montado también se divulga en el ratón neonatal en desarrollo y14,de retina de rata15,de17,de16,18, 19. estos estudios revelan una actividad pericytic más definida con áreas libre de capilares más grandes en el adulto frente a los los neonatal retina14.
Otra forma de visualizar es la microvasculatura retiniana después aislamiento hipotónica. Esta técnica de preparación de tejido resulta en vasos sanguíneos retinianos y capilares liberados de las células neuronales. Este tipo de proyección de imagen de dos dimensiones de la red vascular retiniana aislada es generalmente realizada después de la digestión de tripsina retina20 y utilizado para evaluar las anormalidades vasculares de la retinopatía diabética como pericyte pérdida capilar degeneración20,21,22. El método de aislamiento hipotónica ofrece las investigaciones de gen vascular retiniana y proteínas reguladoras respuestas como lo ha hecho con la RT-PCR y western blot23,24,25. Aquí proporcionamos un protocolo para el flotador libre de la coloración de immunohistochemical de la vasculatura retiniana aislada hipotónica como alternativa a la digestión de la tripsina para examinar del pericitos microvasculares.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Geletin from porcine skin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">G2625-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5253-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D5025-15KU</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:165px;">0332-100G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Normal donkey serum</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">017-000-121, lot 129348</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Rabbit anti-PDGFR&#946;</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:165px;">sc-432</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Mouse anti-NG2</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:165px;">ab50009</td>
			<td style="width:171px;">1:500</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-585-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-095-151</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-225-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-165-150</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D9542-1MG</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:165px;">154526</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes

Pericitos retinianos juegan un papel importante en muchas enfermedades del ojo. Immunohistochemical que manchaba técnicas de vasos retinianos y microvascular pericitos son fundamentales para la investigación oftalmológica. Es vital elegir un método apropiado de visualización del pericitos microvasculares. Describimos pericyte microvascular retiniana immunohistochemical que manchaba en cryo-secciones, todo-montajes e hipotónica vasculatura aislado usando los anticuerpos para el antígeno del nervio/glial 2 (NG2) y β del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRβ). Esto nos permite destacar ventajas y deficiencias de cada una de las preparaciones de tres tejido para la visualización del pericitos microvasculares retinianas. Cryo-secciones proporcionan visualización de transsectional de todas las capas retinianas pero contienen sólo unos ocasionales cortes transversales de la microvascularización. Montaje en conjunto proporciona una visión general de la vasculatura retiniana completa y visualización de la microcirculación puede ser problemática. Hipotónica aislamiento proporciona un método para visualizar la vasculatura retiniana toda por la eliminación de las células neuronales, pero esto hace que el tejido muy frágil.

Los protocolos exitosos proporcionan tres diferentes preparaciones de retinales para la visualización de pericitos microvasculares. Cada uno de estos métodos utiliza la PDGFRβ y NG2 immunoreactivity co-localización y la posición única del pericitos alrededor del foridentification del endotelio capilar.
Con secciones de crio, las capas neuronales pueden ser identificadas por la densidad fluorescente de núcleos etiquetados ...

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Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Demostrar técnicas de preparación de tres tejidos diferentes para la visualización de immunohistochemical del pericitos microvasculares retina de rata, es decir, cryo-secciones, todo-montajes e hipotónica aislamiento de la red vascular.

Retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de Immunohistochemical del pericitos microvasculares

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oftalmología, como la proliferación de pericitos o la migración. La principal ventaja de este procedimiento es que proporcionan una variedad de opciones de visualización. Demostrando los procedimientos estarán Karin Dreisig y Frank W.Blixt, dos post-doctorados en nuestro laboratorio.Para enuligar el ojo, primero usa un bisturí para hacer las hendiduras posterior y anterior de aproximadamente 0,5 centímetros en el párpado de la rata. Agarre el ojo con fórceps e incline cuidadosamente hacia un lado para exponer el tejido circundante. Enuclete el ojo haciendo cortes con tijeras de disección en el tejido conectivo y muscular.Coloque brevemente el ojo en un 4%formaldehído y solución salina tamponada con fosfato durante uno o dos minutos. Enjuague brevemente en tampón de sodio antes de hacer un agujero en el limbo corneal aplicando una ligera presión con la punta de un bisturí. Corte a lo largo del limbo corneal con tijeras de disección para eliminar la córnea y la lente con fórceps.Sumerja el tejido restante con retina en 4%formaldehído en PBS durante dos a cuatro horas. Cryo-proteger el tejido sumergiendo en el tampón de fosfato de Sorenson que contiene 10%sacarosa y luego 25%sacarosa. Transfiera el tejido una vez que se haya hundido en la parte inferior del recipiente.Incrustar en medio de Yazulla preparado con 3%gelatina de piel porcina y 30%albúmina de clara de huevo de pollo. A continuación, corte las criocciones verticales de 10 micras de la retina incrustada en gelatina hasta el nervio óptico. Coloque las criocciones en un tobogán de vidrio y deje secar durante un mínimo de una hora.Una vez seco, sumerja el portaobjetos en PBS con 0.25%Triton-X 100 durante 15 minutos. Luego, gotee una mezcla de 1:100 anticuerpos primarios del receptor PDGF beta y 1:500 NG2 en PBST y 1%BSA sobre la criosectación y colóquelos en una cámara húmeda a cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, lave las secciones sumergiendo la diapositiva en PBST dos veces durante 15 minutos cada vez.A continuación, gotee una mezcla de 1:100 anticuerpos secundarios anti-ratón Alexa Fluor 594 y 1:100 anti-Rabbit FITC diluidos en PBST con 3%BSA en las criocciones y incubar durante una hora en la oscuridad. Después de la incubación, enjuague el portaobjetos de vidrio en PBST dos veces durante 15 minutos cada vez. Monte las criocciones teñidas con un medio de montaje antidescolorante que contenga DAPI y un cubreobjetos.Una segunda técnica de preparación del tejido de la retina es de montaje completo. Después de la extirpación de la córnea, utilice pequeños movimientos de apertura de fórceps para separar la retina del epitelio pigmentario de la retina hacia el nervio óptico. Libera la retina en el nervio óptico con tijeras de disección y haz de tres a cuatro rendijas de unos pocos milímetros de longitud desde la periferia de la retina hacia la cabeza del nervio óptico.Esparce la retina sobre un portaobjetos de vidrio y deja secar durante cinco a 10 minutos. Gotee 4%formaldehído en la retina y arréglalo durante 20 a 30 minutos. Después de la fijación, enjuague con PBS.Para obtener resultados óptimos, la inmunosu mancha directamente después del enjuague. Primero, gotee PBST en todo el montaje e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Vierta el PBST, luego agregue la solución de anticuerpos primarios e incubar en una cámara húmeda a cuatro grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, verter el anticuerpo primario y gotear en PBST para enjuagar la retina dos veces durante 15 minutos cada vez. Después de verter el segundo lavado, gotee la solución de anticuerpos secundarios sobre la retina e incubar durante una hora en una cámara húmeda a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación secundaria de anticuerpos, lave dos veces con PBST como antes.Monte el soporte completo teñido con un medio de montaje antidescolorante que contenga DAPI y un resbalón de cubierta. Alternativa al montaje integral de la retina, la vasculatura de la retina se puede aislar por aislamiento hipotónico. Primero, coloque la retina en un mililitro de agua desionizada en una placa de 24 pozos y agite a 200 rpm con una órbita de vibración de 1,5 milímetros durante una hora a temperatura ambiente, luego agregue 200 unidades de DNAse 1 para disociar los restos celulares lisos de la vasculatura retinural y agitar durante otros 30 minutos a temperatura ambiente.Enjuague la retina con agua desionizada tres veces durante cinco minutos cada una con temblores a 150 a 300 rpm para eliminar los restos celulares neuronales. La retina debe ser más transparente con cada enjuague, indicativo de la eliminación de desechos celulares neuronales. Después del enjuague, fijar la retina en un mililitro de 4%paraformaldehído y PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.Enjuague con PBS tres veces. Si se procede a la inmunosucultura, bloquee la vasculatura hipotónica aislada con 500 microlitros de 10% de suero de burro diluido en PBS durante una hora con temblores a 100 rpm. Después del bloqueo, incubar la retina durante la noche en 600 microlitros de solución de anticuerpos primarios que consisten en 1:100 PDGF-receptor beta y 1:500 NG2 anticuerpos primarios diluidos en 10%suero de burro y PBS.Al día siguiente, enjuague la red de retina tres veces en PBS durante cinco minutos cada vez, luego incubar en 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594th-linked y 1:100 Anti-Rabbit FITC-linked anticuerpos secundarios, diluidos en 10%suero de burro y PBS con temblor a 100 rpm a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad. Después de un lavado de cinco minutos en PBST, incubar en 0,2 nanogramos por mililitro DAPI y PBST durante 15 minutos. Lavar tres veces durante cinco minutos con PBST mientras está protegido de la luz.A continuación, corte la punta de una pipeta Pasteur de plástico. Retire los bordes afilados con una punta de pipeta, humedezca la pipeta Pasteur con PBST, luego aspire la vasculatura de la retina en la pipeta y prescinda en un portaobjetos de cámara de vidrio de cuatro pozos. El paso de humectante es importante para evitar que la vasculatura de la retina se pegue al interior de la pipeta Pasteur.Coloque la vasculatura de la retina inclinando el deslizamiento de la cámara hacia adelante y hacia atrás. Retire el medio de los pozos de la corredera de la cámara. La tensión superficial del líquido aplanará la vasculatura en la parte inferior de la diapositiva.Si es necesario, gotas de líquido sobre la vasculatura de la retina para desplegar. Asegúrese de desplegarse correctamente bajo un microscopio antes de retirar los pozos de plástico de la corredera de la cámara. Monte la vasculatura teñida con un medio de montaje antidescolorante y un resbalón de cubierta.La inmunohistoquímica NG2 revela vasos positivos dentro de la parte interna de la retina. Las flechas indican inmunorreactividad circular y en forma de herradura en los vasos. La punta de flecha señala un recipiente cortado longitudinalmente.La inmunohistoquímica beta del receptor de PDGF muestra una inmunoreactividad similar a la NG2. Una vez más las flechas y la punta de flecha indican inmunoreactividad en los vasos. Esta imagen muestra una fusión de NG2 en verde, PDGF-receptor beta en rojo, y DAPI en azul.Al superponer los tres filtros diferentes, se revela que NG2 y PDGF-receptor beta están co-localizados. Esta imagen muestra una preparación de montaje completo inmunomonto con tinción NG2 en rojo. La inmunoreactividad es visible a lo largo de la red vascular superficial con manchas intensas en pericitos abluminales.Las células neuronales son visibles como núcleos azules DAPI entre la microvasculatura teñida de NG2. Esta imagen muestra la red vascular de la retina de rata aislada hipotónica manchada con NG2 en verde y PDGF-receptor beta en rojo. La red completa mostró inmunoreactividad NG2.Se encontró inmunoreactividad beta del receptor de PDGF en somas celulares. Con mayor aumento, está claro que la tinción beta del receptor de PDGF sólo se observa en somas celulares en la red vascular, lo que indica inmunoreactividad pericitato. Incluyendo la tinción DAPI junto con NG2 y PDGF-receptor beta revela tres pericitos en dos células de pared de recipientes indefinidas en esta imagen de alto aumento.Después de estos procedimientos, otras inmunosuchaciones como la célula muscular lisa o tinciones endoteliales se pueden utilizar con el fin de responder preguntas adicionales. Por ejemplo, ¿cómo se ven las células de la vasculatura retinal después de la isquemia?

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