Name: retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

Forskningen har finansierats av Lundbeck Foundation, Danmark.

Protokollet var optimerad och visade på vuxna manliga albino råttor. I alla experimentella rutiner behandlades djur enligt reglementet i uttrycket ARVO för användning av djur i oftalmologiska och Vision forskning. Djur var euthanized av koldioxid och efterföljande cervikal dislokation.
1. råtta näthinnevävnad preparat
<ol><li>
Cryo-avsnitt
	<ol>
<li>Gör bakre och främre ~0.5 cm springor i råtta ögonlocket med en skalpell.<ol>
<li>Valfritt: Använda en diatermi br...

<ol>
	<li>Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+Breaking+the+barrier.">Diabetic retinopathy: Breaking the barrier.</a> Pathophysiology. , (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+Brain+Injury+and+Repair+After+Ischemic+Stroke.">Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke.</a> Translational Stroke Research. , (2016).</li><li>Trost, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+and+Retinal+Pericytes:+Origin,+Function+and+Role.">Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).</li><li>Ramos, D., Lagali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Confocal+Laser+Microscopy+to+Analyze+Mouse+Retinal+Blood+Vessels.">The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels.</a> Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).</li><li>Moran, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+cross+talk+in+diabetic+retinopathy:+Pathophysiological+roles+and+therapeutic+implications.">Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).</li><li>Henkind, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+the+peripapillary+retina.">Microcirculation of the peripapillary retina.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte?.">What is a pericyte?.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36, 451-455 (2016).</li><li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+Characterization+of+Retina+Neuroglia+Modifications+in+Diabetic+Zucker+Diabetic+Fatty+Rats.">Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).</li><li>Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characteristics+of+the+retinal+and+choroidal+vasculature.">Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).</li><li>Allen, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity+of+middle+cerebral+artery+occlusion+determines+retinal+deficits+in+rats.">Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats.</a> Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).</li><li>Kyhn, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+retinal+ischemia+caused+by+controlled+low+ocular+perfusion+pressure+in+a+porcine+model.+Electrophysiological+and+histological+characterisation.">Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation.</a> Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).</li><li>Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+CGRP+and+its+receptor+components+CLR+and+RAMP1+in+the+rat+retina.">Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina.</a> Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).</li><li>Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renin-angiotensin+system+and+the+developing+retinal+vasculature.">The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).</li><li>Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+and+characterization+of+putative+mesenchymal+stem+cell+markers+in+the+retinal+capillary+network+of+rodents.">Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents.</a> Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).</li><li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier.">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nature Communications. 8, 15296 (2017).</li><li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo.">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).</li><li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+injection+of+the+heparin+analog+5-amino-2-naphthalenesulfonate+reduces+retinal+neovascularization+in+mice.">Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice.</a> Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).</li><li>Higgins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diltiazem+reduces+retinal+neovascularization+in+a+mouse+model+of+oxygen+induced+retinopathy.">Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy.</a> Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).</li><li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model.">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).</li><li>Hazra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+X+receptor+modulates+diabetic+retinopathy+outcome+in+a+mouse+model+of+streptozotocin-induced+diabetes.">Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes.</a> Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).</li><li>Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antioxidant+gene+therapy+on+the+development+of+diabetic+retinopathy+and+the+metabolic+memory+phenomenon.">Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+degradation+of+VE-cadherin+alters+the+blood-retinal+barrier+in+diabetes.">Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes.</a> Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).</li><li>Gustavsson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+cellular+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+expression+in+mice+retinal+vessels+is+affected+by+both+hyperglycemia+and+hyperlipidemia.">Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia.</a> PLoS One. 5, e12699 (2010).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+retinal+trilaminar+vascular+network.">Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network.</a> Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).</li></ol>

Vi presenterar tre retinal förberedelser tekniker som kan tillämpas i studien av mikrovaskulära retinal pericyter. Nedan, vi tillhandahåller en jämförelse mellan alla metoder och markera kritiska steg i protokollen.
Med kryo-snittning, näthinnan skärs i sagittal sektioner och därför är det möjligt att få talrika exemplar från samma näthinnan. Avsnitten siffran som följer av denna metod gör det ett idealiskt val för antikropp specificitet och titrering test eftersom den förhi...

Retinal pericyter är i fokus för många forskningslaboratorier som dessa celler spelar en viktig roll i integriteten av kärlsystemet. Sjukdomstillstånd såsom diabetesretinopati1, ischemi2och glaukom3 har vaskulära egenskaper som involverar funktionen av pericyter. Pericyter finns i de inre retinal kapillär plexuses. Den centrala retinal artär som förser inre näthinnan grenarna i två lager av kapillär plexuses. Inre vaskulär sängen ligger mellan ganglion cell och inre nukleära lager. Det djupa lagret är mer tät och komplex och är lokaliserad mellan den inre och yttre nukleära lager4,5. Dessutom innehåller vissa delar av näthinnan också ett tredje nätverk som kallas radiell parapapillary kapillärerna. Dessa är långa, raka kapillärer som ligger bland nervfibrerna och sällan anastomose med varandra eller de andra två plexuses6. Inom kapillär väggen, pericyter är inbäddade i basalmembranet och linje abluminal sidan av vaskulära endotelceller.
Till detta datum finns det ingen unik biologisk markör av dessa pericyter som kan skilja dem från andra vaskulära celler. Trombocyt-härrör tillväxtfaktor receptor β (PDGFRβ) och nerv/gliaceller antigen 2 (NG2) är vanliga markörer som båda presenterar på pericyter men också andra vaskulära celler. Identifiering av pericyter kompliceras ytterligare av förekomsten av pericyt delmängder som varierar i morfologi och protein uttryck7. För närvarande bygger bästa identifieringen på en kombination av protein markörer och karakteristiska placeringen av pericyt i kärlväggen. Här visar vi tre tekniker för beredning av olika vävnad för immunhistokemiska PDGFRβ/NG2 färgning av råtta retinal mikrovaskulära pericyter, dvs, cryo-avsnitt, hela-fästen och hypoton isolering av vaskulära nätverket.
Med kryo-sektioner skärs näthinnan och sklera genom synnerven. Detta möjliggör visualisering av alla skiktade strukturer av nervceller. De distinkta tio lagrarna av näthinnan är uppenbara som utbyta kärn- och axonal/dendritiska strukturer som kan visualiseras med fläckar såsom hematoxylin/eosin eller fluorescerande nukleära 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI)8. De metabola krav skiljer sig mellan de lager9 och det ger en metod för att bestämma tjocklek eller total avsaknad av ett visst lager (t.ex., förlusten av retinala ganglionceller är ett av kännetecknen av retinal ischemi10, 11). I kärlsystemet är uppenbart eftersom tvärgående skär genom näthinnan, vilket gör det möjligt att separat studera de kapillära plexuses inom de respektiva retinal lager12,13.
Mer traditionellt, utförs utredningarna av retinal vaskulatur nätverket i näthinnans hela-fästen. Med denna vävnad förberedelse, näthinnan skärs och tillplattad som en blomma-formad struktur. Metoden är en relativt snabb vävnad förberedelse teknik som kan belysa den övergripande arkitekturen retinala blodkärlen och det används därför ofta i utredningen av kärlnybildning i murina näthinnan. Lyckad visualisering av mikrocirkulation i hela monterade näthinnor rapporteras också i utvecklingsländer neonatal mus och råtta näthinnan14,15,16,17,18, 19. dessa studier avslöja en mer definierad pericytic aktivitet med större kapillär-fria områden i den vuxna jämfört med den neonatala näthinna14.
Ett annat sätt att visualisera är den retinala mikrocirkulation efter hypoton isolering. Denna vävnad förberedelse teknik resulterar i näthinnans blodkärl och kapillärer att vara befriad från de neuronala cellerna. Denna typ av tvådimensionell avbildning av det isolerade retinal vaskulär nätverket är vanligtvis utförs efter retinal trypsin matsmältningen20 och används för att bedöma de vaskulära avvikelserna av diabetesretinopati inklusive pericyt förlust och kapillär degeneration20,21,22. Metoden hypoton isolering erbjuder utredningarna av retinala vaskulära genen och protein reglerande svaren som de har gjorts med RT-PCR och western blotting23,24,25. Vi ger här ett protokoll för den fri-float immunhistokemisk färgning av den hypoton isolerade retinala blodkärlen som ett alternativ till trypsin matsmältningen att undersöka de mikrovaskulära pericyter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Geletin from porcine skin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">G2625-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5253-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D5025-15KU</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:165px;">0332-100G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Normal donkey serum</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">017-000-121, lot 129348</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Rabbit anti-PDGFR&#946;</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:165px;">sc-432</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Mouse anti-NG2</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:165px;">ab50009</td>
			<td style="width:171px;">1:500</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-585-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-095-151</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-225-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-165-150</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D9542-1MG</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:165px;">154526</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes

Retinal pericyter har en viktig roll vid många sjukdomar i ögat. Immunohistokemisk färgningsteknik av retinala kärl och mikrovaskulära är pericyter centrala för oftalmologisk forskning. Det är viktigt att välja en lämplig metod att visualisera de mikrovaskulära pericyter. Vi beskriver retinal mikrovaskulära pericyt immunhistokemisk färgning i cryo-avsnitt, hela-fästen och hypoton isolerade vaskulatur använder antikroppar för trombocyt-härrör tillväxtfaktor receptor β (PDGFRβ) och nerv/gliaceller antigen 2 (NG2). Detta tillåter oss att belysa fördelar och brister av varje av de tre vävnad förberedelserna för visualisering av den retinala mikrovaskulära pericyter. Cryo-avsnitten ger transsectional visualisering av alla retinala lager men innehåller endast några enstaka tvärgående nedskärningar av mikrocirkulation. Hela-mount ger en översikt över den hela retinala kärl, men visualisering av mikrocirkulation kan vara besvärande. Hypoton isolering ger en metod för att visualisera den hela retinala blodkärlen genom avlägsnande av neuronala celler, men detta gör vävnaden mycket bräcklig.

De framgångsrika protokollen ger tre olika retinala preparat för att visualisera mikrovaskulära pericyter. Dessa metoder använder PDGFRβ och NG2 immunoreaktivitet samtidig lokaliseringen och den pericyter att linda runt den kapillära endotel foridentification unika ställning.
Med kryo-sektioner, neuronala skikten kan identifieras av fluorescerande tätheten av DAPI-märkt kärnor och inre och djupa kapillär plexuses inne...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Vi visar tre tekniker för beredning av olika vävnad för immunhistokemiska visualisering av råtta retinal mikrovaskulära pericyter, dvs cryo-avsnitt, hela-fästen och hypoton isolering av vaskulära nätverket.

Retinal Cryo-sektioner, hela-fästen och hypoton isolerade vaskulatur förberedelserna inför immunhistokemisk visualisering av mikrovaskulära pericyter

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Dessa metoder kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom oftalmologi området såsom pericyte spridning eller migration. Den största fördelen med dessa förfarande är att de ger en mängd olika visualiseringsalternativ. Demonstrerar procedurerna blir Karin Dreisig och Frank W.Blixt, två post-docs på vårt laboratorium.För att ytterligare sleva ögat, använd först en skalpell för att göra den bakre och främre slitsar på cirka 0,5 centimeter i råttögonlocket. Greppa ögat med tensor och luta försiktigt åt sidan för att exponera den omgivande vävnaden. Aucleate ögat genom att göra nedskärningar med dissekering sax i bindväv och muskulös vävnad.Kort placera ögat i 4%formaldehyd och fosfat-buffrad saltlösning i en till två minuter. Skölj kort i natriumbuffert innan du gör ett hål vid hornhinnans limbus genom att applicera lätt tryck med spetsen på en skalpell. Skär längs hornhinnans limbus med dissekering sax för att ta bort hornhinnan och linsen med tång.Submerge återstående vävnad med näthinnan i 4%formaldehyd i PBS i två till fyra timmar. Kryoskydda vävnaden genom att fördjupa sig i Sorensons fosfatbuffert innehållande 10%sackaros och därefter 25%sackaros. Överför vävnaden när den har sjunkit till behållarens botten.Bädda in i Yazulla medium beredd med 3%gelatin från svin hud och 30%albumin från kyckling äggvita. Därefter skär 10-micron vertikala kryosektioner av gelatin-inbäddade näthinnan genom att synnerven. Placera kryosektionerna på en glasrutschkana och låt torka i minst en timme.När du är torr, dränka du ned objektglaset i PBS med 0,25%Triton-X 100 i 15 minuter. Droppa sedan en blandning av 1:100 PDGF-receptorbeta och 1:500 NG2 primära antikroppar i PBST och 1%BSA på kryosektionen och placera i en fuktig kammare vid fyra grader Celsius över natten. Nästa dag tvätta sektionerna genom att fördjupa bilden i PBST två gånger i 15 minuter varje gång.Droppa sedan en blandning av 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594-länkade och 1:100 Anti-Rabbit FITC-länkade sekundära antikroppar utspädda i PBST med 3%BSA på kryosektionerna och inkubera i en timme i mörker. Efter inkubationen sköljer du glasrutschkanan i PBST två gånger i 15 minuter varje gång. Montera de färgade kryosektionerna med anti-blekning monteringsmedium som innehåller DAPI och ett täckskydd.En andra retinal vävnad förberedelseteknik är hela-mount. Efter avlägsnandet av hornhinnan, använd små öppningsrörelser av tivnim för att separera näthinnan från näthinnans pigmentepitel mot synnerven. Befria näthinnan vid synnerven med dissekeringssax och gör tre till fyra slitsar av några millimeters'length från näthinnans periferi mot synnervens huvud.Sprid näthinnan på en glasrutschkana och låt torka i fem till 10 minuter. Droppa 4%formaldehyd på näthinnan och fixa i 20 till 30 minuter. Efter fixering, skölj med PBS.För optimalt resultat, immunstain direkt efter sköljning. Droppa först PBST på hela-fästet och inkubera i rumstemperatur i 15 minuter. Häll av PBST, tillsätt sedan den primära antikroppslösningen och inkubera i en fuktig kammare vid fyra grader Celsius över natten.Nästa dag, häll av den primära antikroppen och droppa på PBST för att skölja näthinnan två gånger i 15 minuter varje gång. Efter att ha hällt av den andra tvätten, droppa sekundär antikroppslösning på näthinnan och inkubera i en timme i en fuktig kammare vid rumstemperatur i mörkret. Efter den sekundära antikroppsinkubationen, tvätta två gånger med PBST som tidigare.Montera det färgade helfästet med anti-blekning monteringsmedium som innehåller DAPI och en täcksli. Alternativ till helmontage näthinnan, den näthinnan vasculature kan isoleras av hypotoni isolering. Först placera näthinnan i en milliliter av avjoniserat vatten i en 24-brunnsplatta och skaka vid 200 rpm med en 1,5-millimeters vibrationsbana i en timme vid rumstemperatur, tillsätt sedan 200 enheter av DNAse 1 för att dissociera den lystna cellskräp från näthinnans vasculature och skaka i ytterligare 30 minuter vid rumstemperatur.Skölj näthinnan i avjoniserat vatten i tre gånger i fem minuter vardera med skakning på 150 till 300 rpm för att ta bort neuronala cellskräp. Näthinnan bör bli mer transparent med varje sköljning, vägledande för avlägsnande av neuronala cellulära skräp. Efter sköljning, fixera näthinnan i en milliliter av 4%paraformaldehyd och PBS i 10 minuter vid rumstemperatur.Skölj med PBS tre gånger. Om man fortsätter till immunfärgning, blockera hypoton-isolerade vasculature med 500 mikroliter av 10%åsna serum utspädd i PBS i en timme med skakningar vid 100 rpm. Efter blockering, inkubera näthinnan över natten i 600 mikroliter av primär antikroppslösning bestående av 1:100 PDGF-receptor beta och 1:500 NG2 primära antikroppar utspädd i 10%åsneserum och PBS.Nästa dag, skölj näthinnans nätverk tre gånger i PBS i fem minuter varje gång, sedan inkubera i 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594th-linked och 1:100 Anti-Rabbit FITC-länkade sekundära antikroppar, utspädd i 10%åsneserum och PBS med skakning vid 100 rpm vid rumstemperatur i en timme i mörkret. Efter en fem minuters tvätt i PBST, inkubera i 0,2 nanogram per milliliter DAPI och PBST i 15 minuter. Tvätta tre gånger i fem minuter med PBST samtidigt som den är skyddad mot ljus.Därefter skär spetsen på en plast Pasteur pipett. Ta bort vassa kanter med hjälp av en pipettspets, och fukta Pasteurpipett med PBST, sedan aspirera retinal vasculature i pipetten och dispensera i en fyra-väl glaskammare glida. Fuktningssteget är viktigt för att undvika att näthinnevasculaturen fastnar på insidan av Pasteurpipetten.Placera retinalvaskulaturen genom att luta kammaren glida fram och tillbaka. Ta bort mediet från brunnarna i kammaren slide. Vätskans ytspänning kommer att platta ut vasculaturen på undersidan av bilden.Om det behövs, droppdroppar av vätska på retinal vasculature att veckla ut. Säkerställ korrekt utfällning under mikroskop innan du tar bort plast brunnarna från kammaren bilden. Montera den färgade vasculaturen med anti-blekning monteringsmedium och en täcksli.NG2 immunohistokemi avslöjar positiva fartyg inom den inre delen av näthinnan. Pilar indikerar cirkulär och hästskoformad immunoreaktivitet i kärlen. Pilspetsen pekar ut ett längsskuret kärl.PDGF-receptor beta immunohistokemi visar liknande immunoreactivity till NG2. Återigen pilarna och pilspetsen indikerar immunoreactivity i kärlen. Denna bild visar en sammanfogning av NG2 i grönt, PDGF-receptor beta i rött, och DAPI i blått.Genom att lägga de tre olika filtren ovanpå, det avslöjas att NG2 och PDGF-receptor beta är co-lokaliserade. Denna bild visar en immunsed hela-montera förberedelse med NG2 färgning i rött. Immunoreaktivitet syns längs det ytliga vaskulära nätverket med intensiv färgning i abluminala pericyter.De neuronala cellerna är synliga som DAPI blå kärnor mellan NG2-färgade microvasculature. Denna bild visar hypoton isolerade råtta retinal vaskulär nätverk färgas med NG2 i grönt och PDGF-receptor beta i rött. Det kompletta nätverket visade NG2-immunoreactivity.PDGF-receptor beta immunoreactivity hittades i cell somas. Vid högre förstoring är det tydligt att PDGF-receptor betafärgning endast ses i cell somas i kärlnätet, vilket indikerar pericytimreaktivitet. Inklusive DAPI färgning tillsammans med NG2 och PDGF-receptor beta avslöjar tre pericytes i två odefinierade fartyg väggceller i denna hög förstoring bild.Efter dessa förfaranden, andra immunostainings som glatt muskulatur cell eller endotelfärgningar kan användas för att besvara ytterligare frågor. Till exempel, hur celler i retinal vasculature ser efter ischemi?

Research

JoVE Journal

Biology

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Tunna Sektionering av Slice Förberedelser för Immunohistokemi

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

Använda Laser pincett för att manipulera enstaka nervceller i Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Hela montering Immunhistokemisk Analys för Embryonala Limb Skin kärlsystemet: ett modellsystem för studier Vascular Avgrening morfogenes i Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analys av embryonala och Larvernas Zebrafish Skelett myofibers från Dissocierade Förberedelser

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Optimerad Protokoll för Retinal Wholemount Förberedelse för Imaging och Immunohistokemi

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytologisk analys av Spermatogenesen: Live och fasta Beredningar av<em&gt; Drosophila</em&gt; Testiklar

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Kartläggning av motilitet i<em&gt; Ex vivo</em&gt; Förberedelser tarm

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Förbättrad Swiss-rullande Teknik för tarmvävnad Förberedelse för immunhistokemisk och immunofluorescens Analyser

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Mäta endoreduplikation av flödescytometri av isolerade Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

En Ex Vivo Choroid Sprouting Assay av okulär Microvascular Angiogenesis

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...