Name: retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

Araştırma Lundbeck Vakfı, Danimarka tarafından finanse edildi.

İletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş ve yetişkin erkek albino sıçanlar üzerinde gösterdi. Tüm deneysel yordamlar, hayvan hayvanlar kullanım Ophthalmic ve vizyon araştırma için ARVO deyimi düzenlemeye göre tedavi edildi. Hayvanlar karbon dioksit ve sonraki servikal çıkığı tarafından euthanized.
1. fare Retina doku hazırlıkları
<ol><li>
Cryo-bölüm
	<ol>
<li>Arka ve ön ~0.5 cm yırtmaçlı, sıçan göz kapağı bir neşter ile yapmak.<ol>
<li>İ...

<ol>
	<li>Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+Breaking+the+barrier.">Diabetic retinopathy: Breaking the barrier.</a> Pathophysiology. , (2017).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+Brain+Injury+and+Repair+After+Ischemic+Stroke.">Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke.</a> Translational Stroke Research. , (2016).</li><li>Trost, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+and+Retinal+Pericytes:+Origin,+Function+and+Role.">Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).</li><li>Ramos, D., Lagali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Confocal+Laser+Microscopy+to+Analyze+Mouse+Retinal+Blood+Vessels.">The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels.</a> Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).</li><li>Moran, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+cross+talk+in+diabetic+retinopathy:+Pathophysiological+roles+and+therapeutic+implications.">Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).</li><li>Henkind, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+the+peripapillary+retina.">Microcirculation of the peripapillary retina.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte?.">What is a pericyte?.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36, 451-455 (2016).</li><li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+Characterization+of+Retina+Neuroglia+Modifications+in+Diabetic+Zucker+Diabetic+Fatty+Rats.">Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).</li><li>Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characteristics+of+the+retinal+and+choroidal+vasculature.">Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).</li><li>Allen, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity+of+middle+cerebral+artery+occlusion+determines+retinal+deficits+in+rats.">Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats.</a> Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).</li><li>Kyhn, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+retinal+ischemia+caused+by+controlled+low+ocular+perfusion+pressure+in+a+porcine+model.+Electrophysiological+and+histological+characterisation.">Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation.</a> Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).</li><li>Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+CGRP+and+its+receptor+components+CLR+and+RAMP1+in+the+rat+retina.">Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina.</a> Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).</li><li>Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renin-angiotensin+system+and+the+developing+retinal+vasculature.">The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).</li><li>Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+and+characterization+of+putative+mesenchymal+stem+cell+markers+in+the+retinal+capillary+network+of+rodents.">Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents.</a> Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).</li><li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier.">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nature Communications. 8, 15296 (2017).</li><li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo.">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).</li><li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+injection+of+the+heparin+analog+5-amino-2-naphthalenesulfonate+reduces+retinal+neovascularization+in+mice.">Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice.</a> Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).</li><li>Higgins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diltiazem+reduces+retinal+neovascularization+in+a+mouse+model+of+oxygen+induced+retinopathy.">Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy.</a> Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).</li><li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model.">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).</li><li>Hazra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+X+receptor+modulates+diabetic+retinopathy+outcome+in+a+mouse+model+of+streptozotocin-induced+diabetes.">Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes.</a> Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).</li><li>Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antioxidant+gene+therapy+on+the+development+of+diabetic+retinopathy+and+the+metabolic+memory+phenomenon.">Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+degradation+of+VE-cadherin+alters+the+blood-retinal+barrier+in+diabetes.">Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes.</a> Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).</li><li>Gustavsson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+cellular+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+expression+in+mice+retinal+vessels+is+affected+by+both+hyperglycemia+and+hyperlipidemia.">Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia.</a> PLoS One. 5, e12699 (2010).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+retinal+trilaminar+vascular+network.">Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network.</a> Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).</li></ol>

Biz mikrovasküler Retina perisitlerden çalışmada uygulanan üç Retina hazırlama teknikleri mevcut. Aşağıda, yöntemlerinden her birinin arasında bir karşılaştırma sağlamak ve protokolleri kritik adımlar vurgulayın.
Cryo kesit ile retina sagittal bölümlerde kesilir ve bu nedenle, çok sayıda numune aynı retina elde etmek mümkün. Bu yöntemin sonucu sayısal bölümlerde antikor özgüllük ve gereksiz hayvan kurban engeller olarak titrasyon testi için ideal bir seçim ya...

Bu hücreler damarlara bütünlük içinde önemli bir rol oynamak gibi Retina perisitlerden birçok araştırma laboratuvarları odaklanmıştır. Diyabetik retinopati1, iskemi2ve glokom3 gibi patolojik durumların perisitlerden fonksiyonu içeren vasküler özellikleri vardır. Perisitlerden iç retinal kapiller plexuses bulunur. Kapiller plexuses iki kat iç retina malzemeleri santral retinal arter dalları. İç vasküler yatağın ganglion hücre ve iç nükleer katmanları arasında yer almaktadır. Daha derin tabaka daha yoğun ve karmaşık ve iç ve dış nükleer katmanlar4,5arasında yerelleştirilmiştir. Buna ek olarak, retinanın bazı bölümlerinin de radyal parapapillary kılcal olarak adlandırdığı bir üçüncü ağ içerir. Bunlar uzun, düz kılcal damarlar, sinir lifleri arasında ve nadiren başka bir veya diğer iki plexuses6ile anastomose. Kapiller duvarı içinde perisitlerden membran içinde gömülü ve vasküler endotel hücrelerinin abluminal yan hat.
Bu tarihe kadar bunları diğer vasküler hücrelerden ayırt bu perisitlerden hiçbir benzersiz biyolojik işaret vardır. Trombosit-türevi büyüme faktörü reseptör β (PDGFRβ) ve sinir/gliyal antijen 2 (NG2) yaygın olarak kullanılan işaretleri olan perisitlerden ama aynı zamanda diğer damar hücreleri üzerinde mevcut vardır. Perisitlerden tanımlaması daha fazla Morfoloji ve protein ifade7' farklılık pericyte alt kümeleri varlığını tarafından karmaşıktır. Şu anda, en iyi kimlik protein işaretleri bir arada ve damar duvarındaki pericyte karakteristik konumlandırma yararlanır. Biz burada sıçan retina mikrovasküler perisitlerden, yani, cryo-bölümler, Bütün bağlar ve damar ağının hipotonik yalıtım PDGFRβ/NG2 immunohistokimyasal boyama için üç farklı doku hazırlama teknikleri göstermek.
Cryo-bölümleri ile retina ve sklera ile optik sinir kesilir. Bu nöronların tüm katmanlı yapılar görselleştirme için sağlar. Retina farklı on kat hematoksilen eozin veya floresan nükleer 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8gibi lekeleri ile görüntülenmiştir nükleer ve aksonal/dendritik yapıları değişiminin olarak görünür. Katmanlar9 ve bu metabolik gereksinimleri farklıdır belirli bir katmanı kalınlığı veya toplam yokluğunda belirlemek için bir yöntem sağlar (Örneğin, Retina ganglion hücrelerinin kaybı biridir retinal iskemi10, işaretlerinden 11). Ayrı ayrı çalışma içinde anılan sıraya göre Retina katmanları12,13kapiller plexuses edinerek retina ile enine keser gibi damarlara belirgindir.
Daha geleneksel olarak, Retina damarlara ağ araştırmalar Retina bütün-dağ içinde gerçekleştirilir. Bu doku hazırlık ile retina kesme ve bir çiçek şeklindeki yapı olarak basık. Genel mimari Retina damarlara vurgulayabilirsiniz nispeten hızlı doku Hazırlama tekniği yöntemidir ve bu nedenle kez fare retina neovaskülarizasyon soruşturma uygulanır. Bütün Monte Retina microvasculature başarılı görselleştirme aynı zamanda gelişmekte olan yenidoğan fare ve sıçan retina14,15,16,17,18, bildirilmektedir 19. bu çalışmalar geniş kılcal içermeyen alanlar yenidoğan retina14' e göre yetişkin bir daha tanımlı pericytic aktivitesiyle ortaya koyuyor.
Görselleştirmenin başka bir retina microvasculature sonra hipotonik yalıtım yoludur. Bu doku hazırlama teknik retinal kan damarları ve kılcal nöronal hücrelerin serbest bırakılması ile sonuçlanır. İki boyutlu görüntüleme izole retinal damar ağının bu tür genellikle Retina tripsin sindirim20 sonra gerçekleştirilen ve diyabetik retinopati dahil pericyte kaybı ve kılcal damar anormallikleri değerlendirmek için kullanılan dejenerasyon20,21,22. Onlar yapılmıştır gibi RT-PCR ve western Blot23,24,25ile hipotonik yalıtım yöntemini retinal vasküler gen ve protein düzenleyici yanıt araştırmalar sunuyor. Burada ücretsiz-float immunohistokimyasal hipotonik izole Retina damarlara tripsin sindirim mikrovasküler perisitlerden incelemek için bir alternatif olarak boyama için bir protokol sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Geletin from porcine skin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">G2625-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">A5253-500G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D5025-15KU</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:165px;">0332-100G</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Normal donkey serum</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">017-000-121, lot 129348</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Rabbit anti-PDGFR&#946;</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:165px;">sc-432</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Mouse anti-NG2</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:165px;">ab50009</td>
			<td style="width:171px;">1:500</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-585-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-095-151</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">711-225-152</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:165px;">715-165-150</td>
			<td style="width:171px;">1:100</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:165px;">D9542-1MG</td>
			<td style="width:171px;">Dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Anti-fading mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:165px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:392px;">Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:165px;">154526</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes

Retina perisitlerden, göz birçok hastalıkları için önemli bir rol oynamaktadır. İmmunohistokimyasal teknikler retina damarları ve mikrovasküler boyama perisitlerden Oftamolojik araştırma merkezi. Mikrovasküler perisitlerden görüntülenmesi uygun bir yöntem seçmek çok önemlidir. Cryo-bölümlerde, Bütün bağlar ve antikorlar trombosit-türevi büyüme faktörü reseptör β (PDGFRβ) ve sinir/gliyal antijen 2 (NG2) için kullanma hipotonik izole damarlara boyama Retina mikrovasküler pericyte immunohistokimyasal açıklar. Bu avantajları ve her Retina mikrovasküler perisitlerden görselleştirme üç doku hazırlıkları eksikliklerin vurgulamak için bize izin verir. Cryo-bölümler tüm Retina katmanları transsectional görselleştirme sağlar ancak yalnızca bir kaç ara sıra enine keser microvasculature içerir. Bütün Dağı tüm Retina damarlara genel bir bakış sağlar, ancak microvasculature görselleştirme zahmetli olabilir. Hipotonik yalıtım nöronal hücre kaldırma tarafından tüm Retina damarlara görselleştirmek için bir yöntem sağlar, ancak bu doku çok kırılgan yapar.

Başarılı iletişim kuralları mikrovasküler perisitlerden görüntülenmesi için üç farklı Retina hazırlıklar sağlar. Bu yöntemlerin her biri PDGFRβ ve NG2 immunoreactivity Co yerelleştirme ve kapiller endotel foridentification sarın perisitlerden benzersiz konumunu kullanır.
Cryo-kesitler, nöronal katmanları DAPI etiketli çekirdeği ve iç floresan yoğunluğu tarafından belirlenebilir ve derin kapiller plex...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes at JoVE.

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Biz üç farklı doku hazırlama teknikleri immunohistokimyasal görselleştirme sıçan retina mikrovasküler perisitlerden, Yani, soğutucu bölümü, Bütün bağlar ve damar ağının hipotonik yalıtım için göstermek.

Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Bu yöntemler, perisit çoğalması veya göç gibi oftalmoloji alanındaki temel soruların yanıtlatMasına yardımcı olabilir. Bu yordamın en büyük avantajı, çeşitli görselleştirme seçenekleri sağlamalarıdır. Prosedürleri gösteren Karin Dreisig ve Frank W.Blixt, laboratuarımızda iki doktora sonrası olacak.Gözü enükleye için, ilk fare göz kapağında yaklaşık 0,5 santimetre arka ve ön yarıklar yapmak için bir neşter kullanın. Forceps ile göz kapmak ve çevreleyen doku ortaya çıkarmak için yan dikkatlice eğim. Bağ ve kas dokusunda diseksiyon makasla kesikler yaparak gözü enükleaz.Kısaca 4% formaldehit ve fosfat tamponlu tuzlu bir ila iki dakika için göz yerleştirin. Neşter ucu ile hafif basınç uygulayarak kornea limbus bir delik yapmadan önce sodyum tampon kısa bir süre durular. Kornea ve lensi forceps ile çıkarmak için diseksiyonu makasla kornea ekstremitesi boyunca kesin.PBS'de %4 formaldehitte kalan dokuyu retina ile 2-4 saat batırın. Kriyo-% 10 sakaroz ve daha sonra% 25 sakaroz içeren Sorenson fosfat tampon daldırma tarafından doku koruyun. Kabın dibine battıktan sonra dokuyu aktarın.Yazulla orta domuz derisinden% 3 jelatin ve tavuk yumurta beyazı% 30 albumin ile hazırlanan embed. Sonra, jelatin gömülü retinanın 10 mikronluk dikey kriyokesitlerini optik sinire doğru kesin. Bir cam slayt üzerine kriyokes yerleştirin ve en az bir saat kurumasını bekleyin.Kurutuldıktan sonra, slaytı PBS'de %0,25 Triton-X 100 ile 15 dakika batırın. Daha sonra, 1:100 PDGF reseptör beta ve PBST 1:500 NG2 primer antikorlar ve kriyokesit üzerine% 1 BSA bir karışımı damla ve dört derece santigrat bir gecede nemli bir odada yer. Ertesi gün, her seferinde 15 dakika boyunca pbst'a iki kez kaydırağı batırarak bölümleri yıkayın.Sonra 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594 bağlı ve 1:100 Anti-Rabbit FITC bağlı ikincil antikorlar kriyozeksiyon üzerine% 3 BSA ile PBST seyreltilmiş ve karanlıkta bir saat kuluçka karışımı damla. Kuluçkadan sonra, PBST'deki cam kaydırağı her seferinde 15 dakika boyunca iki kez durulayın. DAPI ve coverslip içeren solma önleyici montaj ortamı ile lekeli kriyokesitler monte edin.İkinci bir retina doku hazırlama tekniği tam montaj. Korneanın çıkarılmasından sonra, retinayı retina pigment epitelinden optik sinire doğru ayırmak için çerofmaların küçük açılış hareketlerini kullanın. Diseksiyonu makasları ile optik sinir de retina serbest ve optik sinir kafasına doğru retina periferik birkaç milimetre uzunluğunda üç ila dört kez yapmak.Retinayı cam bir kaydıranın üzerine yayın ve 5-10 dakika kurumasını bekleyin. Retinaya %4 formaldehit damlatın ve 20-30 dakika düzeltin. Fiksasyondan sonra PBS ile durula.Optimal sonuçlar için, durulama dan sonra doğrudan immünoleme. İlk olarak, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında tüm montaj ve kuluçka üzerine PBST damla. PBST dökün, sonra birincil antikor solüsyonu ekleyin ve bir gecede dört derece santigrat nemli bir odada kuluçka.Ertesi gün, birincil antikor dökün ve PBST üzerine damla iki kez 15 dakika her zaman retina yıkar. İkinci yıkamadan sonra, ikincil antikor solüsyonu retinaya damlatın ve karanlıkta oda sıcaklığında nemli bir odada bir saat kuluçkaya yatırın. İkincil antikor inkübasyonunu takiben, pbst ile daha önce olduğu gibi iki kez yıkayın.DAPI ve bir kapak slip içeren anti-solma montaj ortamı ile lekeli tüm montaj monte. Retinanın tam montajAlternatif, retinal vaskülatür hipotonik izolasyon ile izole edilebilir. İlk olarak, retinayı 24 kuyulu bir plakaya bir mililitre deiyonize su koyun ve oda sıcaklığında bir saat boyunca 1,5 milimetrelik titreşim yörüngesi ile 200 rpm sallayın, sonra retinal vaskülatürden lysed hücre enkaz ayrıştırmak ve oda sıcaklığında başka bir 30 dakika sallamak için DNAE 1 200 birim ekleyin.Nöronal hücre enkazkaldırmak için 150-300 rpm sallayarak beş dakika boyunca üç kez deiyonize suda retina durulayın. Retina her durulama ile daha şeffaf hale gelmelidir, nöronal hücresel enkaz kaldırılması göstergesi. Duruladıktan sonra retinayı %4 paraformaldehit ve PBS mililitresinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca düzeltin.PBS ile üç kez durulayın. İmmünostaining devam ediyorsanız, 100 rpm sallayarak bir saat pbs seyreltilmiş% 10 eşek serumu% 100 mikrolitre ile hipotonik izole vaskülatür blok. Bloke edildikten sonra retinayı bir gecede 1:100 PDGF-reseptör betası ve 1:500 NG2 primer antikorlardan oluşan 600 mikrolitre primer antikor çözeltisinde kuluçkaya yatırın ve %10 eşek serumu ve PBS ile seyreltilir.Ertesi gün, her seferinde beş dakika PBS retinaağı üç kez durulayın, sonra 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594 bağlı ve 1:100 Anti-Rabbit FITC bağlı ikincil antikorlar kuluçka, 10% eşek serum ve PBS seyreltilmiş 100 rpm oda sıcaklığında bir saat boyunca oda sıcaklığında sallayarak. PBST'de beş dakikalık bir yıkamanın ardından mililitre başına 0,2 nanogram DAPI ve PBST'yi 15 dakika kuluçkaya yatırın. PBST ile ışıktan korunurken beş dakika boyunca üç kez yıkayın.Sonra, plastik bir Pasteur pipet ucunu kesin. Bir pipet ucu kullanarak keskin kenarları çıkarın ve PBST ile Pasteur pipet nemlendirin, sonra pipet içine retinal vaskülatür aspire ve dört kuyucam oda slayt içine dağıtmak. Nemlendirici adım Pasteur pipet ilerletinin içine yapışan retinal vaskülatür önlemek için önemlidir.Oda slaytını ileri geri yatırarak retinal vaskülatürü yerleştirin. Hazne deki boşluğun kuyularından ortayı çıkarın. Sıvının yüzey gerilimi, vaskülatürü slaytın altına düzleştirmekolacaktır.Gerekirse, açılmak için retinal vaskülatür üzerine sıvı damla damla. Plastik kuyuları hazne kaydırağından çıkarmadan önce mikroskop altında doğru açılmayı sağlayın. Lekeli vaskülatürü, solma önleyici montaj ortamı ve bir kapak fişi ile monte edin.NG2 immünohistokimya retinanın iç kısmında pozitif damarları ortaya çıkarır. Oklar damarlarda dairesel ve at nalı şeklinde immünoreaktivite gösterir. Ok ucu, uzunlamasına kesilmiş bir damarı işaret ediyor.PDGF-reseptör beta immünohistokimyang2 benzer immünoreaktivite gösterir. Yine oklar ve ok ucu damarlarda immünoreaktivite gösterir. Bu resim, ng2'nin yeşil, PDGF-reseptör betasının kırmızı ve DAPI'nin mavi ile birleştirilmesini göstermektedir.Üç farklı filtrenin üst üste bindirilerek NG2 ve PDGF-reseptör betasının birlikte lokalize olduğu ortaya çıkar. Bu resim, kırmızı NG2 boyama ile bir immünostained tüm montaj hazırlık gösterir. İmmünreaktivite abluminal perisitlerde yoğun boyama ile yüzeysel vasküler ağ boyunca görülebilir.Nöronal hücreler NG2 lekeli mikrovaskülatür arasında DAPI mavi çekirdekleri olarak görülebilir. Bu görüntü, yeşil ve PDGF-reseptör beta sında NG2 ile boyanmış hipotonik izole sıçan retinal vasküler ağ kırmızı gösterir. Tüm ağ NG2-immünoreaktivite gösterdi.Hücre somalarında PDGF-reseptör beta immünoreaktivitesi bulundu. Daha yüksek büyütmede, PDGF-reseptör beta boyamanın sadece vasküler ağdaki hücre somlarında görüldüğü ve perisit immünreaktivitesini gösteren bir durum olduğu açıktır. NG2 ve PDGF-reseptör beta ile birlikte DAPI boyama dahil bu yüksek büyütme görüntü iki tanımlanmamış damar duvar hücrelerinde üç perisit ortaya koymaktadır.Bu işlemlerden sonra, düz kas hücresi veya endotel lekeleri gibi diğer immünboyamalar ek sorulara cevap vermek için kullanılabilir. Örneğin, retinal vaskülatürdeki hücreler iskemi sonrası nasıl görünür?

Research

JoVE Journal

Biology

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Dilim İmmünohistokimya için hazırlıklar İnce Kesit

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

In Vitro İzole Nöronlar kurgulama için Lazer Cımbız

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Disosiye Müstahzarlar gelen Embriyonik ve larval Zebra balığı İskelet myofibers Analizi

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Hareketliliği zamanmekansal Haritalama içinde<em&gt; Ex Vivo</emBağırsakların&gt; Hazırlıklar

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Immünohistokimyasal ve immünofloresan Analizleri için Bağırsak Doku Hazırlama için geliştirilmiş Swiss-haddeleme Tekniği

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication izole yumru önceki Akış Sitometresi tarafından ölçme

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Oküler Mikrovasküler Anjiyogenezin Ex Vivo Koroid Filizlenme Satomu

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...