Name: crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum at JoVE.com

Nous remercions Muthugapatti Kandasamy au cœur microscopie biomédicale Université de Georgie (UGA) pour l’assistance technique et Jose-Juan Lopez-Rubio pour partager les plasmides pUF1-Cas9 et pL6. Ce travail a été soutenu par ARCS Foundation awards à D.W.C. et à H.M.K., accorde des fonds de démarrage UGA à V.M., subventions de la March of Dimes Foundation (Bourse de recherche universitaire Basil o ' Connor Starter) V.M. et US National Institutes of Health (R00AI099156 et R01AI130139) à V.M. et (T32AI060546) à H.M.K.

La culture continue de P. falciparum nécessite l’utilisation de globules rouges humains, et nous avons utilisé des unités achetées dans le commerce du sang qui ont été dépouillés de tous les identificateurs et rendues anonymes. L’Institutional Review Board et le Bureau de la biosécurité à l’Université de Georgia revu nos protocoles et approuvé tous les protocoles utilisés dans notre laboratoire.
1. choisir un gRNA séquence
<ol><li>Allez dans CHOPCHOP (http://cho...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2017).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Florentin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PfClpC+Is+an+Essential+Clp+Chaperone+Required+for+Plastid+Integrity+and+Clp+Protease+Stability+in+Plasmodium+falciparum.">PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum.</a> Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+110+stabilizes+the+asparagine+repeat-rich+parasite+proteome+during+malarial+fevers.">Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers.</a> Nature Communications. 3, 1310 (2012).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine+repeat+function+in+a+Plasmodium+falciparum+protein+assessed+via+a+regulatable+fluorescent+affinity+tag.">Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).</li><li>Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEX+component+HSP101+mediates+export+of+diverse+malaria+effectors+into+host+erythrocytes.">PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes.</a> Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).</li><li>Ghorbal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).</li><li>Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum.">Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum.</a> Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+and+the+generation+of+diversity+in+malaria+parasites.">Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).</li><li>Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Repair+Mechanisms+and+Their+Biological+Roles+in+the+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).</li><li>Cobb, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exported+Chaperone+PfHsp70x+Is+Dispensable+for+the+Plasmodium+falciparum+Intraerythrocytic+Life+Cycle.">The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle.</a> mSphere. 2 (5), (2017).</li><li>Prommana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+knockdown+of+Plasmodium+gene+expression+using+the+glmS+ribozyme.">Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme.</a> Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).</li><li>Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+RNA-protein+modules+integrated+with+native+translation+mechanisms+to+control+gene+expression+in+malaria+parasites.">Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites.</a> Nature Communications. 7, 10727 (2016).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Drew, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+food+vacuole+plasmepsins+are+activated+by+falcipains.">Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).</li><li>Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Plasmodium+falciparum+within+human+red+blood+cells.">Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).</li><li>Janse, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transfection+of+Plasmodium+berghei+facilitates+novel+selection+procedures.">High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).</li><li>Counihan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+parasites+deploy+RhopH2+into+the+host+erythrocyte+to+obtain+nutrients,+grow+and+replicate.">Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+plasmepsin+II+to+the+food+vacuole+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li><li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuPaGDT:+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens.">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).</li><li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/CAS9.">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li><li>Janssen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+modification+and+gene+knock+out+in+the+human-infective+parasite+Trichomonas+vaginalis.">CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).</li><li>Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperonin+TRiC+forms+an+oligomeric+complex+in+the+malaria+parasite+cytosol.">The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol.</a> Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).</li><li>Brancucci, N. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylcholine+Regulates+Sexual+Stage+Differentiation+in+the+Human+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Cell. , (2017).</li><li>Ng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-modified+pfmdr1+protects+Plasmodium+falciparum+asexual+blood+stages+and+gametocytes+against+a+class+of+piperazine-containing+compounds+but+potentiates+artemisinin-based+combination+therapy+partner+drugs.">CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs.</a> Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).</li><li>Lim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-galactose+and+acetyl-CoA+transporters+as+Plasmodium+multidrug+resistance+genes.">UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Adjalley, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+Plasmodium+falciparum+sexual+development+reveals+potent+transmission+blocking+activity+by+methylene+blue.">Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).</li><li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes.">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li><li>Amberg-Johnson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+apicomplexan+FtsH1+disrupts+plastid+biogenesis+in+human+pathogens.">Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens.</a> elife. 6, (2017).</li><li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-free+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum+confirms+mutations+conferring+resistance+to+the+dihydroisoquinolone+clinical+candidate+SJ733.">Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733.</a> Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).</li></ol>

La mise en œuvre de CRISPR/Cas9 à P. falciparum a augmenté l’efficacité des et diminution de la quantité de temps nécessaire pour modifier le génome du parasite, par rapport aux précédentes méthodes de manipulation génétique. Ce protocole complet décrit les étapes nécessaires pour générer des mutants conditionnels à l’aide de CRISPR/Cas9 à P. falciparum. Alors que la méthode ici est conçue spécifiquement pour la génération de HA -MLG mutants, cette stratégie peut ê...

Le paludisme est une maladie dévastatrice causée par des protozoaires parasites du genre Plasmodium. P. falciparum, le parasite du paludisme humain mortel la plupart, provoque environ 445 000 décès par an, principalement chez les enfants âgés de moins de cinq1. Les parasites Plasmodium ont un cycle de vie complexe impliquant un moustique vecteur et un hôte vertébré. Tout d’abord, les humains sont infectent lorsqu’un moustique infecté prend un repas de sang. Ensuite, le parasite envahit le foie où il grandit, se développe et se divise pour environ une semaine. Après ce processus, les parasites sont libérées dans la circulation sanguine, où ils subissent la réplication asexuée en globules rouges (hématies). La croissance des parasites dans les globules rouges sont directement responsables des symptômes cliniques associés à paludisme2.
Jusqu'à récemment, la production de transgéniques à P. falciparum était un processus laborieux, impliquant plusieurs cycles de sélection de médicaments qui a pris plusieurs mois et avait un taux d’échec élevé. Cette procédure longue relieson la génération de l’ADN au hasard brise dans la région d’intérêt et la capacité endogène du parasite pour réparer son génome mais réparation homologue3,4,5,6 . Récemment, groupés régulièrement entrecoupées palindromique Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) édition de génome a été avec succès utilisé à P. falciparum7,8. L’introduction de cette nouvelle technologie en recherche sur le paludisme a été essentielle pour faire progresser la compréhension de la biologie de ces parasites Plasmodium mortelles. CRISPR/Cas9 permet un ciblage spécifique des gènes via guide ARN (gRNAs) qui sont homologues au gène d’intérêt. Le complexe gRNA/Cas9 reconnaît le gène par l’intermédiaire de la gRNA et Cas9 introduit ensuite une pause bicaténaires, forçant le déclenchement des mécanismes de réparation de l’organisme9,10. Parce que P. falciparum n’a pas le matériel pour réparer les cassures de l’ADN par jonction fin non homologue, elle utilise des mécanismes de recombinaison homologue et intègre les matrices d’ADN homologues transfectées pour réparer la Cas9/gRNA-induite cassure double brin11,12.
Nous présentons ici un protocole pour la génération de mutants knockdown conditionnelles à P. falciparum en utilisant CRISPR/Cas9 génome édition. Le protocole montre l’utilisation de la ribozyme MLG à des niveaux de protéine conditionnellement knockdown de PfHsp70x (PF3D7_0831700), un chaperon exportés par P. falciparum dans hôte RBCs13,14. Le ribozyme MLG est activé par un traitement avec la glucosamine (qui est converti en glucosamine-6-phosphate dans les cellules) pour s’attacher son ARNm associé, conduisant à une réduction de la protéine14. Ce protocole peut être facilement adapté pour utiliser les autres outils knockdown conditionnelles, comme domaines de déstabilisation ou RNA aptamères4,5,15. Les détails de notre protocole la génération d’un plasmide de réparation consistant en une hémagglutinine (HA) balise et MLG ribozyme séquence flanqué par des séquences de codage qui sont homologues à la PfHsp70x cadre de lecture ouvert (ORF) et 3'-UTR. Nous décrivons également la génération d’un deuxième plasmide à l’expression de la promenade de la gRNA. Ces deux plasmides, ainsi qu’un troisième qui anime l’expression de Cas9, sont transfectés dans des globules rouges et permet de modifier le génome des parasites P. falciparum . Enfin, nous décrivons une réaction en chaîne par polymérase (PCR)-fondée technique pour vérifier l’intégration de la balise et MLG ribozyme. Ce protocole est hautement adaptable pour la modification ou la complète élimination directe de gènes à P. falciparum , améliorer notre capacité à générer de nouvelles connaissances sur la biologie du parasite de la malaria.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>We buy the ones that are individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSM1</td>
			<td>Gift from Akhil Vaidya lab</td>
			<td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 6 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 96 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 24 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BtgZI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0703L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0157L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Afe1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0652S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Steritop bottle top filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td>You can use any size that fits your needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK-U6</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHA-glmS</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUF1-Cas9</td>
			<td>Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab</td>
			<td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9636-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1895-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PL6-eGFP BSD</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puf1-cas9 eGFP gRNA</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Red Blood Cells</td>
			<td>Interstate Blood Bank, Inc</td>
			<td>Email or call them directly for ordering</td>
			<td>We typically use O+ blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D7 parasite line</td>
			<td>Available upon request</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>You can make your own, it is not necessary to use exactly this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>R050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-EF1alpha</td>
			<td>Dr. Daniel Goldberg&#39;s Lab</td>
			<td>Washington University in St. Louis</td>
			<td>You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal</td>
			<td>Made by Roche, sold by Sigma</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>You can use your preferred anti-HA antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-122-911</td>
			<td>You can also use giemsa stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in.</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum

Le paludisme est une cause importante de morbidité et de mortalité dans le monde entier. Cette maladie, qui touche principalement les personnes qui vivent dans les régions tropicales et subtropicales, est causée par une infection par les parasites Plasmodium . Le développement de médicaments plus efficaces pour lutter contre le paludisme peut être accéléré en améliorant notre compréhension de la biologie de ce parasite complexe. La manipulation génétique de ces parasites est essentielle pour comprendre leur biologie ; Toutefois, historiquement le génome de P. falciparum est difficile à manipuler. Récemment, CRISPR/Cas9 génome édition a été utilisé dans les parasites du paludisme, permettant une protéine plus facile étiquetant, génération de passes rabattues protéine conditionnelle et délétion de gènes. CRISPR/Cas9 génome édition s’est avéré pour être un outil puissant pour faire progresser le domaine de la recherche sur le paludisme. Nous décrivons ici une méthode CRISPR/Cas9 pour générer des MLG-base conditionnelles knockdown mutants chez P. falciparum. Cette méthode est très adaptable à d’autres types de manipulations génétiques, y compris le marquage de protéines et les masquages de gène.

Figure 1montre une représentation schématique des plasmides utilisés dans cette méthode, mais aussi un exemple d’une mutation de bouclier. Comme un exemple de comment identifier les parasites mutants après la transfection, résultats de PCR pour vérifier l’intégration de la construction deMLG HA - sont indiquées à la Figure 2. Une image représentative d’une plaque de clonage est montrée à la <strong cla...

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CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gène édition à faire conditionnel Mutants de Human Parasite du paludisme à P. falciparum

Les auteurs décrivent une méthode pour générer des MLG-base conditionnelles mutants knockdown de Plasmodium falciparum à l’aide de CRISPR/Cas9 génome édition.

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans la biologie du parasite humain du paludisme, P.Falciparum, en aidant à découvrir la fonction protéique par knockdown conditionnel. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une génération relativement facile de mutants conditionnels par rapport aux méthodes précédentes. Pour commencer, allez à Chop Chop et sélectionnez Fasta Target’Under Target, coller les 200 paires de base à partir des trois extrémités principales de l’image de lecture ouverte d’un gène et 200 paires de base dès le début des trois UTR principaux du gène.Sous In’select P.Falciparum’and select CRISPR/Cas9'under Using’Next, cliquez sur Trouver les sites cibles Sélectionnez une séquence d’ARN gRNA à partir des options présentées, en donnant la préférence à l’ARN gRNA le plus efficace qui est le plus proche du site de modification et qui a le moins de sites hors cible. Achetez la séquence de gRNA et son complément inverse comme électrophoresis purifiés de gel de polyacrylamide. La séquence gRNA utilisée pour cibler PfH-sp70x se trouve dans le protocole texte.Ajouter 40 microgrammes chacun d’ADN pMK-U6, pUF1-Cas9 et pHA-glmS dans un tube de centrifugeuse stérile de 1,5 millimètre. Ajouter un dixième du volume d’ADN de trois acétate de sodium molaire dans l’eau au tube et bien mélanger à l’aide d’un vortex. Ensuite, ajoutez 2,5 fois le volume d’éthanol à 100 pour cent au tube et mélangez-le bien à l’aide d’un vortex pendant au moins 30 secondes.Placez le tube sur la glace ou à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes. Puis, centrifugez le tube à 18 300 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, retirer soigneusement le supernatant du tube sans déranger la pastille.Ajouter trois fois le volume de 70 pour cent d’éthanol au tube et mélanger brièvement à l’aide d’un vortex. Centrifuger le tube à 18 300 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Encore une fois, retirez soigneusement le surnatant du tube sans déranger la pastille.Laissez le tube ouvert et laissez la pastille sécher à l’air libre pendant 15 minutes. Conservez l’ADN précipité à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit nécessaire pour la transfection. Pour transfect RBCs, préparer 1X tampon cytomix ainsi que incomplète et complète RPMI tel que décrit dans le protocole de texte.Filtre stériliser le tampon à l’aide d’un filtre de 0,22 micron. Ajouter 380 microlitres du cytomix 1X à l’ADN et au vortex pour dissoudre. Laisser l’ADN se dissoudre dans le cytomix 1X pendant 10 minutes, vortexing toutes les trois minutes pendant 10 secondes.Dans un tube conique stérile de 15 millilitres, combinez 300 microlitres de RBCs humains isolés dans le RPMI incomplet avec quatre millilitres de cytomix de 1X. Centrifuger les RBCs à 870 fois G pendant trois minutes. Retirez ensuite le surnatant de la pastille RBC.Suspendre à nouveau la pastille RBC avec le mélange ADN-cytomix et la transférer dans une cuvette d’électroporation de 0,2 centimètre. Porate les RBCs en utilisant les conditions énumérées dans le protocole de texte. Après électroporation, transférer le contenu de la cuvette à un tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de RPMI complet.Centrifuger le tube à 870 fois G pendant trois minutes à 20 degrés Celsius. Puis, décanter le surnatant. Maintenant, suspendez la pastille en quatre millilitres de RPMI complet et transférez-la à un puits dans une plaque de culture tissulaire de six puits.Ajouter 400 microlitres d’une culture schizont élevée aux RBCs transférés. Maintenir toutes les cultures à 37 degrés Celsius sous 3 % d’oxygène, 3 % de CO2 et 94 % d’azote. Le lendemain, lavez la culture avec quatre millilitres de RPMI complet.Centrifuger la culture à 870 fois G pendant trois minutes. Aspirez le surnatant. Suspendre à nouveau la culture en quatre millilitres de RPMI complet.48 heures plus tard, laver la culture avec quatre millilitres de RPMI complet. Ensuite, re-suspendre la culture en RPMI complet contenant un micromolaire DSM1 à sélectionner pour le plasmide Cas9. Après ce point, remplacez le milieu de culture par rpmi complet frais plus un micromolaire DSM1 toutes les 48 heures.Continuez à laver les cultures chaque jour avec un RPMI complet jusqu’à ce que les parasites ne soient plus visibles par le frottis sanguin. Pour faire un frottis sanguin, pipette 150 microlitres de culture dans un tube centrifugeuse de 0,6 millilitre. Après avoir granulé les cellules par centrifugation à 1700 fois G pendant 30 secondes, aspirer le supernatant.Utilisez une pipette pour transférer les cellules granulées sur une glissière en verre. À l’aide d’une deuxième glissière en verre maintenue à un angle de 45 degrés par rapport à la première diapositive, enduitez la gouttelette de sang. Tacher la lame à l’aide d’un kit de coloration disponible dans le commerce selon le protocole du fabricant.Voir les parasites en utilisant 100 fois l’objectif d’immersion d’huile. À partir de cinq jours après la transfection, enlever deux millilitres de la culture avec rbcs re-suspendu dans le milieu culturel. Ajouter deux millilitres de milieu frais et le sang à deux pour cent d’hématocrit.Ajouter le sang frais de cette façon une fois par semaine jusqu’à ce que le parasite réapparaisse, tel que déterminé par un frottis sanguin mince. Effectuer des dilutions périodiques de la culture parasitaire pour atteindre une concentration finale de 0,5 parasite par 200 microlitres. Ajouter 200 microlitres de la culture diluée aux puits d’une plaque de culture tissulaire de 96 puits.Maintenir la plaque de clonage jusqu’à ce que les parasites soient détectables dans les puits. Toutes les 48 heures, remplacer le milieu dans l’assiette de 96 puits par un milieu frais. Une fois par semaine, à partir de cinq jours après le début de la plaque de clonage, retirer 100 microlitres de chaque puits et ajouter 100 microlitres de milieu frais plus le sang.Pour identifier les puits contenant des parasites, placez la plaque de 96 puits à un angle de 45 degrés pendant environ 20 minutes, ce qui permet au sang de s’installer à un angle à l’intérieur de la plaque. Ensuite, placez la plaque de 96 puits sur une boîte lumineuse. Notez que les puits contenant des parasites contiennent des supports de couleur jaune, par rapport au milieu rose des puits exempts de parasites, en raison de l’acidification du milieu par les parasites.À l’aide d’une pipette sérologique, déplacez le contenu des puits contenant des parasites vers une plaque de culture tissulaire de 24 puits pour permettre l’expansion de la parasitemie. À l’aide de l’analyse PCR, vérifiez ces lignées de parasites clonals pour une intégration correcte. Les résultats d’un essai d’immunofluorescence sont montrés ici, démontrant le marquage réussi de HA de PfH-sp70x.Les parasites de PfH-sp70x glmS ont été fixés et tachés avec DAPI comme marqueur de noyau, aussi bien que des anticorps à HA. Protéine riche en histidine associée à la membrane, un marqueur de l’exportation de protéines vers l’hôte RBC. Une analyse occidentale de tache du niveau de protéine de PfH-sp70x après traitement avec la glucosamine est montrée ici. Comme prévu, le niveau de protéines diminue pendant la durée du traitement.Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la parasitologie pour étudier les questions fondamentales dans la biologie du parasite du paludisme. Il est important de se rappeler que P.Falciparum est un agent pathogène transmis par le sang et que l’équipement de protection individuelle approprié doit être porté pendant l’exécution de cette procédure.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Mapping QTL et édition CRISPR / Cas9 pour identifier un gène de résistance aux médicaments<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Recherche

Génétique

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

L&#39;utilisation d&#39;un PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Génération indépendante et dépendante de la sélection de CRISPR / Cas9-Meded Knockouts dans les cellules de mammifères

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Une méthode Standard pour examiner la mutagénicité sur place en fonction de la Mutation ponctuelle de réparation catalysée par CRISPR/Cas9 et SsODN dans les cellules humaines

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection de protéine CRISPR/Cas9 dans des embryons de barbue de rivière, Ictalurus punctatus, pour Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Un rapide et Facile de Pipeline pour générer des Mutants de Point génomique dans c. elegans en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Génération de modifications génomiques définies à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascoycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...