Name: subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00
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저자는 비디오 녹화 및 편집을 위한 Ander 로페즈와 Miren Telletxea의 도움을 인정 합니다. ACR는 Ikerbasque 친교와 Asociación 드 Celiacos 마드리드 (ACM)에서 연구 프로젝트에 의해 자금이 다. JRB은 프로젝트 ISCIII/PI16에 의해 00258와 공동 투자에 의해 유럽 연합 ERDF/ESF "유럽을 벌기 위해 방법" 이다. 연구 프로젝트 그랜트 2015111068 바스크 보건의에 의해 자금이 다. IRG 및 AJM 각각 UPV/EHU와 바스크어 교육부에서 predoctoral 친교 교부 금에 의해 지원 됩니다.

이 연구는 Cruces 대학 병원 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 고 모든 과목 또는 그들의 부모 로부터 동의 가져온 후 분석 수행 했다.
1. 생 컬렉션
참고: 환자의 원심 십이지 장 생 검 표본 얻을 수 있습니다 일상적인 진단 내 시경 생 검 관리 동안 무게에 2, 10 밀리 그램 사이 범위. Biopsied 조직 상피, 면역과 내 피 세포를 포함 하 여 다른 세포 유형으로 구성 된 ...

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여기에 설명 된 프로토콜 장 검의 핵과 세포질 분별 법에 사용 됩니다. 순화 된 단백질 변성 하지 하 고 그림 2 와 3 만 immunoprecipitation, 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA) 같은 네이티브 접힌 단백질을 필요로 하는 분석 실험에 또한 같이 서쪽 오 점 분석에 사용 될 수 있다 또는 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 (페이지)
설명된 방법 삼 투 세?...

단백질 세포 내의 거의 모든 생물 학적 기능에 참여 하 고 그들의 구조, 수량 또는 위치에 달라진 병원 성 시나리오를 발생할 수 있습니다. 조직 샘플 분류 메서드는 질병의 복잡성을 줄이기 위해 유용한 접근 관련 단백질 분석. 일부 연구 단백질 지역화 정보를 사용 하거나 특정 세포질 격실에서 단백질을 풍부 하 게 그대로 단백질의 재현 분별에 대 한 프로토콜은 특정 생물 학적 질문에 대답 하는 데 유용 합니다. 단백질의 subcellular 지 방화를 결정 하 고 그들의 compartmental 재배포 또는 기저에 상호 작용을 모니터링 질병 상태 질병을 식별 하는 데 도움이 됩니다 관련 기능 차이1,2. 따라서,이 방법은 reproducibly 장 조직 생 검, 두 신선 하 고 냉동, 세포질 및 핵 subcellular 구획으로 충분치를 목표로 합니다.
장 생 샘플 정기적으로 내 시경 절차3 (그림 1) 동안 얻은 고 단백질 정량화 또는 immunoprecipitation 연구에 효과적으로 사용할 수 있습니다. 이후 조직 샘플에서 장의 상피 질병 병 인4에 직접 관련 될 수 있습니다 단백질 포함 됩니다, 장 생 검 견본 장 질병 특정의 성공적인 식별에 대 한 매우 귀중 한 소스는 단백질입니다. 임상 정보와 함께 저장된 냉동, 환자의 조직 샘플 단백질 분석을 위한 유용한 리소스 이며 간단 하 고 재현성 샘플 준비의 제한 금액을 사용 하 여 셀 compartmental 정보를 제공 하는 중요 한 문제는 동결 조직5.
세포질 분수의 분리에 대 한 몇 가지 상용 키트 하지만 이들은 더 비싼 그리고 일반적으로 보다 더 많은 시간이 소요 여기에 제시 된 프로토콜. 여러 단계 그라데이션 원심 기반 프로토콜 및 지속적인 기온 변화도 또한 이전에 사용 된 다른 조직6,7에 다양 한 세포질 구획의 분류에 대 한 합니다. 그러나, 지속적인 기온 변화도의 일관성을 유지 하 종종 어려운 작업입니다. 세포 막의 순차적 용 해에 따라 비슷한 프로토콜 이전 설명 하지만 그들은 일반적으로 두 개 이상의 버퍼가 필요 이며 시간에 손을 더 이상8 .
조직 샘플을 위하여 때 명심 그 조직 샘플 존재-셀 및 셀-매트릭스 상호 작용 되는 둘 다 하지 경작된 한 세포에 중요 한 단백질 추출을 진행. 세포와 세포 외 기질 단백질 품질을 영향을 주지 않고 적절 한 고장 장 조직 단백질 격리9중요 한 요소 것입니다. 이 프로토콜에서-셀 및 셀-매트릭스 연락처가 먼저, 셀을 공개 하 고 개별 셀에 도달 하는 버퍼를 허용. 단백질 구획 분류 전에 혼합을 방지 하려면 연락처의 붕괴는 셀 이나 핵 막의 무결성을 변경 하지 않고 이루어져야 합니다.
10장 점 막 다양 한 프로 테아의 농축으로 추출 하는 동안 단백질 저하를 제어 하는 것이 중요입니다. 잠재적인 단백질 저하를 최소화 하기 위해 여러 프로 테아 제 억제 물 단백질 추출 버퍼에 포함 되어야 합니다. 또한, 추출 기능 분석에 사용 될 경우,이 단백질 활동11의 손실이 발생할 것 이다 단백질 또는 베이스의 변성을 피하기 위해 필수적입니다. 이 위해 프로토콜 4 ° C에서 수행 하 고 신선한 phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 그냥 더 베이스를 억제 하기 위해 사용 하기 전에 0.1 m m의 최종 농도에 버퍼에 추가 됩니다.
세포 분별 법의 첫 번째 단계 조직 장애 이며 세포 세포의 용 해. 앞에서 설명 했 듯이, 셀과 휴식 그들 최소 손상으로 열을 세분화 하는 목표가입니다. 장 조직 샘플을 균질 해야 합니다, 그리고 셀 lysed 세포 막의 최대 파손을 달성 하기 위해. 이 프로토콜을 사용 하 여 자동화 한 유 봉 믹서 고속 vortexing 작업에 의하여 초 이내 무 균 장 조직 휴식. 균질, 후 조직 세포는 세포 막 버스트 것 이다 하지만 것입니다 핵 그대로 유지, 비 변성 시키기 세제 (nonyl phenoxypolyethoxylethanol)와 핵을 분리 하는 짧은 소용돌이의 추가 의해 따라 소형 버퍼에서 incubated 세포질 분수. 세포질의 제거 후 세포 핵 막 떨고와 마 버퍼에 버스트입니다.
여기에 제시 된 방법은 내 시경 절차와 범위 2 및 10 mg에 무게 동안 얻은 신선 하 고 냉동 장 biopsies의 subcellular 분별에 대 한 적절 한 방법입니다. 프로토콜은 간단 하 고 재현성 고 기본적인 실험실 장비 및 한 시간에 시 약을 사용 하 여 수행할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">HEPES</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4034-1kg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">KCl</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">EDTA</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">5588886-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">DTT</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">PMSF</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Proteinase and phosphatase inhibitors</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A32959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">NP-40&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CA-630</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">BCA assay</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23227</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Disposable plastic pestles</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z359947-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Dounce homogeneizer</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:128px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Shacker</td>
			<td style="width:128px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">MS3 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens

이 프로토콜의 목적은 인간의 창 자 조직 특정 단백질 또는 다른 조직 (즉, 건강 한 상태에서 단백질 복합물의 지역화 분석에 대 한 핵 및 세포질 구획에 내 시경으로 얻은 충분치 대 질병)입니다. 이 메서드는 모두 신선 하 고 냉동 장 조직 샘플;의 분류 그것은 모든 실험실에 대 한 편리 하 고 시간이 소요입니다.

그림 1 에서는 그대로 villi와 토 굴 구조는 장 생 섹션의 얼룩이 지는 hematoxylin 오신.
이 프로토콜을 사용 하 여 핵과 세포질 분별 법의 대표적인 결과 그림 2 와 3에 나와 있습니다. 신선한 (Fh), 냉동된 (Fz), 그림 2에 표시 된 실험에서 생 검 했다 동시에 분류 ?...

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Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

여기, 우리는 인간의 신선 하 고 냉동 장 biopsies에 세포질 및 핵 단백질의 subcellular 분리에 대 한 간단한 세포 분별 법을 수행 하는 프로토콜을 제시.

신선 하 고 냉동 위장 표본에서 subcellular 분류

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

연구

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

굿 - 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 공부 경쟁력 호밍 Assays

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Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

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에 최적화 된 프로토콜<em&gt;은 Mycobacterium leprae</em&gt; 스트레인 관리 : 무 흉선 누드 마우스에서 냉동 보관 보존 ​​및 유지 관리

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

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침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

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이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

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마우스의 구강 투여에 따라 생균제 효모의 변환 및 위장 면역 조직에서 그들의 복구

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

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Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

박테리아의 세포 외 단백질 국소화 및 세포 형태 변화를 조사하는 살아있는 세포 형광 현미경 검사법

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

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인간과 마우스 심근 표본에서 대식세포 하위 세트 및 기질 세포의 분리

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