Name: subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Los autores reconocen la asistencia de Ander Lopez y Miren Telletxea para video grabación y edición. ACR es financiado por una beca de Ikerbasque y un proyecto de investigación de Asociación de Celiacos de Madrid (ACM). OCR es financiado por el proyecto ISCIII-PI16/00258 y cofinanciado por el Unión Europea FEDER/FSE "Una manera de hacer Europa". ES financiado por una subvención de proyecto de investigación 2015111068 del Departamento vasco de sanidad. IRG y AJM son apoyados por becas de beca predoctoral de la UPV/EHU y el Departamento vasco de educación, respectivamente.

Este estudio fue aprobado por el Consejo de ética de Hospital de Universitario de Cruces y los análisis se realizaron después de que se obtuvo consentimiento informado de todos los sujetos o a sus padres.
1. biopsia de la colección
Nota: Especímenes de la biopsia de duodeno distal de pacientes se obtienen durante la endoscopia de diagnóstico rutinaria gestión de biopsias que varían entre 2 y 10 mg de peso. Tejido hecho una biopsia es un tejido complejo compues...

<ol>
	<li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li><li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization.">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).</li><li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases:+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies.">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li><li>Ericsson, C., Franz&#233;n, B., Nist&#233;r, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling,+cryopreservation,+extraction,+and+use+for+proteomic+analysis.">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li><li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues.">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li><li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling.">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li><li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>B&#246;rner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues.">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li><li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+disease:+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology.">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li><li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein purification protocols. , (2004).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bicinchoninic+Acid+(BCA)+Assay+for+Protein+Quantitation.">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li><li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations.">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li><li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease.">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li></ol>

El protocolo aquí descrito se utiliza para el fraccionamiento citoplasmático y nuclear de las biopsias intestinales. Las proteínas purificadas no son desnaturalizadas y puede ser utilizadas no sólo en el análisis de western blot como se muestra en la figura 2 y 3 y también en ensayos que requieren proteínas doblado nativo como inmunoprecipitación, análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA) o electroforesis en gel de poliacrilamida nativo (página).
...

Las proteínas participan en casi todas las funciones biológicas dentro de una célula y cualquier variación en su estructura, la cantidad o la ubicación puede conducir a un escenario de patógeno. Métodos de fraccionamiento de muestras de tejido son un método útil para reducir la complejidad de la enfermedad relacionados con el análisis de la proteína. Algunos estudios utilizan información de localización de la proteína o enriquecen una proteína de un compartimento celular específico, por lo que un protocolo reproducible fraccionamiento de proteínas intactas es útil para responder a ciertas cuestiones biológicas. Determinación de la localización subcelular de las proteínas y vigilar su redistribución compartimentación o interacciones en basal y las condiciones de la enfermedad ayudará a identificar la enfermedad relacionada con las diferencias funcionales1,2. Así, este método pretende fraccionar reproducible las biopsias de tejido intestinal, frescas y congeladas, en compartimentos subcelulares citoplásmicas y nucleares.
Las muestras de biopsia intestinal habitualmente se obtienen durante la endoscopia procedimientos3 (figura 1) y pueden ser utilizadas eficazmente para la cuantificación de la proteína o los estudios de inmunoprecipitación. Puesto que las muestras de tejido del intestinal epitelios contiene proteínas que pueden estar directamente involucradas en la patogénesis de la enfermedad4, las muestras de biopsia intestinal son una fuente muy valiosa para la identificación exitosa de específicos de la enfermedad intestinal proteínas. Muestras de tejido congelado, paciente almacenados junto con la información clínica son recursos útiles para el análisis de la proteína, y una preparación simple y reproducible es una cuestión clave para proporcionar información de compartimentación celular utilizando cantidades limitantes de congelados tejido5.
Hay varios kits disponibles en el mercado para la separación de fracciones celulares, pero son más caras y generalmente más lento que el protocolo presentado aquí. Protocolos basados en varios pasos centrifugación degradado y gradientes continuos también se han utilizado previamente para el fraccionamiento de los diversos compartimentos celulares en diferentes tejidos6,7. Sin embargo, mantener la consistencia de gradientes continuos suele ser una tarea difícil. Similares protocolos basados en la secuencial lisis de las membranas se han descrito anteriormente pero generalmente necesitan más de dos tampones y las manos el tiempo es más largo8 .
Fraccionamiento de muestras de tejido, tener en cuenta ese tejido muestras presentes célula-célula y célula-matriz de interacciones que son no presentes en células cultivadas e importantes cuando proceder a la extracción de proteínas. El adecuado desglose entre células y matriz extracelular sin afectar la calidad de la proteína será un factor crítico en el tejido intestinal proteínas aislamiento9. En este protocolo, contactos célula-célula y célula matriz primero se rompen, liberando las células y permitiendo que el búfer llegar a las células individuales. Para evitar la proteína-compartimiento de mezcla antes del fraccionamiento, la ruptura de los contactos debe ocurrir sin alterar la integridad de las células o las membranas nucleares.
Por el enriquecimiento de distintas proteasas en la mucosa intestinal10, es importante para el control de la degradación de la proteína durante la extracción. Para minimizar la potencial degradación de las proteínas, múltiples inhibidores de proteasa deben incluirse en los buffers de extracción de proteína. Además, si extractos van a utilizarse para el análisis funcionales, es esencial para evitar la desnaturalización de las proteínas o la proteólisis, pues esto ocasionará una pérdida de proteína actividad11. Para ello, el protocolo se lleva a cabo a 4 ° C y fresco phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) se añade a los buffers en una concentración final de 0,1 mM justo antes de usar además inhibir la proteólisis.
El primer paso en el fraccionamiento celular es interrupción de tejido y lisis celular. Como se mencionó anteriormente, el objetivo es separar las células y les abren con mínimo daño de rotura. Las muestras de tejido intestinal deben ser homogeneizadas y lisis de las células para lograr máxima rotura de la membrana celular. En este protocolo, utilizamos una batidora de mano motorizado para romper el tejido intestinal que se homogeneiza dentro de segundos por medio de la acción de Vortex de alta velocidad. Después de la homogeneización, se incuban las células del tejido en un tampón hipotónico que estallará la membrana de la célula pero mantendrá los núcleos intactos, seguido por la adición de un detergente no desnaturalizantes (nonil phenoxypolyethoxylethanol) y un vortex corto para separar los núcleos de la fracción citoplasmática. Después de la separación del citoplasma, la membrana celular de los núcleos es irrumpió en un buffer hipertónico con agitación.
El método presentado aquí es un método adecuado para el fraccionamiento subcelular de las biopsias intestinales frescos y congelados que se han obtenido durante procedimientos endoscópicos y oscilan entre los 2 y 10 mg de peso. El protocolo es fácil y reproducible y se podría realizar utilizando equipos de laboratorio básicos y reactivos en menos de una hora.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">HEPES</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4034-1kg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">KCl</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">EDTA</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">5588886-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">DTT</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">PMSF</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Proteinase and phosphatase inhibitors</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A32959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">NP-40&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CA-630</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">BCA assay</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23227</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Disposable plastic pestles</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z359947-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Dounce homogeneizer</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:128px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Shacker</td>
			<td style="width:128px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">MS3 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens

El propósito de este protocolo es fraccionar tejido intestinal humano obtenido por endoscopia en compartimentos citoplásmicos y nucleares para el análisis de localización de proteínas específicas o complejos de proteína en Estados diferentes del tejido (es decir, saludable frente a la enfermedad). Este método es útil para el fraccionamiento de ambas muestras de tejido intestinal frescos y congelados; es fácilmente accesible para todos los laboratorios y no requiere mucho tiempo.

La figura 1 muestra una hematoxilina eosina de una sección de la biopsia intestinal con las vellosidades intactas y las estructuras de la cripta.
Resultados representativos de fraccionamiento citoplasmática y nuclear mediante este protocolo se muestran en las figuras 2 y 3. En el experimento se muestra en la figura 2, un fresco (Fh) y...

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Aquí, presentamos un protocolo para realizar un fraccionamiento celular simple para la separación subcelular de proteínas citoplásmicas y nucleares en biopsias intestinales humanas frescas y congeladas.

Fraccionamiento subcelular de especímenes gastrointestinales frescos y congelados

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Investigación

Inmunología e Infección

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Los análisis competitivos de Homing para el Estudio de la tripa-trópico migración de células T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Protocolos optimizados para<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Gestión Strain: Congelado Stock Conservación y Mantenimiento en ratones desnudos atímicos

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Un protocolo simple y rápida para no enzimáticamente disociarse Tejidos Humanos frescas para el Análisis de los linfocitos infiltrantes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Transformación de la levadura probiótica y su recuperación de tejidos gastrointestinales inmune después de alimentación forzada oral en ratones

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

La detección de alto rendimiento de los patógenos respiratorios de especímenes animales por PCR nanoescala

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Microscopía de Fluorescencia de Células Vivas para Investigar la Localización de Proteínas Subcelulares y Cambios de Morfología Celular en Bacterias

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Aislamiento de subconjuntos de macrófagos y células estromas de especímenes miocárgonos humanos y de ratón

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...