Name: subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Forfatterne anerkender assistance af Ander Lopez og Miren Telletxea til video optagelse og redigering. ACR er finansieret af et Ikerbasque Fællesskab og et forskningsprojekt fra Asociación de Celiacos Madrid (ACM). Fællesorganet er finansieret af projekt ISCIII-PI16/00258 og medfinansieres af den Europæiske Union EFRU/ESF "En måde at gøre Europa". ER er finansieret af en research project grant 2015111068 af baskiske Department of Health. IRG og AJM er støttet af predoctoral fellowship tilskud fra UPV/EHU og baskiske Department of Education, henholdsvis.

Denne undersøgelse blev godkendt af Cruces University Hospital etik Board og analyser blev udført efter informeret samtykke blev opnået fra alle fag eller deres forældre.
1. biopsi samling
Bemærk: Biopsi prøver fra patienter distale duodenum er opnået under rutinemæssige diagnosen endoskopi styring af biopsier der spænder mellem 2 og 10 mg i vægt. Biopsi væv er et komplekst væv består af forskellige celletyper, herunder epitel-, immun- og endothelial cell...

<ol>
	<li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li><li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization.">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).</li><li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases:+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies.">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li><li>Ericsson, C., Franz&#233;n, B., Nist&#233;r, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling,+cryopreservation,+extraction,+and+use+for+proteomic+analysis.">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li><li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues.">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li><li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling.">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li><li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>B&#246;rner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues.">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li><li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+disease:+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology.">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li><li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein purification protocols. , (2004).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bicinchoninic+Acid+(BCA)+Assay+for+Protein+Quantitation.">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li><li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations.">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li><li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease.">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li></ol>

Protokollen beskrevet her bruges til den nukleare og cytoplasmatisk fraktionering af intestinal biopsier. De renset protein er ikke denatureret og kan bruges ikke kun i western blot analyse som vist i figur 2 og 3 , men også i assays kræver native-foldet proteiner som immunoprecipitation, elektroforese mobilitet Skift assay (EMSA) eller Native polyacrylamid gelelektroforese (side).
Den beskrevne metode er baseret på mekaniske homogenisering af ...

Proteiner deltage i næsten alle biologiske funktioner i en celle og enhver variation i deres struktur, mængde eller placering kan føre til sygdomsfremkaldende scenario. Væv prøve fraktionering metoder er en nyttig tilgang til at reducere kompleksiteten af sygdom relateret protein analyser. Nogle undersøgelser bruge protein lokalisering information eller berige et protein fra en specifikke cellulære rum, så en protokol til reproducerbare fraktionering af intakt proteiner er nyttige til at besvare visse biologiske spørgsmål. Bestemmelse af den subcellulært lokalisering af proteiner og overvåge deres afdelingsmæssig omfordeling eller interaktioner på basal og sygdomstilstande vil hjælpe med at identificere sygdom relateret funktionelle forskelle1,2. Således, denne metode har til formål at reproducerbar fractionate tarmens væv biopsier, både ferske og frosne, i cytoplasmatisk og nukleare subcellulært rum.
Tarm biopsi prøver rutinemæssigt er opnået under endoskopi procedurer3 (figur 1) og kan bruges effektivt for protein kvantificering eller immunoprecipitation studier. Da vævsprøver fra tarm epitel indeholder proteiner, der kan være direkte involveret i den sygdom patogenese4, er tarm biopsi prøver en meget værdifuld kilde til succesfulde identifikation af intestinal sygdoms-specifikke proteiner. Gemte frossen, patient vævsprøver med de kliniske oplysninger er nyttige ressourcer til proteinanalyse, og en simpel og reproducerbar prøveforberedelse er et centralt spørgsmål om celle mangelfulde oplysninger ved hjælp af begrænsende mængder frosset væv5.
Der er flere kommercielt tilgængelige kits til adskillelse af cellulære fraktioner, men disse er dyrere og generelt mere tidskrævende end præsenteret her-protokollen. Protokoller baseret på flere trin gradient centrifugering og kontinuerlige gradueringer har også tidligere er blevet anvendt til fraktionering af forskellige cellulære rum i forskellige væv6,7. Men opretholde sammenhængen i kontinuerlige forløb er ofte en vanskelig opgave. Lignende protokoller baseret på den sekventielle lysering af membraner har tidligere beskrevet, men de generelt har brug for mere end to buffere og hænderne på tid er længere8 .
Når fractionating vævsprøver, huske på, at vævscentre prøver nuværende celle-celle og celle-matrix interaktioner, der er ikke til stede i kulturperler celler og vigtigt når fortsætter til protein udvinding. Den korrekte fordeling mellem celler og ekstracellulære matrix uden at påvirke protein kvalitet bliver en kritisk faktor i tarmens væv protein isolation9. I denne protokol er celle-celle og celle-matrix kontakter først brudt, frigive cellerne og giver bufferen til at nå de enkelte celler. For at undgå protein-rum blanding forud fraktionering, skal opdeling af kontakterne forekomme uden at ændre integriteten af cellerne eller nukleare membraner.
Berigelse af forskellige proteaser i tarmslimhinden10er det vigtigt at kontrollere protein nedbrydning under udvinding. For at minimere det potentielle protein nedbrydning, skal flere protease hæmmer medtages i protein udvinding buffere. Derudover hvis ekstrakter skal bruges til funktionelle assays, er det vigtigt at undgå denaturering af proteiner eller proteolyse, da dette vil medføre et tab af protein aktivitet11. Til dette formål, protokollen er udført ved 4 ° C og friske phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) er føjet til buffere i en endelig koncentration på 0,1 mM bare forudgående skal bruges til at hæmme yderligere proteolyse.
Det første skridt i celle fraktionering er væv forstyrrelser og celle lysering. Som tidligere nævnt, er formålet at disaggregate celler og bryde åbne dem med minimale skader. Tarm vævsprøver skal være homogeniseret, og cellerne mængden til at opnå maksimal brud af cellemembranen. I denne protokol bruger vi en motoriseret pistil mixer til at bryde den intestinale væv, der er homogeniseret inden for få sekunder ved hjælp af høj hastighed vortexing handling. Efter homogenisering, er væv celler inkuberes i en hypotonic buffer, der vil briste cellemembranen, men vil holde atomkerner intakt, efterfulgt af tilføjelsen af en ikke-denatureringen vaskemiddel (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) og en kort vortex at adskille kerner fra den cytoplasmatisk brøkdel. Efter fjernelse af cytoplasma, er kerner cellemembranen brast i en hypertonisk buffer under omrystning.
Den metode, der præsenteres her er en velegnet metode til subcellulært fraktionering af ferske og frosne intestinal biopsier, der er opnået under endoskopiske procedurer og varierer mellem 2 og 10 mg i vægt. Protokollen er let og reproducerbare og kunne udføres ved hjælp af grundlæggende laboratorieudstyr og reagenser i under en time.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">HEPES</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4034-1kg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">KCl</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">EDTA</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">5588886-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">DTT</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">PMSF</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Proteinase and phosphatase inhibitors</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A32959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">NP-40&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CA-630</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">BCA assay</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23227</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Disposable plastic pestles</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z359947-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Dounce homogeneizer</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:128px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Shacker</td>
			<td style="width:128px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">MS3 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens

Formålet med denne protokol er at fractionate menneskelige tarmens væv fremstillet ved endoskopi i nukleare og cytoplasmatisk rum for lokalisering analyse af specifikke proteiner eller proteinkomplekser i forskellige væv stater (dvs., sund vs sygdom). Denne metode er nyttig til fraktionering af både ferske og frosne intestinal vævsprøver; Det er let tilgængeligt for alle laboratorier og ikke tidskrævende.

Figur 1 viser en hæmatoxylin eosin pletter af en tarm biopsi sektion med intakt villi og krypten strukturer.
Repræsentative resultater af nukleare og cytoplasmatisk fraktionering bruger denne protokol er vist i figur 2 og 3. I forsøget vist i figur 2, en frisk (Fh) og en frosne (Fz) biopsi blev samtidig fraktioneret efter protokollen...

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Vi præsenterer her, en protokol for at udføre en simpel cellulær fraktionering for subcellulært adskillelse af cytoplasmatisk og nukleare proteiner i human ferske og frosne intestinal biopsier.

Subcellulært fraktionering fra ferske og frosne gastrointestinale prøver

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Optimerede protokoller til<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Strain Management: Frosne Stock bevarelse og vedligeholdelse i Atymiske Nude Mus

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel og hurtig protokol til ikke-enzymatisk dissociere frisk humant væv til analyse af lymfocytter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion af murine tarmbetændelse ved adoptiv overførsel af effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høj</sup&gt; T celler i immunsvækkede mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Transformation af Probiotic Gær og deres Recovery fra Mave Immune væv efter oral sonde i mus

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput Påvisning af respiratoriske patogener i Animal Prøver af Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Levende celle Fluorescens mikroskopi til at undersøge subcellulære protein lokalisering og celle morfologi ændringer i bakterier

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Isolering af makrofag-undergrupper og stromale celler fra humane og muse Myokardie prøver

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...