Name: production of elastin-like protein hydrogels for encapsulation and immunostaining of cells in 3d
Uploaded: 2018-05-19T13:30:00
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लेखक टी पामर और एच बाबू (स्टैनफोर्ड न्यूरोसर्जरी) murine NPCs. वेक्टर में कला प्रदान करने के लिए धंयवाद चित्रा 4 का उपयोग किया गया था और Servier चिकित्सा कला से अनुकूलित के तहत क्रिएटिव कॉमंस रोपण ३.० unported लाइसेंस (https://creativecommons.org/ /3.0/legalcode) द्वारा लाइसेंस । इस काम का हिस्सा स्टैनफोर्ड नैनो साझा सुविधाओं (SNSF), पुरस्कार ECCS-१५४२१५२ के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित पर प्रदर्शन किया था । N.A.S. राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (32GM008412) के जनरल मेडिकल साइंसेज के नेशनल इंस्टिट्यूट से समर्थन स्वीकार करता है । C.M.M. एक NIH NRSA पूर्व डॉक्टरेट फैलोशिप (F31 EB020502) और Siebel विद्वानों कार्यक्रम से समर्थन स्वीकार करता है । S.C.H. स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (U19 AI116484 और R21 EB018407), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (DMR १५०८००६), और reअपक्षय चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया संस्थान (RT3-07948) से समर्थन स्वीकार करता है । इस अनुसंधान reअपक्षयी पुनर्वास अनुसंधान और प्रशिक्षण (एआर3टी), जो Eunice कैनेडी श्राइवर बाल स्वास्थ्य और मानव विकास के राष्ट्रीय संस्थान (niched), राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित है के लिए एलायंस से धन प्राप्त मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक (NINDS), और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बायोमेडिकल इमेजिंग और जैव इंजीनियरिंग (NIBIB) पुरस्कार संख्या P2CHD086843 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

1. दद एक्सप्रेशन प्रोटोकॉल
<ol><li>दिन 1: स्टार्टर कॉलोनी बढ़ रही है
	<ol>
<li>Luria शोरबा के autoclaving 25 ग्राम और ultrapure पानी के 1 L प्रति आगर के 15 ग्राम तक एम्पीसिलीन और क्लॉरॅंफेनिकोल आगार प्लेटें तैयार करें । एक बार हल क...

<ol>
	<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+Cell-Matrix+Adhesions+to+the+Third+Dimension.">Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li><li>Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+perturbation+in+vitro-A+growing+case+for+three-dimensional+(3D)+culture+systems.">Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).</li><li>G&#243;mez-Lech&#243;n, M. 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M., MacKay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+elastin-like+polypeptide+nanoparticles.">Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles.</a> Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).</li><li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering.">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).</li><li>Madl, C. M., Heilshorn, S. 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रिकॉमबिनेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि उच्च reproducibility के साथ संश्लेषित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । काफी हद तक व्यावसायिक आणविक क्लोनिंग के आगमन के कारण, कस्टम रिकॉमबिनेंट plasmids कई आपूर्तिकर्ताओ?...

पिछली सदी के दौरान, दो आयामी (2d) ऊतक संस्कृति इन विट्रो मेंमौलिक कोशिका जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक अभिंन toolset में विकसित किया गया है । इसके अलावा, अपेक्षाकृत कम लागत और 2d सेल संस्कृति के लिए सरल प्रोटोकॉल कई जैविक और चिकित्सा विषयों में अपनी गोद लेने के लिए नेतृत्व किया है । हालांकि, पिछले अनुसंधान से पता चला है कि पारंपरिक 2 डी प्लेटफार्मों परिणाम है कि vivo मेंएकत्र उन से विचलित करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, कीमती समय और धन के कारण नैदानिक उन्मुख अनुसंधान के लिए बर्बाद1,2, 3. हम और दूसरों को परिकल्पना है कि इस विसंगति देशी जैव रासायनिक और भौतिक संकेत की कमी के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है 2d सतहों पर प्रसंस्कृत कोशिकाओं को प्रदान की है, जो इष्टतम प्रसार और विभिंन प्रकार के सेल के परिपक्वता के लिए आवश्यक हो सकता है ।
इन सीमाओं को हल करने के लिए और मदद इन विट्रो में 2d के बीच अंतर पुल और vivo अध्ययनों में , शोधकर्ताओं ने तीन आयामी विकसित किया है (3 डी) सेल के लिए hydrogel प्लेटफार्मों-encapsulation1,4,5 ,6. Hydrogels आदर्श सामग्री है दोहराऊंगा मैट्रिक्स (extracellular) के अंतर्जात microenvironment के कारण vivo में अपने ऊतक की तरह यांत्रिक गुणों और पानी की सूजन संरचना है कि पोषक तत्वों के तेजी से परिवहन के लिए सक्षम बनाता है और संकेत कारक7,8। इसके अलावा, 3d hydrogels पाड़ के यांत्रिक और जैव रासायनिक गुणों पर स्वतंत्र नियंत्रण करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है । दोनों मैट्रिक्स यांत्रिकी9,10,11,12 और सेल चिपकने वाला लाइगैंडों13,14,15 सेल को प्रभावित करने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है इन विट्रो में व्यवहार और vivo में । इस प्रकार, स्वरित्र गुणों के साथ 3 डी hydrogels कोशिकाओं और उनके microenvironment के बीच कारण संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं । एक आदर्श 3d hydrogel मैट्रिक्स के लिए मानदंड सरल, गैर साइटोटोक्सिक कोशिका-encapsulation के साथ ही शारीरिक रूप से प्रासंगिक यांत्रिक गुणों के स्वतंत्र tunability और देशी कोशिका चिपकने वाली रूपांकनों की नकल शामिल हैं ।
दोनों सिंथेटिक (जैसे, पॉलीथीन ग्लाइकोल, polylactic एसिड, पाली (glycolic एसिड)) और स्वाभाविक रूप से व्युत्पंन (उदा., alginate, कोलेजन, Matrigel) hydrogels इन विट्रो संस्कृति प्लेटफार्मों में 2d से अधिक लाभ है; हालांकि, वे भी महत्वपूर्ण कमियों जो उनकी प्रयोज्यता की सीमा है । सबसे पहले, कई सिंथेटिक और स्वाभाविक रूप से व्युत्पंन प्लेटफार्मों कठोर crosslinking स्थितियों है कि संभावित स्तनधारी कोशिकाओं को विषाक्त किया जा सकता है की आवश्यकता होती है, कम सेल व्यवहार्यता के लिए अग्रणी7। इसके अतिरिक्त, कई सिंथेटिक प्लेटफार्मों देशी जैव गतिविधि की कमी और माध्यमिक रासायनिक प्रतिक्रियाओं, जो वृद्धि की लागत और जटिलता16जोड़ सकते है के माध्यम से कार्यात्मक होना चाहिए । अंत में, जबकि स्वाभाविक रूप से व्युत्पंन सामग्री आमतौर पर आंतरिक जैव सक्रिय डोमेन होते हैं, वे अक्सर उच्च बैच से त्रस्त है-बैच परिवर्तनशीलता और अक्सर अपेक्षाकृत कमजोर जैल7,17बनाने तक सीमित हैं ।
रिकॉमबिनेंट प्रोटीन इंजीनियरिंग प्रोटीन अनुक्रम पर स्पष्ट नियंत्रण की अनुमति देकर सामग्री डिजाइन के लिए एक अनूठा toolset प्रस्तुत करता है और, विस्तार से, अंतिम hydrogel पाड़18के संभावित यांत्रिक और जैव रासायनिक गुण । इसके अतिरिक्त, प्रोटीन व्यक्त करने के लिए ई कोलाई (ई. कोलाई) की अच्छी तरह से ज्ञात जैविक मशीनरी का लाभ द्वारा, सामग्री लागत प्रभावी ढंग से और लगातार सीमित अंतर के साथ और अंतर-बैच परिवर्तनशीलता का उत्पादन किया जा सकता है । elastin-प्रोटीन की तरह (दद) यहां प्रस्तुत तीन इंजीनियर डोमेन है: (1) एक T7 और His6 टैग है कि फ्लोरोसेंट टैग एंटीबॉडी के द्वारा लेबलिंग के लिए अनुमति देता है, (2) एक ' elastin ' की तरह क्षेत्र है कि लोचदार यांत्रिक गुणों प्रदान और रासायनिक के लिए अनुमति देता है crosslinking, और (3) एक ' जैव सक्रिय ' क्षेत्र है कि सेल चिपकने वाली रूपांकनों के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना ।
हमारे elastin-जैसे क्षेत्र विहित (वैल-प्रो-Gly-Xaa-Gly)5 elastin अनुक्रम पर आधारित है जहां चार ' Xaa ' अमीनो अम्ल स्थलों पर isoleucine (इले) होते हैं, लेकिन इसके अलावा किसी भी अमीनो अम्ल को रेखांकित करने के लिए डिजाइन किया जा सकता है । यह अनुक्रम थर्मल सायक्लिंग19,20के माध्यम से सरल शोधन पद अभिव्यक्ति के लिए शोषण किया जा सकता है कि कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान (LCST) व्यवहार के साथ रिकॉमबिनेंट ELPs endows । इस LCST संपत्ति अतिथि ' Xaa ' अवशेषों21,22संशोधित करके अलग तापमान पर थर्मल समग्र को देखते किया जा सकता है ।
यहाँ पाँच elastin में से किसी एक पर ' Xaa ' की स्थिति को इस तरह दोहराया गया है कि अमीना पेश lysine (Lys) अमीनो अम्ल, जो hydrogel crosslinking के लिए उपयोग किया जाता है, के साथ प्रतिस्थापित कर दिया गया है. हमारे पिछले काम अमीना-प्रतिक्रियाशील crosslinker tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium क्लोराइड (THPC)23के साथ प्रतिक्रिया के माध्यम से गैर साइटोटोक्सिक और मजबूत crosslinking दिखाया गया है । समग्र प्रोटीन सामग्री और crosslinker एकाग्रता अलग करके, हम hydrogels है कि एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक कठोरता सीमा (~ 0.5-50 केपीए)9,23,24अवधि को देखते किया जा सकता है उत्पादन करने में सक्षम हैं । यांत्रिक गुणों ट्यूनिंग के अलावा, hydrogel परिणाम के भीतर सेल आसंजन विहित कोशिका के एकीकरण से चिपकने वाला डोमेन के भीतर दद प्रोटीन की रीढ़. उदाहरण के लिए, विस्तारित fibronectin-व्युत्पंन ' RGDS ' एमिनो एसिड अनुक्रम के शामिल सेल आसंजन और गठन के लचीलेपन के लिए अनुमति देता है, जबकि तले हुए, गैर बाध्यकारी ' RDGS ' संस्करण सेल-मैट्रिक्स आसंजन24प्रतिबंधित करता है । कोशिका-चिपकने वाला गैर-चिपकने वाला प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कुल प्रोटीन एकाग्रता के अनुपात संग्राहक द्वारा, हम प्रभावी ढंग से hydrogels जो ligand एकाग्रता की एक विस्तृत श्रृंखला अवधि का उत्पादन करने में सक्षम हैं । Resultantly, हम कुछ जैव रासायनिक और भौतिक गुणों के साथ एक hydrogel मंच विकसित किया है, जो स्वतंत्र रूप से विभिन्न सेल प्रकार के इष्टतम 3 डी संस्कृति के लिए देखते किया जा सकता है ।
मैट्रिक्स कठोरता और चिपकने वाला ligand tunability के अलावा, रिकॉमबिनेंट hydrogels के लिए विशिष्ट सामग्री गिरावट प्रोफाइल, जो सेल के प्रसार, प्रसार के लिए आवश्यक है डिजाइन की क्षमता प्रदान करते हैं, और एक 3 डी संदर्भ के भीतर प्रवास4 , 9. इस गिरावट की है कि विशेष रूप से या तो ' विस्तारित ' RGDS9 या elastin-की तरह अनुक्रम25लक्ष्य की चिढ़ाने के सेल स्राव द्वारा afforded है । दद hydrogels भी बाद जैव रासायनिक परख है कि कोशिका व्यवहार्यता और immunocytochemistry सहित समारोह के अध्ययन के लिए आवश्यक है समर्थन दिखाया गया है और साथ ही डीएनए/मात्रात्मक रिवर्स के लिए/ प्रतिलेखन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qRT-पीसीआर) और वेस्टर्न ब्लाटर9. दद वेरिएंट भी vivo में मॉडल की एक संख्या में इस्तेमाल किया गया है और अच्छी तरह से प्रतिरक्षा प्रणाली26द्वारा सहन किया जा करने के लिए जाना जाता है ।
एक साथ ले लिया, सेल-encapsulation के अध्ययन के लिए एक सामग्री मंच के रूप में दद सिंथेटिक या प्राकृतिक रूप से व्युत्पंन सामग्री प्लेटफार्मों, जो अक्सर जैव रासायनिक और भौतिक tunability की एक ही डिग्री की कमी की तुलना में लाभ की एक विस्तृत विविधता समेटे हुए है और reproducibility. इसके अतिरिक्त, है दद सरल और गैर साइटोटोक्सिक उपयोग सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता के साथ (उदा., चिकी पृष्ठीय रूट गैंग्लिया14,24, murine तंत्रिका जनक कोशिकाओं9, मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं27, गोजातीय नवजात chondrocytes28, मानव endothelial कोशिकाओं29,30) 2d सेल संस्कृति की तुलना में अंतर्जात 3d ECM के एक अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल के लिए अनुमति देता है । साथ ही, हम 3 डी सेल encapsulation के लिए एक स्वरित्र hydrogel मंच के रूप में उपयोग के लिए recombinantly-व्युत्पंन, ELPs की अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम आगे नीचे के लिए क्रियाविधि धारा फ्लोरोसेंट लेबलिंग और encapsulated कोशिकाओं के फोकल माइक्रोस्कोपी ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="904">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Elastin-Like Protein Expression and Purification</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 cm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% Ethanol</td>
			<td>RICCA Chemical</td>
			<td style="width:123px;">2546.70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A3920-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP1760-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">9002-18-0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21(DE3)pLysS Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:260px;">Amresco</td>
			<td style="width:123px;">0230-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA disodium salt, dihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">O2793-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP1755-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Broth</td>
			<td style="width:260px;">EMD Millipore</td>
			<td>1.10285.5007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:123px;">52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">195381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S 8045-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe Filter Unit (0.22 &#956;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific Broth</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">71754-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#956;m syringe filters</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 mm thick silicone sheet</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:123px;">70338-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (2 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (4 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Biopsy Punch (5 mm)</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td style="width:123px;">33-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">No. 1 12 mm glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">404861-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5% Tryspin/EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td style="width:123px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:355px;">Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:260px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">15701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:260px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">D1306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:260px;">Lampire Biological Labs</td>
			<td style="width:123px;">7332100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488)</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546)</td>
			<td style="width:260px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:123px;">A-11071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16210-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Mouse Nestin Primary Antibody</td>
			<td style="width:260px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">556309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Sox2 Primary Antibody</td>
			<td style="width:260px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:123px;">23064S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Nail Polish</td>
			<td style="width:260px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Hardset Mounting Medium&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:123px;">H-1400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of elastin-like protein hydrogels for encapsulation and immunostaining of cells in 3d

दो आयामी (2d) ऊतक संस्कृति तकनीक मौलिक कोशिका जीवविज्ञान की हमारी समझ के लिए आवश्यक हो गया है । हालांकि, पारंपरिक 2d ऊतक संस्कृति प्रणालियों की कमी एक तीन आयामी (3 डी) मैट्रिक्स, परिणामों के बीच एक महत्वपूर्ण डिस्कनेक्ट में जिसके परिणामस्वरूप इन विट्रो में एकत्र और vivo में। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, शोधकर्ताओं ने 3d hydrogel टिशू कल्चर प्लेटफॉर्म्स को इंजीनियर किया है जो कि वीवो सेल microenvironment में जैव रासायनिक और भौतिक गुणों की नकल कर सकते हैं । इस शोध के लिए सामग्री प्लेटफार्मों कि समर्थन 3d सेल encapsulation और बहाव जैव रासायनिक परख विकसित करने की आवश्यकता को प्रेरित किया है । रिकॉमबिनेंट प्रोटीन इंजीनियरिंग प्रोटीन अनुक्रम के विशिष्ट नियंत्रण के लिए अनुमति देकर 3 डी hydrogel सामग्री डिजाइन और विकास के लिए एक अनूठा toolset प्रदान करता है और इसलिए, विस्तार से, परिणामी के संभावित यांत्रिक और जैव रासायनिक गुण मैट्रिक्स. यहां, हम recombinantly-व्युत्पंन elastin प्रोटीन (दद), जो स्वतंत्र रूप से स्वरित्र यांत्रिक गुणों और कोशिका चिपकने वाला ligand एकाग्रता के साथ hydrogels फार्म का इस्तेमाल किया जा सकता है की अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम आगे दद hydrogels और बाद में बहाव विश्लेषण और ठहराव के लिए एम्बेडेड कोशिकाओं के दाग immunofluorescent के भीतर सेल encapsulation के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करते हैं ।

इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त ELPs पांच क्षेत्रों में शामिल हैं: एक T7 टैग, His6 टैग, enterokinase (EK) क्लीवेज साइट, एक जैव सक्रिय क्षेत्र, और एक elastin जैसे क्षेत्र (चित्रा 1) । T7 और His6 टैग मानक पश्चिमी दाग तक...

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Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

रिकॉमबिनेंट प्रोटीन इंजीनियर hydrogels 3d सेल संस्कृति के लिए लाभप्रद है क्योंकि वे बहुलक रीढ़ की पूरी tunability के लिए अनुमति देते है और इसलिए, सेल microenvironment । यहाँ, हम रिकॉमबिनेंट elastin की प्रक्रिया का वर्णन-जैसे प्रोटीन शुद्धि और 3 डी hydrogel सेल encapsulation में अपने आवेदन.

3 डी में Elastin और कोशिकाओं के Immunostaining के लिए प्रोटीन Hydrogels की तरह उत्पादन

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