Name: subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Autori riconoscono l'assistenza di Ander Lopez e Miren Telletxea per la registrazione e l'editing dei video. ACR è finanziato da una borsa di studio Ikerbasque e un progetto di ricerca dal Asociación de Celiacos di Madrid (ACM). JRB è finanziato dal progetto ISCIII-PI16/00258 e co-finanziato dal FESR/FSE Unione europea "Un modo per fare dell'Europa". È è finanziata da una sovvenzione di progetto di ricerca 2015111068 del basco dipartimento della salute. IRG e AJM sono supportate da sussidi per la fellowship predoctoral da UPV/EHU e il basco Department of Education, rispettivamente.

Questo studio è stato approvato dal comitato di etica di Cruces University Hospital e analisi sono state eseguite dopo consenso informato è stato ottenuto da tutti gli oggetti o i loro genitori.
1. biopsia collezione
Nota: Gli esemplari di biopsia dal duodeno distale dei pazienti sono ottenuti durante l'endoscopia di diagnosi sistematica gestione biopsie comprese tra 2 e 10 mg di peso. Tessuto biopsiato è un tessuto complesso composto da diversi tipi cellulari tra ...

<ol>
	<li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li><li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization.">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).</li><li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases:+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies.">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li><li>Ericsson, C., Franz&#233;n, B., Nist&#233;r, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling,+cryopreservation,+extraction,+and+use+for+proteomic+analysis.">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li><li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues.">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li><li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling.">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li><li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>B&#246;rner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues.">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li><li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+disease:+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology.">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li><li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein purification protocols. , (2004).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bicinchoninic+Acid+(BCA)+Assay+for+Protein+Quantitation.">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li><li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations.">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li><li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease.">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li></ol>

Il protocollo descritto qui è usato per il frazionamento nucleare e citoplasmatico di biopsie intestinali. Le proteine purificate non sono denaturate e può essere utilizzate non solo nell'analisi di western blot come mostrato in Figura 2 e 3 , ma anche nelle analisi che richiedono nativo-piegato proteine quali immunoprecipitazione, analisi dello spostamento di mobilità elettroforetica (EMSA) o elettroforesi nativa del gel di poliacrilammide (PAGE).
<p class="jove_cont...

Proteine partecipano a quasi tutte le funzioni biologiche all'interno di una cella e qualsiasi variazione nella loro struttura, la quantità o la posizione può portare a uno scenario di patogeno. Metodi di frazionamento dei campioni del tessuto sono un utile approccio per ridurre la complessità della malattia relative analisi di proteine. Alcuni studi utilizzano informazioni di localizzazione della proteina o arricchiscono una proteina da un compartimento cellulare specifico, quindi un protocollo per il frazionamento riproducibile di proteine intatte è utile per rispondere a taluni quesiti biologici. Determinare la localizzazione subcellulare delle proteine e monitoraggio loro ridistribuzione compartimentali o interazioni al basale e condizioni di malattia verranno aiuterà a identificare la malattia relative differenze funzionali1,2. Questo metodo intende quindi, riproducibile frazionare le biopsie del tessuto intestinale sia fresche che congelate, in compartimenti subcellulari citoplasmatici e nucleari.
I campioni di biopsia intestinale sono ordinariamente ottenuti durante l'endoscopia procedure3 (Figura 1) e possono essere efficacemente utilizzati per la quantificazione della proteina o studi di immunoprecipitazione. Dal momento che i campioni di tessuto da intestinale epiteliali conterrà le proteine che possono essere direttamente coinvolti in patogenesi malattia4, campioni di biopsia intestinale sono una fonte molto preziosa per l'identificazione di successo di specifica di malattia intestinale proteine. Campioni di tessuto congelato, paziente memorizzati insieme con le informazioni cliniche sono risorse utili per l'analisi della proteina, e una preparazione del campione semplice e riproducibile è una questione chiave per fornire informazioni compartimentali cella utilizzando quantità limitante di congelati tessuto5.
Ci sono diversi kit disponibile in commercio per la separazione di frazioni cellulari, ma questi sono più costosi e in genere richiede più tempo rispetto al protocollo presentato qui. Protocolli basati su centrifugazione in gradiente di più-passaggio e pendenze continue inoltre sono state usate in precedenza per il frazionamento dei diversi compartimenti cellulari in diversi tessuti6,7. Tuttavia, mantenendo la coerenza delle pendenze continue è spesso un compito difficile. Simili protocolli basati sulla sequenza lisi delle membrane precedentemente sono stati descritti, ma hanno bisogno generalmente più di due buffer e le mani sul tempo è più lungo di8 .
Quando i campioni di tessuto di frazionamento, tenete a mente che il tessuto campioni presenti cellula-cellula e cellula-matrice interazioni che sono presenti nelle cellule in coltura non sia importante quando si procede all'estrazione della proteina. La corretta ripartizione tra cellule e matrice extracellulare senza compromettere la qualità di proteina sarà un fattore critico nel tessuto intestinale della proteina isolamento9. In questo protocollo, contatti cellula-cellula e cellula-matrice in primo luogo sono rotti, liberando le cellule e permettendo che il buffer raggiungere le singole celle. Per evitare la proteina-vano di miscelazione prima del frazionamento, la ripartizione dei contatti deve avvenire senza alterare l'integrità delle membrane nucleari o le celle.
Dovuto l'arricchimento di varie proteasi nella mucosa intestinale10, è importante controllare la degradazione della proteina durante l'estrazione. Per ridurre al minimo il potenziale degradazione della proteina, più l'inibitore della proteasi deve essere incluso nei buffer di estrazione di proteine. Inoltre, se estratti stanno per essere utilizzati per analisi funzionali, è essenziale per evitare la denaturazione delle proteine o proteolisi ciò causerebbe una perdita di proteina attività11. Per questo scopo, il protocollo viene eseguito a 4 ° C e fluoruro di phenylmethylsulfonyl fresco (PMSF) viene aggiunto al buffer ad una concentrazione finale di 0,1 mM appena prima dell'uso per inibire ulteriore proteolisi.
Il primo passo nel frazionamento delle cellule è la rottura del tessuto e lisi cellulare. Come accennato in precedenza, l'obiettivo è quello di disaggregare le cellule e la rottura che li aperto con danni minimi. Campioni di tessuto intestinale devono essere omogeneizzati, e le cellule lisate per ottenere massima rottura della membrana cellulare. In questo protocollo, usiamo un mixer motorizzato pestello per rompere il tessuto intestinale che è omogeneizzato in pochi secondi mediante azione Vortex ad alta velocità. Dopo omogeneizzazione, cellule del tessuto vengono incubate in un buffer ipotonico che scoppierà la membrana delle cellule, ma manterrà i nuclei intatti, seguita dalla aggiunta di un detergente non-denaturante (nonil phenoxypolyethoxylethanol) e un breve vortice per separare i nuclei dalla frazione citoplasmatica. Dopo la rimozione del citoplasma, la membrana di nuclei delle cellule è scoppiò in un buffer ipertonico con agitazione.
Il metodo presentato qui è un metodo appropriato per il frazionamento subcellulare di biopsie intestinali freschi e congelati che sono stati ottenuti durante le procedure endoscopiche e intervallo tra 2 e 10 mg di peso. Il protocollo è semplice e riproducibile e può essere eseguito utilizzando apparecchiature di laboratorio di base e i reagenti in meno di un'ora.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">HEPES</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4034-1kg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">KCl</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">EDTA</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">5588886-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">DTT</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">PMSF</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Proteinase and phosphatase inhibitors</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A32959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">NP-40&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CA-630</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">BCA assay</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23227</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Disposable plastic pestles</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z359947-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Dounce homogeneizer</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:128px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Shacker</td>
			<td style="width:128px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">MS3 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens

Lo scopo del presente protocollo è quello di frazionare il tessuto intestinale umano ottenuto dall'endoscopia in compartimenti nucleari e citoplasmatici per l'analisi di localizzazione di specifiche proteine o complessi proteici in stati differenti del tessuto (cioè, sano vs malattia). Questo metodo è utile per il frazionamento di entrambi i campioni freschi e congelati di tessuto intestinale; è facilmente accessibile per tutti i laboratori e non richiede molto tempo.

La figura 1 Mostra un ematossilina eosina di una sezione di biopsia intestinale con villi intatti e strutture della cripta.
Risultati rappresentativi del frazionamento nucleare e citoplasmatica usando questo protocollo sono mostrati nelle figure 2 e 3. Nell'esperimento mostrato in Figura 2, un fresco (Fh) e un congelato (Fz) biopsia son...

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un frazionamento cellulare semplice per la separazione subcellulare delle proteine citoplasmatiche e nucleari in biopsie intestinali umane fresche e congelate.

Frazionamento subcellulare dagli esemplari gastrointestinali freschi e surgelati

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ</emIbridazione> per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Competitivo saggi Homing allo Studio Gut-tropico Migrazione cellulare T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Protocolli ottimizzati per<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Strain Management: congelata Stock Conservazione e Manutenzione in topi nudi atimici

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Un semplice e rapido protocollo non-enzimaticamente dissociare freschi tessuti umani per l&#39;analisi di linfociti infiltranti

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Trasformazione di lievito probiotico e il loro recupero da gastrointestinali immunitario tessuti dopo sonda gastrica nei topi

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Microscopia a fluorescenza a cellule vive per studiare la localizzazione delle proteine subcellulari e i cambiamenti della morfologia cellulare nei batteri

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Isolamento di sottoinsiemi di macrofaschi e cellule stromali da esemplari di miocardio umano e topo

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...