Name: evaluating the role of mitochondrial function in cancer-related fatigue
Uploaded: 2018-05-17T12:30:00
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Este estudo é totalmente suportado pela divisão de pesquisa Intramural do Instituto Nacional de enfermagem pesquisas de NIH, Bethesda, Maryland.

O estudo atual (NCT00852111) foi aprovado por institucional Review Board (IRB) do National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland. Os participantes inscritos no presente estudo foram homens euthymic, 18 anos de idade ou mais velhos, que foram diagnosticados com câncer de próstata não-metastático, com ou sem prévia prostatectomia e estava programado para receber a terapia de radiação de feixe externo (RT). Potenciais participantes foram excluídos se eles tinham uma doença progressiva que pode causar fadig...

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	<li>Berger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Related+Fatigue,+Version+2.2015.">Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).</li><li>Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+phenotyping+approaches+lead+to+dissimilar+biologic+profiles+in+men+with+chronic+fatigue+following+radiation+therapy.">Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).</li><li>Feng, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Predictors+of+Fatigue+in+Men+With+Non-Metastatic+Prostate+Cancer+Receiving+External+Beam+Radiation+Therapy.">Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy.</a> Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).</li><li>Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploratory+Investigation+of+Early+Biomarkers+for+Chronic+Fatigue+in+Prostate+Cancer+Patients+Following+Radiation+Therapy.">Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy.</a> Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).</li><li>Myhill, S., Booth, N. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+peripheral+blood+mononuclear+cells+be+used+as+a+proxy+for+mitochondrial+dysfunction+in+vital+organs+during+hemorrhagic+shock+and+resuscitation.">Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation.</a> Shock. 40 (6), (2013).</li><li>Ijsselmuiden, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+white+blood+cells+and+platelets+amplify+oxidative+stress+in+heart+failure.">Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure.</a> Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).</li><li>Kong, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+mitochondrial+alterations+after+cardiac+surgery+involving+cardiopulmonary+bypass:+Clinical+correlations.">Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations.</a> Shock. 21 (4), 315-319 (2004).</li><li>Straub, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+and+immune+system+prompt+energy+shortage+in+chronic+inflammation+and+ageing.">The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).</li><li>Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetics+of+immune+cells+to+assess+rheumatic+disease+activity+and+efficacy+of+glucocorticoid+treatment.">Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 62 (2), 133-139 (2003).</li><li>Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. 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K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).</li><li>Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+characterization+of+polarized+M1+and+M2+bone+marrow-derived+macrophages+using+real-time+extracellular+flux+analysis.">Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).</li><li>Boutagy, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).</li><li>Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fatigue+and+other+anemia-related+symptoms+with+the+Functional+Assessment+of+Cancer+Therapy+(FACT)+measurement+system.">Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 13 (2), 63-74 (1997).</li><li>Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+important+differences+were+estimated+for+six+Patient-Reported+Outcomes+Measurement+Information+System-Cancer+scales+in+advanced-stage+cancer+patients.">Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients.</a> Journal of Clinical Epidemiology. 64 (5), 507-516 (2011).</li><li>Kang, J. -. G., Wang, P. -. y., Hwang, P. M., Galluzzi, L., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 542, 209-221 (2014).</li><li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).</li><li>Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+determination+of+cell+number+using+the+CyQUANT&#174;+cell+proliferation+assay.">Sensitive determination of cell number using the CyQUANT&#174; cell proliferation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).</li><li>Hartman, M. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+of+mitochondrial+oxygen+consumption+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+vascular+function+in+type+2+diabetes+mellitus.">Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus.</a> Vascular Medicine. 19 (1), 67-74 (2014).</li></ol>

Fadiga em pacientes com câncer é uma condição debilitante que não está bem definida ou caracterizada1. Diagnóstico da fadiga depende inteiramente subjetivo relatórios e não há nenhum padrão atual de diagnóstico ou tratamento para essa condição, em grande parte devido à falta de entendimento em sua Patobiológico2. Dos propostos mecanismos subjacentes fadiga em pacientes com câncer, deficiência na função mitocondrial é uma das vias mais terapeuticamente t...

A fadiga é uma condição prevalente e angustiante que tem um impacto negativo sobre a qualidade de vida dos pacientes de câncer1. Até esta data, fadiga de câncer permanece mal definida e depende apenas de comunicação subjetiva pelos pacientes2. Portanto, há uma necessidade urgente de identificar um teste de laboratório de diagnóstico facilmente adaptável para caracterizar objectivamente fadiga no ambiente clínico3,4.
Vários mecanismos subjacentes, incluindo disfunção da mitocôndria, têm sido propostos para causar fadiga5. As mitocôndrias são as organelas de potência, fornecendo a 95% das necessidades de energia celular através da fosforilação oxidativa e desempenham um papel importante na sinalização de cálcio, apoptose, sinalização imune e regulamento de outros de eventos de sinalização intracelular6 . Da mesma forma, prejudicada bioenergética mitocondrial e defeitos na produção de energia podem contribuir para fadiga. Apoiam esta hipótese, estudos anteriores observaram mutações no DNA mitocondrial em pacientes com síndrome de fadiga crônica7. Enquanto isso ainda não está claro se a origem fisiopatológico da fadiga encontra-se dentro do sistema nervoso central ou periféricos tecidos, como músculos esqueléticos8,9, não existe actualmente nenhum método directo para avaliar com precisão disfunção mitocondrial relacionada à fadiga em células vivas, desoxigenadas.
Usando células mononucleares de sangue periférico (PBMC) para estudar a função mitocondrial oferece várias vantagens. Primeiro, PBMCs estão prontamente disponíveis na prática clínica usando flebotomia padrão e podem ser isolados rapidamente utilizando técnicas básicas de laboratório. Em segundo lugar, coleta de sangue é menos invasiva do que a coleta de outros tecidos como uma biópsia muscular. Assim, amostras de sangue podem ser coletadas do paciente mesmo várias vezes ao longo do tempo, o que facilita a avaliação longitudinal dos efeitos do tratamento. Curiosamente, função mitocondrial em PBMCs aparenta ser bem correlacionados com status mitocondrial de rim em um modelo animal de10. Além disso, mitocôndrias de células imunes tem sido usadas como um proxy para detecção de alterações sistêmicas sob condições de diferentes doenças11,12. Mitocôndrias nas células do sistema imunológico de circulação são particularmente sensíveis a mudanças nas funções imunes e imune de sinalização moléculas tais como citocinas13,14,15. Por exemplo, tem sido observado que PBMC de pacientes com doenças inflamatórias reumáticas agudas apresentam alta de base de consumo de oxigênio14. Em contraste, o consumo de oxigênio foi reduzido em PBMCs isoladas de pacientes com condições inflamatórias sistémicas, incluindo sepse16. Sob condições inflamatórias, radicais livres produzidos por mitocôndrias disfuncionais pode contribuir mais elevado estresse oxidativo e inflamação prolongada17. O papel central da mitocôndria na produção de energia, bem como em estresse oxidativo sugere o potencial utilitário de usando a função mitocondrial como um proxy para o estudo de fadiga em pacientes de câncer 13.
Estudos anteriores, examinando a função mitocondrial utilizaram técnicas bioquímicas, medição do potencial de membrana mitocondrial ou isolamento de populações de células específicas que não podem ser facilmente adaptável ao ambiente clínico5, 14,18. Nos últimos anos, o desenvolvimento de ensaios de fluxo extracelular permitiu aos pesquisadores facilmente e com precisão, examinar as mudanças na taxa de consumo de oxigênio (OCR) em resposta às injeções automatizadas de inibidores respiratória19,20 , 21 , 22. no entanto, a maioria desses estudos é projetada para tipos específicos de células e o grande formato de alto rendimento pode não ser aplicável em um ambiente clínico. Este manuscrito, descrevemos um protocolo otimizado para examinar a função mitocondrial para uso clínico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:331px;">CPT Mononuclear Cells Preparation Tube&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:165px;">362761</td>
			<td style="width:257px;">For isolating PBMCs following phlebotomy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI-1640&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040</td>
			<td>For making growth media for PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>For making growth media for PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>For making growth media for PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Seahorse XF Calibrant Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103059-000</td>
			<td>For hydrating cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">XF base media</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103335-100</td>
			<td>For making XF assay media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">45% cell culture D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-037-CI</td>
			<td>For making XF assay media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium pyruvate solution</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td>For making XF assay media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamine solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td>For making XF assay media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Seahorse XFp Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103010-100</td>
			<td>Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C35011</td>
			<td>For quantification of live cells and data normalization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Seahorse XFp Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S7802AEA</td>
			<td>For measuring mitochondrial function in live cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTCYT5PV</td>
			<td>For quantification of live cells and data normalization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating the role of mitochondrial function in cancer-related fatigue

A fadiga é um comum e debilitante condição que afeta a maioria dos pacientes com câncer. Até à data, restos de fadiga mal caracterizados com nenhum diagnóstico teste para medir objetivamente a gravidade dessa condição. Aqui nós descrevemos um método otimizado para avaliar a função mitocondrial de PBMC coletadas de pacientes com câncer fatigados. Usando um sistema compacto fluxo extracelular e injeção sequencial de inibidores respiratórias, examinamos estado funcional mitocondrial de PBMC medindo basal respiração mitocondrial, capacidade respiratória e fenótipo de energia, que descreve a via preferencial de energia para responder ao estresse. PBMCs frescos estão prontamente disponíveis na prática clínica usando padrão flebotomia. O ensaio todo descrito neste protocolo pode ser concluído em menos de 4 horas sem o envolvimento de técnicas bioquímicas complexas. Além disso, descrevemos um método de normalização que é necessário para a obtenção de dados podem ser reproduzidos. Os métodos de procedimento e normalização simples apresentados permitem para coleta de amostra repetida do mesmo paciente e geração de dados reprodutíveis que podem ser comparados entre os pontos de tempo para avaliar os efeitos potenciais do tratamento.

O teste de estresse de Mito baseia-se em medir a taxa de consumo de oxigênio (OCR) após injeção sequencial de vários inibidores respiratórias para mapear um perfil mitocondrial completo. Medições de OCR após cada injecção de droga pode ser usada para calcular os seguintes parâmetros relacionados com a saúde mitocondrial: OCR Basal mede-se primeiro antes de qualquer injeção de drogas para avaliar o consumo de oxigênio necessário para atender a demanda de A...

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Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Nosso objetivo foi desenvolver um protocolo prático para avaliar disfunção mitocondrial associada a fadiga em pacientes com câncer. Este protocolo inovador é otimizado para uso clínico envolvendo flebotomia só padrão e os procedimentos básicos de laboratório.

Avaliando o papel da função mitocondrial em fadiga relacionadas ao câncer

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Ultrassonográfico Avaliação do linfedema relacionados com o cancro da mama

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Pesquisa do câncer

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Um mouse modelo de fadiga induzida por irradiação periférica

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Métodos para avaliar o papel de c-Fos e Dusp1 em dependência do Oncogene

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Modelo de matriz extracelular óssea tridimensional para osteossarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

Integração de abordagens de bioinformática e validações experimentais para entender o papel da sinalização de notch no câncer de ovário

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

Measuring the Motor Aspect of Cancer-Related Fatigue using a Handheld Dynamometer

Medindo o aspecto motor da fadiga relacionada ao câncer usando um dinamômetro portátil

Cancer-related fatigue (CRF) is commonly reported by patients both during and after receiving treatment for cancer. Current CRF diagnoses rely on ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Mapeando as Relações Estrutura-Função de Fatores de Transcrição Oncogênica Desordenados usando análise transcriômica

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Um Modelo de Camundongo para Investigar o Papel de Fibroblastos Associados ao Câncer no Crescimento Tumoral

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...