Name: in vivo electrophysiological measurement of compound muscle action potential from the forelimbs in mouse models of motor neuron degeneration
Uploaded: 2018-06-15T14:30:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration at JoVE.com

מחקר זה היא נתמכה על ידי קו ליובן ('פותחים העתיד' ו C1), הקרן המדעית מחקר פלנדריה (FWO-Vlaanderen), קרן Latran תיירי, les חדר מרווח וחדיש האגודה Belge מחלות נוירו-Musculaires (ABMM), ניוון שרירים האגודה (מד א), עמותת ALS ו את הליגה ALS (בלגיה). PVD מחזיקה investigatorship בכיר של FWO-Vlaanderen. RP נתמכה על ידי מענקים מאירלנד המרפאה מתקנת המרכזית (CRC) והוא נתמך כעת האוניברסיטה הלאומית של אירלנד (נוי), את FWO.

כל החיות שוכנו בתנאים סטנדרטיים בהתאם לקווים המנחים של ליובן KU - האוניברסיטה של לופן וההנחיות של אירופה (האיחוד האירופי דירקטיבה 2010/63/האיחוד האירופי על ניסויים בבעלי חיים). ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי הוועדה המקומית האתית של לופן KU.
1. בעלי חיים והכנה הרדמה
<ol><li>לגרום הרדמה העכבר עם שאיפה איזופלוריין/חמצן. השתמש 4% של איזופלוריין עבור אינדוקציה של ההרדמה ו- 2-3% תחזוקת 2.5 L/min זרימת החמצן. להתאים את אחוזי איזופלוריין התחזוקה של ההרדמה על פי מצבו של העכבר, קרי, עכברים קטן וחלש לדרוש הרדמה פחות. לאשר הרדמה הולם למשל, על ידי הפעלת לחץ עדין על hindlimb הליכה pad כדי לבדוק העדר רפלקס הנסיגה כאב.</li>
	<li>בקרת טמפרטורת הגוף העכבר באמצעות צלחת חימום תרמוסטטי ב 37 ° C כדי למנוע את הירידה של טמפרטורת הגוף במהלך הרדמה.</li>
	<li>התאם את העכבר עם nosecone לצורך תחזוקה של ההרדמה. ודא כי החיה יש אספקה מספקת של חמצן על-ידי בדיקה כי nosecone אינו חוסם את דרכי הנשימה, כי החיה נושמת בהתמדה.</li>
	<li>במהלך ההקלטה, לפקח אם העכבר הוא מורדם מספיק על ידי התבוננות את קצב הנשימה (כ 1 הרץ בהרדמה) ואת העדר רפלקס הנסיגה על לחץ מתון. להעלות את ריכוז איזופלוריין באופן ידני אם ההרדמה אינו עמוק מספיק.</li>
	<li>לאחר המדידות, להשאיר את העכבר כדי לשחזר את הצלחת חימום או החום של מנורת אינפרא-אדום עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות, למשך כ- 2-5 דקות. תעזוב את העכבר ללא התערבות, בחברה של עכברים אחרים עד זה שיחזר מלאה מן ההרדמה.</li>
</ol>2. מדידה של CMAP הינד - ו Forelimbs
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig1.jpg"> איור 1. מיקום האלקטרודות למדידות CMAP. מיקום האלקטרודות מוצג עבור הינד-(א) ו- forelimbs (B). האלקטרודות ממוספרים כדלקמן: 1: אנודת ו- 2: קטודית מגרה אלקטרודות, 3: הקלטה פעיל אלקטרודה, 4: התייחסות אלקטרודה, ו- 5: אלקטרודת הארקה. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol><li>השתמש האלקטרודות המחט 27 G למדידות CMAP hindlimb ו- forelimb. ראה איור 1 המקומות המומלצים של מיצוב אלקטרודה.</li>
	<li>במקום אלקטרודות על hindlimb כדלקמן.<ol>
<li>הנח את העכבר על משטח חימום במצב שכיבה. להרחיב את hindlimb בברך וצרף הכפה על משטח העבודה באמצעות סרט דביק (איור 1 א').</li>
		<li>מקם את האלקטרודות מגרה subcutaneously משני צידי השת עם מרחק של 2 ס מ (1 = אנודת ו- 2 = קטודה) בין האלקטרודות. הרם את העור כדי להוסיף את המחט בניצב דרך העור לדחוף כ 5 מ מ של המחט מתחת לעור מבלי ניקב את השרירים המשמשים כבסיס.</li>
		<li>באופן דומה, במקום האלקטרודה הקלטה (3) subcutaneously יישור לשריר הסובך. להוסיף את ההפניה אלקטרודה (4) subcutaneously ליד גיד אכילס בזווית של 30 מעלות ולהשאיר 2-5 מ מ המחט מתחת לעור. מקום האלקטרודה הקרקע (5) subcutaneously בצד העכבר בצורה דומה כמו האלקטרודות מגרה, אבל המיקום של אלקטרודה זו אינה קריטית עבור המידה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>במקום אלקטרודות על forelimbs כדלקמן.<ol>
<li>מיקום העכבר על משטח חימום נמצא במצב פרקדן שימוש דבק כדי להאריך את שתי forelimbs על צידי הגוף (איור 1B).</li>
		<li>מקם את האלקטרודות מגרה (1 = אנודת ו- 2 = קטודה) subcutaneously משני צידי forelimb כדי להתיישר עם העצב מקלעת הזרוע. הרם את העור כדי להוסיף את המחט בניצב דרך העור לדחוף כ 5 מ מ של המחט מתחת לעור מבלי ניקב את השרירים המשמשים כבסיס.</li>
		<li>במקום האלקטרודה הקלטה (3) subcutaneously מעל השריר הדו-ראשי על ידי הרמת העור. במקום האלקטרודה הפניה (4) על הידיות הליכה 3 מ מ עומק בזווית של 30 מעלות. במקום האלקטרודה הקרקע (5) subcutaneously בצד של העכבר. הערה: אלקטרודות נמצאים קרוב מאוד אחד את השני בתוכנית התקנה זו. למנוע אלקטרודות נוגעים אחד בשני כמו זה מעוות את ההקלטה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. חדרי קירור והקפאה
<ol><li>להתחיל הגירוי ללחוץ על הכפתור גירוי חוזרים ונשנים ביחידה בקר, סובב את כפתור בקר עוצמת כדי להגביר את הגירוי. לעורר כל האקסונים באמצעות הדופק לשנייה 1 עם 0.1 ms גירוי משך. בחר את התדירות הנכונה והמשך מתוך התפריטים הנפתחים בתוכנה.</li>
	<li>כדי להגיע supramaximal גירויים (אמא 5-20; ב demyelinating תנאים ל-60 מא), להחיל גירויים הגוברת על-ידי הפעלת הידית בקר עוצמת עד משרעת של התגובה CMAP מפסיק להגדיל. משם להמשיך להגדיל את הגירוי ב 20% על מנת להבטיח משרעת CMAP הגיעה תגובתה מקסימלי. סוף הגירוי על ידי ללחוץ על הכפתור גירוי חוזר ונשנה שוב.</li>
	<li>השתמש בכלי סמן כדי לציין את הנקודות הבאות בהקלטה: חניכה של הגירוי, חניכה של התגובה, שיא חיובי המרבי, שיא שלילי המרבי (איור 2).</li>
	<li>לקבוע ההשהיה (ב ms) כמו עיכוב של אתחול של הגירוי כדי אתחול של התגובה (איור 2). להגדיר את החניכה של התגובה כנקודת המוקדמים מתחילה משרעת להגדיל. השתמש ההשהיה demyelination ב האקסונים.</li>
	<li>למדוד את משרעת (mV) מן השלילי המקסימלי לפסגת חיובי המרבי (איור 2). השתמש את סדר הגודל של משרעת לתאם מספר אקסונים פונקציונלי.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig2.jpg"> באיור 2. תמונת הנציגה CMAP התגובה. תגובה CMAP תיאורית המציינת את הנקודות המשמש לחישוב משרעת וההשהיה (A). השהיית נקבעת על ידי העיכוב של הגירוי תחילתה של התגובה CMAP. משרעת השיא אל שיא נמדד השלילי המקסימלי לשיא חיובי המרבי של הגל biphasic. הקלטות נציג בעל חיים שאינו הטרנסגניים בריא (B), בעל חיים חולה עם השהיה ממושכת, משרעת מופחתת (C). <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="6"><li>מאז המיקום המדוייק של האלקטרודות יכול להשפיע על ערך התוצאה של ההקלטה, להחליף את האלקטרודות ולמדוד את העצב אותו עבור שלוש פעמים באמצעות גירוי supramaximal על מנת להבטיח התגובה הגדולה ביותר מתקבל. השתמש הממוצע של ההקלטות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> N Engl J Med. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Prior, R., Van Helleputte, L., Benoy, V., Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+axonal+transport:+A+common+pathological+mechanism+in+inherited+and+acquired+peripheral+neuropathies.">Defective axonal transport: A common pathological mechanism in inherited and acquired peripheral neuropathies.</a> Neurobiol Dis. , 300-320 (2017).</li><li>de Carvalho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrodiagnostic+criteria+for+diagnosis+of+ALS.">Electrodiagnostic criteria for diagnosis of ALS.</a> Clin Neurophysiol. 119 (3), 497-503 (2008).</li><li>Krajewski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurological+dysfunction+and+axonal+degeneration+in+Charcot-Marie-Tooth+disease+type+1A.">Neurological dysfunction and axonal degeneration in Charcot-Marie-Tooth disease type 1A.</a> Brain. 123 (Pt 7), 1516-1527 (2000).</li><li>Raynor, E. M., Ross, M. H., Shefner, J. M., Preston, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+between+axonal+and+demyelinating+neuropathies:+identical+segments+recorded+from+proximal+and+distal+muscles.">Differentiation between axonal and demyelinating neuropathies: identical segments recorded from proximal and distal muscles.</a> Muscle Nerve. 18 (4), 402-408 (1995).</li><li>Zielasek, J., Martini, R., Toyka, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+P0-deficient+mice+resemble+human+hereditary+neuropathies+linked+to+P0+gene+mutations.">Functional abnormalities in P0-deficient mice resemble human hereditary neuropathies linked to P0 gene mutations.</a> Muscle Nerve. 19 (8), 946-952 (1996).</li><li>Arnold, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Motor+Unit+Number+Estimation+(MUNE)+Measuring+Compound+Muscle+Action+Potential+(CMAP)+in+Mouse+Hindlimb+Muscles.">Electrophysiological Motor Unit Number Estimation (MUNE) Measuring Compound Muscle Action Potential (CMAP) in Mouse Hindlimb Muscles.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li><li>Schulz, A., Walther, C., Morrison, H., Bauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electrophysiological+measurements+on+mouse+sciatic+nerves.">In vivo electrophysiological measurements on mouse sciatic nerves.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu,Zn+superoxide+dismutase+mutation.">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).</li><li>Mitchell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+human+wild-type+FUS+causes+progressive+motor+neuron+degeneration+in+an+age-+and+dose-dependent+fashion.">Overexpression of human wild-type FUS causes progressive motor neuron degeneration in an age- and dose-dependent fashion.</a> Acta Neuropathol. 125 (2), 273-288 (2013).</li><li>Robertson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+new+pmp22+transgenic+mouse+line+with+other+mouse+models+and+human+patients+with+CMT1A.">Comparison of a new pmp22 transgenic mouse line with other mouse models and human patients with CMT1A.</a> J Anat. 200 (4), 377-390 (2002).</li><li>Huxley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+varying+levels+of+PMP22+expression+and+the+degree+of+demyelination+and+reduction+in+nerve+conduction+velocity+in+transgenic+mice.">Correlation between varying levels of PMP22 expression and the degree of demyelination and reduction in nerve conduction velocity in transgenic mice.</a> Hum Mol Genet. 7 (3), 449-458 (1998).</li><li>Turner, B. J., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenics,+toxicity+and+therapeutics+in+rodent+models+of+mutant+SOD1-mediated+familial+ALS.">Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS.</a> Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).</li><li>Manganelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+conduction+velocity+in+CMT1A:+what+else+can+we+tell.">Nerve conduction velocity in CMT1A: what else can we tell.</a> Eur J Neurol. 23 (10), 1566-1571 (2016).</li><li>Cornett, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Variability+of+Childhood+Charcot-Marie-Tooth+Disease.">Phenotypic Variability of Childhood Charcot-Marie-Tooth Disease.</a> JAMA Neurol. 73 (6), 645-651 (2016).</li><li>Jacobson, W. C., Gabel, R. H., Brand, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+vs.+fine-wire+electrode+ensemble-averaged+signals+during+gait.">Surface vs. fine-wire electrode ensemble-averaged signals during gait.</a> J Electromyogr Kinesiol. 5 (1), 37-44 (1995).</li><li>Parker, V., Warman Chardon, J., Mills, J., Goldsmith, C., Bourque, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramaximal+Stimulus+Intensity+as+a+Diagnostic+Tool+in+Chronic+Demyelinating+Neuropathy.">Supramaximal Stimulus Intensity as a Diagnostic Tool in Chronic Demyelinating Neuropathy.</a> Neurosci J. 2016, 6796270 (2016).</li><li>Benoy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Improved+HDAC6+Inhibitors+as+Pharmacological+Therapy+for+Axonal+Charcot-Marie-Tooth+Disease.">Development of Improved HDAC6 Inhibitors as Pharmacological Therapy for Axonal Charcot-Marie-Tooth Disease.</a> Neurotherapeutics. 14 (2), 417-428 (2017).</li><li>Xia, R. H., Yosef, N., Ubogu, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+caudal+tail+and+sciatic+motor+nerve+conduction+studies+in+adult+mice:+technical+aspects+and+normative+data.">Dorsal caudal tail and sciatic motor nerve conduction studies in adult mice: technical aspects and normative data.</a> Muscle Nerve. 41 (6), 850-856 (2010).</li><li>Srivastava, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+HSPB1+overexpression+in+neurons+is+sufficient+to+cause+age-related+motor+neuronopathy+in+mice.">Mutant HSPB1 overexpression in neurons is sufficient to cause age-related motor neuronopathy in mice.</a> Neurobiol Dis. 47 (2), 163-173 (2012).</li><li>Arnold, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Biomarkers+in+Spinal+Muscular+Atrophy:+Preclinical+Proof+of+Concept.">Electrophysiological Biomarkers in Spinal Muscular Atrophy: Preclinical Proof of Concept.</a> Ann Clin Transl Neurol. 1 (1), 34-44 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

שיטות הקלטה רגיש חיוניים להערכת את התקדמות המחלה, במיוחד את היעילות של טיפול במודלים חייתיים של הפרעות עצביים. לקבוע את CMAPs היא טכניקה אלקטרופיזיולוגיות פולשנית, אשר באופן שגרתי משמש במרפאות ובבתי setups ניסיוני להעריך גיאן עצבי והפרעות נוירופתי3,18. כאן, אנו מתארים שימוש חדש עבור CMAP הקלטה בעכברים על מנת למדוד את תסמונת גיאן מקלעת העצב של forelimb. השיטה הציג מאפשרת הערכה האורך יותר תכליתי ומפורט של תפקוד העכבר דגמי הקשורים ניוון מוחיים.
האלקטרודות המחט מעט יותר פולשנית מאשר הטבעת אלקטרודות, במיוחד בלימודי האורך חייבים להקפיד למזער נזק לרקמות. חסרון אחד אפשרי של השיטה היא פגיעה הנוצרת מן פירסינג של עצבים או שרירים. עם זאת, לאחר מיקום תת עורית זהיר האלקטרודות, פציעה של שיבוש של השרירים, העצבים ניתנת למניעה. לעומת השיטה באמצעות הטבעת אלקטרודות, השיטה המובאת כאן אינו מצריך גילוח של הפרווה של חלקים גדולים של הגוף. כתוצאה מכך, אין שום אי נוחות או השפעה על הומיאותרמיות לבעל החיים.
מיקום האלקטרודות הוא קריטי עבור ההקלטה נכונה ועקבית של CMAP amplitudes, השהיות ארוכות יותר. מומלץ למיקום האלקטרודות, כדי לבצע מדידות שלושה בכל אתר כדי לוודא כי גירוי מקסימאלית, תגובות מושגות. הקלטות הנכון צריך לייצר עקומות biphasic כפי שמתואר באיור2. כדי לתקנן את השיטה, העכברים הטרנסגניים-שאינם בלי עצב פציעה הם הדגמים הטובים ביותר להקים האלקטרודה נכונה ועקבית מיצוב לגירוי אופטימלית. מחט לשימוש חוזר אלקטרודות מתאימים לשימוש חוזר אם הם באופן קבוע סטריליים, למשל עם גלוטראלדהיד במשך 20 דקות בין בעלי חיים, ולא בדק עבור חדות.
בעכברים מבוגרים בריאים, amplitudes CMAP הקליט עם השיטה הציג בדרך כלל 80-100 mV לאחר גירוי בעצב את ואת על מקלעת הזרוע. זה בעיקר גדול יותר התגובות נמדד עם טבעת אלקטרודות, כי יש עכבה גבוהה יותר הנגרמת על ידי העור האלקטרודות טבעת מפיקה תוצאות של 20-40 mV8,19,20. במודלים של העכבר ALS, להקטין amplitudes CMAP לאחר מגרה בעצב או מקלעת ב שיתוק גפיים ל mV 10-30. היקף משרעת CMAP הוא קטן יותר בבעלי חיים צעירים מאז משרעת CMAP עולה במהלך פיתוח21.
השיטה שבה נתאר כאן היא שימושית במיוחד במודלים של העכבר של ALS, שבה denervation, גירעונות מנוע עוקבות, מתרחשים לפני hindlimbs מאשר forelimbs13. בנוסף denervation, השיטה היתה לזהות reinnervation אשר נקבע כמו ירידה מנעו או מפגר משרעת CMAP. הירידה דרמטית משרעת CMAP השרירים של hindlimbs כבר בגיל תחילת סימפטום מעכבת את המעקב של עוד התקדמות המחלה; ככל amplitudes CMAP להגיע ערכים נמוכים מאוד בשלב מוקדם של המחלה, הם לא להקטין עוד יותר במהלך תהליך המחלה. לעומת זאת, עצב אובדן מתקדם בקצב איטי יותר מקלעת העצב של forelimbs ומציגה אופציה יותר רגיש למדידת התקדמות המחלה על משך זמן ארוך יותר של המחלה. יתר על כן, forelimbs פחות מנוונת יכול לספק אתר חזק יותר להערכת גישות טיפוליות אשר מטרתם שיפור תפקוד עצב.
ברור כי הטכניקה הציג מספק אפשרויות הרומן האפיון של העכבר מודלים של הפרעות neuromuscular כאלה. CMAP הקלטות עם מחט אלקטרודות בעצב, על מקלעת היא שיטה מהירה לשחזור כדי להעריך את אובדן עצב demyelination הינד-כמו גם כמו forelimbs. הרגישות של השיטה מאפשרת גילוי של עצב גירעונות אפילו לפני בולטים חסרונות המנוע ניתן להקליט, ובכך מאפשרת כימות מוקדם של פגמים אלה. יתר על כן, האפשרות של בדיקות חוזרות ונשנות מפחית את מספר החיות הנדרש ומספק סקירה מפורטת של ההתקדמות של ומחלות neuromuscular נוירופתי באתרים שונים בחיה בודדים.

אלקטרופיזיולוגיה משמש ככלי אבחוני הפרעות neuromuscular כגון הפרעות מוטור נוירון, plexopathies, מחלות עצבים, הפרעות צומת עצב-שריר myopathies. ב נוירודגנרטיביות (ALS), שבו מושפעים בעיקר את הנוירונים מנוע, עצב נזק של שיתוק שרירים1 משתקפים באופן מופחת CMAP amplitudes עצב הולכה לימודי (רכיבי NC). בשארקו-מארי-טות (CMT) ניוון עצב והן demyelination יכול להיות משוער ב העצבים ההיקפיים באמצעות רכיבי NC2. ניתן להשתמש בטכניקה זו על. שאישרת את האבחנה גם כדי להעריך את התקדמות המחלה3,4. רכיבי NC לאפשר הערכת של פתולוגיה עצב, אשר הסיק מן בסדר הגודל של משרעת פוטנציאל הפעולה5, והאריך מידת demyelination - אשר התוצאות מהירות הולכה מופחתת, השהיות הדיסטלי, או בלוק בהולכה 6.
CMAP מדידה היא שיטה מהירה ורגיש כדי להעריך את הובלת העצבים הן בני אדם ועכברים. ואילו בחולים השרות החשאי מבוצעות באופן שגרתי באתרים שונים כדי להקליט שונים העצבים והשרירים, בעכברים, המדידות CMAP נעשים בדרך כלל רק עבור עצב להעריך את העצב פונקציונליות ב- hindlimbs. עם זאת, בכמה מחקרים בבעלי חיים זה יהיה יתרון שיא CMAP הן ביטוי - והן hindlimbs, לדוגמה, כדי לעקוב אחר התקדמות המחלה ההפרש בין קידמה - hindlimbs במודלים של העכבר ALS.
כאן, אנחנו מציגים שיטה להקלטת CMAPs מ forelimbs של עכברים באמצעות מחט אלקטרודות. בנוסף, אנו מספקים גישה מדוד CMAPs hindlimbs, כנ עם מחט אלקטרודות. מידת CMAPs של hindlimbs עם טבעת אלקטרודות הציגה7,מוקדמת יותר8. ההקלטה של CMAPs באמצעות מחט אלקטרודות היא שיטת מדידה מהירה, שהוא אינו מצריך גילוח של הפרווה, ההליך למדידת הינד - והן forelimbs לוקח רק 10 דקות לכל חיה עבור חוקר מנוסה. יתר על כן, בגישה פולשנית זו הוא ריאלי עבור מדידות חוזרות לאפשר מעקב האורך של עצבים מרובים בבעלי חיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1251px;" width="1250">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Resuable subdermal needle electrode, Pl/Ir</td>
			<td style="width:137px;">Technomed</td>
			<td style="width:145px;">TE/S61-434</td>
			<td style="width:628px;">The Needle is 13 mm (0.51&#34;) in length, 0.4 mm (27G) in diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Natus electrodiagnostic system</td>
			<td style="width:137px;">Natus Neurology</td>
			<td style="width:145px;">UltraPro S100</td>
			<td>EMG device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Synergy</td>
			<td style="width:137px;">Natus Neurology</td>
			<td style="width:145px;">version 20.1.0.100</td>
			<td>EMG software for UltraPro S100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:340px;">Physitem Controller</td>
			<td style="width:137px;">Rothacher-Medical GmbH</td>
			<td style="width:145px;">TCAT-2LV</td>
			<td>Heating pad</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:340px;">combi-vet Base Anesthesia System Digital Flowmeter with TEC 3 Vaporize</td>
			<td style="width:137px;">Rothacher &#38; Partner</td>
			<td style="width:145px;">CV 30-301-D</td>
			<td>Isoflurane Vaporizer and flowmeter</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:340px;">Iso-Vet 1000 mg/g&#160;</td>
			<td style="width:137px;">Piramal Healthcare UK Limited</td>
			<td style="width:145px;">AP/DRUGS/220/96</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:340px;">SOD1-G93A mice</td>
			<td style="width:137px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:145px;">#002726</td>
			<td>ALS tg and non-tg control littermates, only females</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:340px;">PrP-hFUS-WT3 mice</td>
			<td style="width:137px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:145px;">#017916&#160;</td>
			<td>ALS tg and non-tg control littermates, all groups balanced for males and females</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:340px;">C57BL/6Jax mice</td>
			<td style="width:137px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:145px;">#000664</td>
			<td>Non-tg mice for axotomy, male and female</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:340px;">C61-PMP22 mice</td>
			<td style="width:137px;">Mouse line was generously donated&#160; by Prof. M. Sereda (The Max Planck Institute of Experimental Medicine, G&#246;ttingen, Germany).</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>CMT tg and non-tg control littermates, all groups balanced for males and females</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo electrophysiological measurement of compound muscle action potential from the forelimbs in mouse models of motor neuron degeneration

להעריך את הפונקציונליות של ה מספק מידע מפורט על ההתקדמות של הפרעות neuromuscular כאלה. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מספקים בגישה רגיש למדידת גיאן ב בני אדם ודגמים מכרסמים. כדי להרחיב את אפשרויות טכניות אלקטרומיוגרפיה בעכברים, המדד של פוטנציאל פעולה השריר מורכבים (CMAPs) של העצב מקלעת הזרוע ב forelimb באמצעות מחט אלקטרודות מתואר כאן. הקלטות CMAP לאחר גירוי בעצב ב- hindlimbs תוארו קודם לכן. השיטה לאחרונה הציג כאן מאפשר הערכת מוליכות העצב-אתר נוסף, ובכך מספק סקירה מעמיקה יותר של הפונקציונליות עצב-שריר. השיטה מספקת מידע על המספר היחסי של אקסונים פונקציונלית והן את רמת myelination. ובכך, בשיטה זו ניתן להחיל כדי להעריך הן מחלות עצב, כמו גם התנאים של המיאלין. שיטה פולשנית זו אינו דורש מיצוי של העצב, ולכן הוא מתאים מדידות חוזרות למעקב האורך של אותה חיה. הקלטות דומה מבוצעות בכיוונונים קליניים כדי להדגיש את הרלוונטיות translational של השיטה.

מדידות אלקטרופיזיולוגיות של CMAPs באמצעות מחט אלקטרודות היא שיטה פולשנית ורגישה מאוד לעקוב אחר תפקוד עצבי לאורך זמן. בטכניקה המתוארת כאן מאפשר את ההערכה של forelimb גיאן בעכברים, לפיכך, מספק תובנות הפונקציונליות של העצב.
CMAP amplitudes ואת השהיות נמדדו הינד - ו forelimbs במהלך המחלה בשני דגמים העכבר של ALS, SOD1-G93A9 ו- PrP-hFUS-WT310 (איור 3), ולא במודל של עכברים של CMT, C61-PMP2211,12 (איור 4). ALS העכבר מודלים נוצרו על ידי ביטוי של הקשורים ל- ALS גנים אנושיים, כלומר או מוטציה SOD1 או פראי סוג FUS. בשני המודלים, עכברים לפתח ALS הדומה ניוון נוירון מוטורי מתקדמת שמוביל לשיתוק. בפקדים שאינם הטרנסגניים littermate, משרעת CMAP הינד - וגם forelimbs לא השתנו לאורך זמן (איור 3 א). מצד שני, משרעת CMAP בעצב מ hindlimb באופן דרמטי ירדו בעכברים SOD1-G93A, עוד לפני הופעת הסימפטום סביב גיל 60 ימים (ואילו הסימפטומים המוטוריים הראשונים הם נצפו בדרך כלל בגיל 3 חודשים)13 . משרעת היה 90 mV בגיל הזה בהטרנסגניים הארנבונים מאותה (הלא-tg), ואילו בעכברים SOD1-G93A זה היה רק 30 mV. היה רק ירידה נוספת מינימלי משרעת כפי התקדמה המחלה לשלב סימפטומטי מאוחר בגיל של 150 ימים. הירידה CMAP משרעת, ומכאן התנוונות אקסונים, היה מתעכב מקלעת העצב של forelimbs בהשוואה בעצב מ hindlimbs. Forelimbs, התקדמות המחלה היה גם יותר מורגש כמו CMAP משרעת ירד מ 70 mV 30 mV כאשר נמדד לפני ואחרי גילוי הגירעונות מוטורי בעכברים אלו.
במודל עכבר PrP-hFUS-WT3 של ALS, תחילתה של גירעונות מנוע מתחיל בערך בגיל 28 יום10, אשר עולה בקנה אחד עם אתחול של הירידה משרעת CMAP. זהו מודל המחלה יותר מואצת ככל העכברים להגיע בשלב הסופי בגיל 65 ימים. הירידה משרעת CMAP התרחש במהירות רבה יותר בעצב של hindlimb בהשוואה העצב מקלעת הזרוע ב- forelimb, אשר מצביע על ניוון עצב מוקדם יותר ב- hindlimbs (איור תלת-ממד). התבוננות זו תומכת התצפית הקלינית והן של מודלים אלה העכבר כפי hindlimbs משותק ובמיוחד מוקדם יותר forelimbs שנותרו תפקודית עד מאוחר שלבי תהליך המחלה.
באופן כללי, ההשהיה של גירוי כדי חניכה של פוטנציאל הפעולה הייתה קצרה יותר forelimbs בהשוואה hindlimbs (איור 3B, E). זה פשוט בגלל המרחק קצר בין מגרה את האלקטרודות הקלטה. ההשהיה מספק אינדיקציה של רמת myelination של האקסונים. התצפית שלנו הוא כי השהיות CMAP ממושך במהלך התקדמות המחלה במודלים של העכבר של ALS, למרות ALS אינה מחלה כרונית. זה סביר בשל האובדן של גדולים יותר, מהר יותר ניצוח אקסונים מוטוריים.
העכברים C61-PMP22 overexpressing 3-4 העתקים PMP22 אנושי והעכברים heterozygote מסכם את הדברים קלה מאוד CMT1A המחלה הפנוטיפ עם demyelination קלה, CMAPs מופחת, אך עם פנוטיפ גלוי11,12. 1.5-2 שנים של עכברים גיל C61-PMP22, amplitudes CMAP מופחתים, השהיות ארוכות יותר ממושך הן hindlimbs והן forelimbs (איור 4). נציג הקלטות הצגת משרעת מופחתת והתגובה מושהית בהשוואה הקלטה של נושא בריא מוצגים באיור 2CB, בהתאמה. השהיות CMAP ב forelimbs אינם מושפעים ככל בגפיים האחוריות. זה עקבי עם CMT1A חולים, חולים לעתים קרובות יותר יש קשות CMAPs מופחת או לא לגילוי הגפיים התחתונות בגלל אופי CMT כמו הפרעת תלויי-אורך14pathophysiological. בנוסף, מידת חומרת המחלה הוא מתואם עם CMAP משרעת, יותר מאשר מהירות השהיה או הולכה, כפי amplitudes לתאם עם מידת תקינות עצב14,15. עם זאת, התוצאות מראות כי שיטה זו היא רגישה מספיק זיהוי demyelinating תהליך כגון אלה נצפו CMT1A.
וריאציה של משרעת וההשהיה היה הנמוך ביותר בקבוצות שאינן הטרנסגניים (מקדם של וריאציה 2-15% ו- 1-13%, בהתאמה). לכל הטרנסגניים המקרים, היה גיוון רב יותר במידות (מקדם של וריאציה משרעת 8-51% ועבור השהיה 1-21%), אשר ככל הנראה נגרמת על ידי ההבדלים התקדמות המחלה בקרב בעלי החיים. בכל המקרים, בווריאציה היה דומה הינד - ו forelimbs. וריאציה בשימוש של המחט ואלקטרודות משטח דווח להיות דומה16.
עוצמות הגירוי הנדרש לא משתנה במידה רבה בין הלא-הטרנסגניים ומודלים ALS (איור 3C, F). באופן דומה, הגירוי הנדרש כדי להגיע supramaximal הגירוי במקרים אלה היה דומה קידמה - ו hindlimbs, מגוונים בין 5-12 אמא. ב- CMT, הדרישה עוצמות הגירוי מוגברת כבר מוכרת17 , פנוטיפ זהה נראתה בעכברים C61-PMP22 (איור 4C). כבר הסביר את התופעה על ידי עכבה חשמלית מוגברת מן השינויים endoneurial היפרטרופית17.
כדי לאשר משרעת CMAP הקליט מ forelimbs היה בשל גירוי עצבי גירוי השריר לא, ביצענו החד-צדדית axotomy חלקית על העצב מקלעת הזרוע ב בן 5 חודשים ללא-C57BL/6Jax העכברים הטרנסגניים (זכר ונקבה) ( איור 5). Axotomy ירד את משרעת CMAP מ 90 mV ל-20 mV, המציין כי רוב האקסונים נותקו במבצע. שאין כל שינוי משרעת של forelimb contralateral או את hindlimbs. תוצאה זו עולה בחריפות כי התגובה זוהה את הזרוע הדו-ראשי היה עקב גירוי עצבי, אינה תוצאה של גירוי השריר.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig3.jpg"> איור 3. משרעת CMAP השהיה, הגירוי הנדרש מעל את מהלך המחלה הינד- ו forelimbs ב- ALS העכבר מודלים. SOD1-G93A (A–C) ואת העכברים הטרנסגניים PrP-hFUS-WT3 (D–F) (tg) שאינם הטרנסגניים הארנבונים מאותה (הלא-tg) נמדדו מיד עם תחילת הסימפטומים המוטוריים, בשלב סימפטומטי, ובשנת שלב מאוחר-סימפטומים של המחלה לעבד, גיל 57, 91 ו- 147 ימים (d) או 29, 38 ו- 53 ימים עבור עכברים SOD1-G93A ו- PrP-hFUS-WT3, בהתאמה. שחור: הלא-הטרנסגניים hindlimb, שחור מקווקו: forelimb מהונדס, אפור: hindlimb מהונדס, אפור מקווקו: הטרנסגניים forelimb. התוצאות מוצגות אומר ± SD. Amplitudes (, ד) היו יציבים לאורך זמן את החיות הטרנסגניים הן הינד - והן forelimbs. בבעלי חיים מהונדס, amplitudes ירד במהלך תהליך המחלה. השהיות ארוכות יותר (B, E) היו פחות מושפעים המחלה, נצפו הבדלים מהותיים בין הינד - forelimbs, ללא קשר גנוטיפ. וריאציה של הגירוי הנדרש (C, F) היה מינימלי בכל קבוצות. עבור SOD1-G93A N = 4 בכל קבוצות חוץ tg 147 d, N = 3. עבור עכברים PrP-hFUS-WT3 בקבוצות גיל 29, 38 ו- 53, N הוא הלא-tg 4, 5 ו- 4, ולכל tg 7, 5 ו- 3 בהתאמה. סמלים מציינות את ההבדל בין קבוצות כדלקמן: *: hindlimb-tg לעומת tg hindlimb, #: הלא-tg forelimb לעומת tg forelimb, ¤: הלא-tg hindlimb לעומת forelimb-tg, אפור *: tg hindlimb לעומת tg forelimb. אנובה דו כיוונית עם Tukey של מבחן השוואות מרובות, *: p < 0.05, * *: p < 0.01, * * *: p < 0.001, * * *: p < 0.0001. #: p < 0.05, #: p < 0.01, # # #: p < 0.001, # # # : p < 0.0001. ¤: p < 0.05, הרגועים: p < 0.01, ¤¤¤: p < 0.001, ¤¤¤: p < 0.0001. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig4.jpg"> באיור 4. CMAP משרעת השהיה, הגירוי הנדרש הינד- ו forelimbs בעכברים CMT1A. העכברים הטרנסגניים C61-PMP22 (tg), שאינם הטרנסגניים הארנבונים מאותה (הלא-tg) נמדדו בגיל 1.5-2. משרעת (A) ירדו הן הינד - והן forelimbs של העכברים הטרנסגניים. השהיה (B) הוארכו ב כל האיברים בעכברים CMT, אפילו עדין בשינוי forelimbs זוהה עם מדידה זו. הדרישה עוצמת הגירוי (C) היה גדל בעכברים C61-PMP22, הדומה של פנוטיפ שזוהו בחולים CMT1A. התוצאות מוצגות אומר ± SD, עבור הלא-tg N = 4 ו- tg N = 3. אנובה דו כיוונית עם Sidak של מבחן השוואות מרובות, * *: p < 0.01, * * *: p < 0.0001. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig5.jpg"> איור 5. פוטנציאל פעולה forelimb נגרמות על ידי גירוי עצבי. כדי לא לכלול את האפשרות כי התגובה CMAP שנצפה נגרם על ידי גירוי השריר, axotomy (חלקית) בוצעה על מקלעת העצב. משרעת CMAP (A) וזמן ההשהיה (ב') נרשמו לפני (קדם) 4 ימים לאחר (פוסט) את axotomy של מקלעת בעכברים הטרנסגניים למבוגרים. Axotomy פחתה משרעת CMAP המציין כי ההיענות היתה עקב גירוי עצבי. שחור: hindlimb, אפור: forelimb contralateral, אפור מקווקו: חולשת forelimb. התוצאות מוצגות כחלק זאת אומרת ± SD, N = 2. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration at JoVE.com

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

אין ויוו מדידות אלקטרופיזיולוגיות של פוטנציאל הפעולה השריר מורכב מ Forelimbs העכבר דגמים של ניוון מוטורי נוירון

המדד של תסמונת גיאן הוא כלי שימושי כדי להעריך את העכבר דגמי הקשורים ניוון מוחיים אך לעתים קרובות הוא להחיל רק כדי לגרות בעצב הירך ב- hindlimbs. כאן, אנו מתארים שיטה למדידת השריר מורכבים פוטנציאל הפעולה (CMAP) ויוו בשרירי forelimb העכבר innervated על ידי מקלעת הזרוע.

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

מותאמים הצמד תיקון הקלטות מ-מוטור נוירון שרירים יעד השלד דג הזברה

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

במדידות Vivo אלקטרו על עצבים העכבר השת

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

אין ויוו מדידות אלקטרופיזיולוגיות של עצב הגומד עכברוש עם הבדיקות דעתנית עצב

Electrophysiology enables the objective assessment of peripheral nerve function in vivo. Traditional nerve conduction measures such as amplitude and ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; נוירון מוטון ניוון

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...