Name: subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Författarna erkänner stöd av Ander Lopez och Miren Telletxea för video inspelning och redigering. ACR är finansierat av en Ikerbasque gemenskap och ett forskningsprojekt från Asociación de Celiacos Madrid (ACM). JRB är finansierade av projektet ISCIII-PI16/00258 och medfinansieras av Europeiska unionen ERUF/ESF ”ett sätt att göra Europa”. ÄR finansieras av projektet forskningsbidrag 2015111068 av baskiska Department of Health. IRG och AJM stöds av pre fellowship bidrag från den UPV/EHU och baskiska utbildningsdepartementet, respektive.

Denna studie har godkänts av etikprövningsnämnd Cruces University Hospital och analyser utfördes efter informerat samtycke erhållits från alla ämnen eller deras föräldrar.
1. biopsi samling
Obs: Biopsi prover från distala tolvfingertarmen patienter erhålls under rutinmässiga diagnos endoskopi hantera biopsier intervallet mellan 2 och 10 mg i vikt. Biopsier vävnad är en komplex vävnad som består av olika celltyper inklusive epitelial, immun och endotelc...

<ol>
	<li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li><li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization.">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).</li><li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases:+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies.">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li><li>Ericsson, C., Franz&#233;n, B., Nist&#233;r, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling,+cryopreservation,+extraction,+and+use+for+proteomic+analysis.">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li><li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues.">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li><li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling.">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li><li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>B&#246;rner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues.">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li><li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+disease:+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology.">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li><li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein purification protocols. , (2004).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bicinchoninic+Acid+(BCA)+Assay+for+Protein+Quantitation.">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li><li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations.">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li><li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease.">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li></ol>

I protokollet som beskrivs här används för den nukleära och cytoplasmiska fraktioneringen av intestinal biopsier. De renade proteinerna är inte denatureras och kan användas inte bara i western blot analys som visas i figur 2 och 3 men också i analyser som kräver native-viks proteiner såsom immunoprecipitation, elektroforetiska mobilitet Skift assay (EMSA) eller infödda polyakrylamid gelelektrofores (sidan).
Den beskrivna metoden är bero...

Proteiner delta i nästan alla biologiska funktioner i en cell och varje variation i sin struktur, kvantitet eller plats kan leda till ett patogena scenario. Vävnaden prov fraktionering metoder är en användbar strategi för att minska komplexiteten vid sjukdom med protein analyser. Vissa studier använda protein lokaliseringsinformation eller berika ett protein från en specifik mobilfack, så ett protokoll för reproducerbara fraktionering av intakta proteiner är användbart att besvara vissa biologiska frågor. Att bestämma subcellulär lokalisering av proteiner och övervaka deras compartmental omfördelning eller interaktioner på basal och sjukdomstillstånd hjälper dig identifiera sjukdom med funktionella skillnader1,2. Denna metod syftar således, till reproducibly fractionate intestinal vävnadsbiopsier, både färska och frysta, i cytoplasmiska och nukleära subcellulär fack.
Intestinal biopsiprover erhålls rutinmässigt under endoskopi förfaranden3 (figur 1) och kan användas effektivt för protein kvantifiering eller immunoprecipitation studier. Eftersom vävnadsprover från tarmens epitelceller kommer innehålla proteiner som kan vara direkt inblandade i patogenesen sjukdom4, är intestinal biopsiprover en mycket värdefull källa för framgångsrik identifiering av intestinal sjukdomsspecifika proteiner. Lagrade frysta, patientens vävnadsprover tillsammans med de kliniska uppgifterna är användbara resurser för proteinanalys, och en enkel och reproducerbara provberedning är en nyckelfråga att ge cellen Kategoriserad information med hjälp av begränsande mängder fryst vävnaden5.
Det finns flera kommersiellt tillgängliga kit för separation av cellulära fraktioner, men dessa är dyrare och allmänt mer tidskrävande än protokollet presenteras här. Protokoll baserat på flera steg gradient centrifugering och kontinuerlig lutningar har också tidigare använts för fraktioneringen av olika cellulära fack i olika vävnader6,7. Att upprätthålla konsekvens av kontinuerlig lutningar är dock ofta en svår uppgift. Liknande protokoll baserat på de sekventiella lys av membran har beskrivits tidigare men de generellt behöver mer än två buffertar och händerna på tid är längre8 .
När installera vävnadsprover, ha i åtanke att vävnadsinrättningarna prover nuvarande cell-cell och cell-matrix interaktioner som är både inte förekommer i odlade celler och viktigt när vidare till protein utvinning. Ordentlig fördelningen mellan celler och extracellular matris utan att påverka protein kvaliteten kommer att vara en kritisk faktor i Tarmvävnaden protein isolering9. I detta protokoll bryts cell-cell och cell-matrix kontakter först, släppa celler och låta bufferten att nå de enskilda cellerna. Undvik protein-fack blandning före fraktionering, måste fördelningen av kontakterna ske utan att förändra integriteten hos celler eller de kärn-membran.
På grund av berikning av olika proteaser i tarmslemhinnan10är det viktigt att kontrollera protein nedbrytningen under utvinning. För att minimera den potentiella proteinnedbrytning, måste flera proteashämmare inkluderas i protein utvinning buffertar. Dessutom om extrakt kommer att användas för funktionella analyser, är det viktigt att undvika denaturering av proteiner eller proteolys eftersom detta kommer att orsaka en förlust av protein aktivitet11. För detta ändamål, protokollet utförs vid 4 ° C och färska phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF) läggs till buffertar med en slutlig koncentration på 0,1 mM precis före användning att ytterligare hämmar proteolys.
Det första steget i cell fraktionering är vävnad störningar och cellys. Som tidigare nämnts, är syftet att dela upp celler och bryta dem öppna med minimal skada. Intestinal vävnadsprover måste homogeniseras och cellerna lyserat för att uppnå maximal brott på cellmembranet. I detta protokoll använder vi en motoriserad mortelstöt mixer för att bryta den Tarmvävnaden som är homogeniserad inom sekunder genom hög hastighet vortexa åtgärder. Efter homogenisering inkuberas vävnadsceller i en hypoton buffert som kommer att brista cellmembranet men kommer att hålla atomkärnor intakt, följt av tillägg av ett icke-denatureringen rengöringsmedel (nonylfenol phenoxypolyethoxylethanol) och en kort vortex till separata kärnor från den cytoplasmiska fraktionen. Efter avlägsnande av cytoplasman, är kärnor cellmembranet brast i en hyperton buffert med skakade.
Presenteras här är en lämplig metod för den subcellulär fraktioneringen av färska och frysta intestinal biopsier som har erhållits under endoskopisk förfaranden och intervallet mellan 2 och 10 mg i vikt. Protokollet är lätt och reproducerbara och kunde utföras med grundläggande laboratorieutrustning och reagenser i under en timme.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">HEPES</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4034-1kg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">KCl</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">EDTA</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">5588886-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">DTT</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">PMSF</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Proteinase and phosphatase inhibitors</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A32959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">NP-40&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CA-630</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">BCA assay</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23227</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Disposable plastic pestles</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z359947-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Dounce homogeneizer</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:128px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Shacker</td>
			<td style="width:128px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">MS3 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens

Syftet med detta protokoll är att fractionate mänskliga Tarmvävnaden erhålls genom endoskopi i kärn- och cytoplasmiska fack för lokalisering analys av specifika proteiner eller proteinkomplex i olika vävnad staterna (dvs, friska vs. sjukdom). Denna metod är användbar för fraktioneringen av både färska och frysta Tarmvävnaden prover; Det är lättillgängligt för alla laboratorier och inte tidskrävande.

Figur 1 visar en hematoxylin eosin färgning av intestinal biopsi tvärsnitt med intakt villi och crypt strukturer.
Representativa resultat av kärn- och cytoplasmiska fraktionering som använder detta protokoll visas i figurerna 2 och 3. I experimentet visas i figur 2, en fräsch (Fh) och en fryst (Fz) biopsi var samtidigt fractionated...

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Här presenterar vi ett protokoll för att utföra en enkel cellulära fraktionering för subcellulär separation av cytoplasmisk och nukleära proteiner i mänskliga färska och frysta intestinal biopsier.

Subcellulär fraktionering från färska och frysta gastrointestinala exemplar

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Kombination av självhäftande tejp grundad på provtagning och fluorescens På plats Hybridisering för snabb upptäckt av Salmonella På färskvaror

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Konkurrenskraftiga Homing Analyser för att studien Gut-tropism T cell migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolering av Pseudomonas aeruginosa Kolonisera Murine mag-tarmkanalen

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Optimerade protokoll för<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Draghantering: Fryst Stock Bevarande och underhåll i atymiska nakna möss

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel och snabb protokoll till icke enzymatiskt dissociera Färska mänskliga vävnader för analys av lymfocyter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion av murina tarminflammation med adoptiv överföring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hög</sup&gt; T-celler i möss med immunbrist

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Omvandling av probiotiska Jäst och deras återhämtning från Gastrointestinal Immune Vävnader Efter oral sondmatning hos möss

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Hög genomströmning Upptäckt av luftvägspatogener i Animal Prover av nano PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Live-Cellfluorescens mikroskopi för att undersöka subcellulära protein lokalisering och cellmorfologi förändringar i bakterier

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Isolering av makrofager subsets och stromaceller från Human-och mus-Myokarprover

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...