Name: crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum at JoVE.com

אנו מודים kandasamy ב Muthugapatti בתוך ליבת מיקרוסקופ הביו-רפואית מאוניברסיטת ג'ורג'יה (עוגה) לקבלת סיוע טכני, חואן חוסה לופז-רוביו על שיתוף של פלסמידים pUF1-Cas9 ו- pL6. עבודה זו נתמכה על ידי קשתות קרן פרסים D.W.C., H.M.K., עוגה כספים אתחול כדי V.M., מענקים מקרן מרץ של מטבעות (בזיליקום אוקונור Starter מלומד מחקר פרס) V.M., לנו מכון הבריאות הלאומי מעניק (R00AI099156, R01AI130139) כדי V.M., (T32AI060546) כדי H.M.K.

תרבות רציפה של falciparum פ מחייב שימוש RBCs האנושי, אנחנו מנוצל היחידות שנרכשו מסחרית של דם היו ללא כל מזהי, תשוחררנה. ועדת הבדיקה מוסדיים ו- Office של אבטחה ב אוניברסיטה של גאורגיה לסקור את כל מנגנוני ואושר כל הפרוטוקולים בשימוש המעבדה שלנו.
1. בחירת gRNA רצף
<ol><li>ללכת צ'ופצ'ופ (http://...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2017).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Florentin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PfClpC+Is+an+Essential+Clp+Chaperone+Required+for+Plastid+Integrity+and+Clp+Protease+Stability+in+Plasmodium+falciparum.">PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum.</a> Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+110+stabilizes+the+asparagine+repeat-rich+parasite+proteome+during+malarial+fevers.">Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers.</a> Nature Communications. 3, 1310 (2012).</li><li>Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine+repeat+function+in+a+Plasmodium+falciparum+protein+assessed+via+a+regulatable+fluorescent+affinity+tag.">Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).</li><li>Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEX+component+HSP101+mediates+export+of+diverse+malaria+effectors+into+host+erythrocytes.">PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes.</a> Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).</li><li>Ghorbal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).</li><li>Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum.">Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum.</a> Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+and+the+generation+of+diversity+in+malaria+parasites.">Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).</li><li>Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Repair+Mechanisms+and+Their+Biological+Roles+in+the+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).</li><li>Cobb, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exported+Chaperone+PfHsp70x+Is+Dispensable+for+the+Plasmodium+falciparum+Intraerythrocytic+Life+Cycle.">The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle.</a> mSphere. 2 (5), (2017).</li><li>Prommana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+knockdown+of+Plasmodium+gene+expression+using+the+glmS+ribozyme.">Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme.</a> Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).</li><li>Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+RNA-protein+modules+integrated+with+native+translation+mechanisms+to+control+gene+expression+in+malaria+parasites.">Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites.</a> Nature Communications. 7, 10727 (2016).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Drew, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+food+vacuole+plasmepsins+are+activated+by+falcipains.">Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).</li><li>Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Plasmodium+falciparum+within+human+red+blood+cells.">Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).</li><li>Janse, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transfection+of+Plasmodium+berghei+facilitates+novel+selection+procedures.">High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).</li><li>Counihan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+parasites+deploy+RhopH2+into+the+host+erythrocyte+to+obtain+nutrients,+grow+and+replicate.">Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+plasmepsin+II+to+the+food+vacuole+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li><li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuPaGDT:+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens.">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).</li><li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/CAS9.">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li><li>Janssen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+modification+and+gene+knock+out+in+the+human-infective+parasite+Trichomonas+vaginalis.">CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).</li><li>Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperonin+TRiC+forms+an+oligomeric+complex+in+the+malaria+parasite+cytosol.">The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol.</a> Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).</li><li>Brancucci, N. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylcholine+Regulates+Sexual+Stage+Differentiation+in+the+Human+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum.">Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Cell. , (2017).</li><li>Ng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-modified+pfmdr1+protects+Plasmodium+falciparum+asexual+blood+stages+and+gametocytes+against+a+class+of+piperazine-containing+compounds+but+potentiates+artemisinin-based+combination+therapy+partner+drugs.">CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs.</a> Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).</li><li>Lim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UDP-galactose+and+acetyl-CoA+transporters+as+Plasmodium+multidrug+resistance+genes.">UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Adjalley, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+Plasmodium+falciparum+sexual+development+reveals+potent+transmission+blocking+activity+by+methylene+blue.">Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).</li><li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes.">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li><li>Amberg-Johnson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+apicomplexan+FtsH1+disrupts+plastid+biogenesis+in+human+pathogens.">Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens.</a> elife. 6, (2017).</li><li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-free+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum+confirms+mutations+conferring+resistance+to+the+dihydroisoquinolone+clinical+candidate+SJ733.">Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733.</a> Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).</li></ol>

היישום של CRISPR/Cas9 ב falciparum פ יש את יעילות של והן ירד כמות הזמן הנדרשת עבור שינוי הגנום של הטפיל, לעומת שיטות קודמות של הנדסה גנטית. פרוטוקול מקיף זה מתאר את השלבים הנחוצים ליצירת מוטציות מותנה באמצעות CRISPR/Cas9 ב פ falciparum. בעוד השיטה כאן מיועדת במיוחד עבור הדור של HA -glmS מוטציות, אסטרט...

מלריה היא מחלה הרסנית הנגרמת על ידי טפילים protozoan של הסוג הפלזמודיום. Falciparum פ, טפיל המלריה קטלני אנושי ביותר, גורמת כ 445,000 מקרי מוות בשנה, בעיקר אצל ילדים מתחת לגיל חמש1. הפלזמודיום טפילים יש מחזור החיים מסובכים מעורבים וקטור יתוש לבין מחשב מארח חוליות. בני האדם הראשונים להידבק כאשר עקיצת היתוש הנגוע לוקח ארוחת דם. לאחר מכן, הטפיל פולש הכבד שבו זה גדל, מתפתח, מחלק למשך שבוע. לאחר תהליך זה, הטפילים משתחררים לזרם הדם, שם הם עוברים אל-זוויגית שכפול בתאי דם אדומים (RBCs). הצמיחה של הטפילים בתוך RBCs אחראים ישירות סימפטומים קליניים הקשורים עם מלריה2.
עד לאחרונה, ייצור הטרנסגניים falciparum פ היה תהליך מפרך, מעורבים כמה סבבים של מבחר סמים זה לקח חודשים רבים, היה שיעור גבוה כשל. Relieson זמן רב בהליך זה הדור של DNA אקראי שובר האזור עניין ויכולת אנדוגני של הטפיל לתקן את הגנום שלו למרות תיקון הומולוגי3,4,5,6 . לאחרונה, עריכה הגנום מקובצים באופן קבוע Interspaced Palindromic חוזר/Cas9 (CRISPR/Cas9) יש כבר בהצלחה מנוצל falciparum פ7,8. המבוא של טכנולוגיה חדשה זו במחקר המלריה כבר קריטי לקידום ההבנה של הביולוגיה של אלה טפילים הפלזמודיום קטלני. CRISPR/Cas9 מאפשר מיקוד ספציפי של גנים דרך מדריך RNAs (gRNAs) כי הם הומולוגיים אל הגן עניין. GRNA/Cas9 מורכבים מזהה את הגן דרך gRNA, Cas9 מציג ואז הפסקה כפולה-strand, מכריח את החניכה של מנגנוני תיקון האורגניזם9,10. כי falciparum פ חסר המנגנון כדי לתקן את ה-DNA פורץ דרך קצה שאינם הומולוגיים להצטרף, זה מנצל מנגנונים רקומבינציה הומולוגית ו משתלב transfected תבניות DNA הומולוגי כדי לתקן את Cas9/gRNA-induced זוגיות-strand break11,12.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדור של מוטציות תמונות ציפורים מותנה ב- falciparum פ באמצעות עריכת הגנום CRISPR/Cas9. הפרוטוקול מדגים את השימוש ריבוזים glmS רמות חלבון מותנית תמונות ציפורים של PfHsp70x (PF3D7_0831700), מלווה ב"יצוא falciparum פ לתוך המארח RBCs13,14. ריבוזים glmS מופעל על-ידי טיפול עם גלוקוזאמין (אשר מומר גלוקוזאמין-6-פוספט בתאים) כדי לדבוק mRNA המשויכת שלו, מוביל לירידה חלבון14. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לנצל כלים תמונות ציפורים מותנה אחרים, כגון הקשורה תחומים או RNA aptamers4,5,15. פרטי פרוטוקול שלנו הדור של פלסמיד תיקון המורכב hemagglutinin (HA) תג ו glmS ריבוזים קידוד רצף ולצדו רצפים שהם הומולוגי מסגרת קריאה פתוחה PfHsp70x (ORF) ו- 3'-UTR. אנו מתארים גם את הדור של פלסמיד השני נסיעה כביטוי של gRNA. פלסמידים אלה שני, לצד שלישי שמניע את הביטוי של Cas9, transfected לתוך RBCs, כדי לשנות את הגנום של טפילים falciparum פ . לבסוף, אנו מתארים את תגובת שרשרת פולימראזית (PCR)-מבוסס טכניקה כדי לוודא שילוב של ריבוזים התג ואת glmS . פרוטוקול זה הוא מאוד וישימה עבור שינוי או הסתרה מלאה של כל הגנים falciparum פ , שיפור היכולת שלנו ליצור תובנות חדשות הביולוגיה של טפיל המלריה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>We buy the ones that are individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSM1</td>
			<td>Gift from Akhil Vaidya lab</td>
			<td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 6 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 96 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP Tissue Culture 24 Well Plates</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>TP92024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#B7202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BtgZI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0703L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0157L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Afe1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R0652S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#R3131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Steritop bottle top filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
			<td>You can use any size that fits your needs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMK-U6</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHA-glmS</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUF1-Cas9</td>
			<td>Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab</td>
			<td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9636-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1895-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PL6-eGFP BSD</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puf1-cas9 eGFP gRNA</td>
			<td>Generated by the Muralidharan Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumax I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Red Blood Cells</td>
			<td>Interstate Blood Bank, Inc</td>
			<td>Email or call them directly for ordering</td>
			<td>We typically use O+ blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D7 parasite line</td>
			<td>Available upon request</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>You can make your own, it is not necessary to use exactly this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td>We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>R050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-EF1alpha</td>
			<td>Dr. Daniel Goldberg&#39;s Lab</td>
			<td>Washington University in St. Louis</td>
			<td>You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal</td>
			<td>Made by Roche, sold by Sigma</td>
			<td>11867423001</td>
			<td>You can use your preferred anti-HA antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-122-911</td>
			<td>You can also use giemsa stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in.</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 gene editing to make conditional mutants of human malaria parasite p. falciparum

מלריה היא גורם משמעותי התחלואה והתמותה ברחבי העולם. מחלה זו, המשפיעה בעיקר הגרים באזורים טרופיים וסובטרופיים, נגרמת על ידי זיהום עם הפלזמודיום טפילים. הפיתוח של תרופות יעילות יותר מלריה לחימה יכול להיות מואץ על ידי שיפור ההבנה שלנו של הביולוגיה של טפיל זה מורכב. הנדסה גנטית של טפילים אלו הוא מפתח להבנת הביולוגיה שלהם; עם זאת, מבחינה היסטורית הגנום של falciparum פ היה קשה לתמרן. לאחרונה, CRISPR/Cas9 הגנום עריכה יש כבר מנוצל טפילי מלריה, המאפשרות קל יותר חלבון תיוג, דור של חלבון מותנה נפילות, ומחיקה של גנים. CRISPR/Cas9 הגנום עריכה הוכיחה להיות כלי רב עוצמה לקדם את תחום המחקר מלריה. כאן, אנו מתארים שיטה CRISPR/Cas9 ליצירת glmS-המבוסס על מוטציות תמונות ציפורים מותנה ב- falciparum פ. שיטה זו היא וישימה מאוד לסוגים אחרים של שינויים גנטיים, כולל חלבון תיוג והסתרות ג'ין.

תיאור סכמטי של פלסמידים בשימוש בשיטה זו, כמו גם דוגמה של מוטציה מגן מוצגים באיור1. כדוגמה כיצד לזהות טפילים מוטציה לאחר תרביות תאים, תוצאות מותני לבדיקת קליטת HA -glmS לבנות מוצגים באיור2. תמונת הנציגה של צלחת שיבוט מוצג באיור</...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum at JoVE.com

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

אנו מתארים שיטה ליצירת glmS-המבוסס על מוטציות תמונות ציפורים מותנה ב- falciparum הפלזמודיום באמצעות עריכת הגנום CRISPR/Cas9.

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של טפיל המלריה האנושי, P.Falciparum, על ידי עוזר לחשוף את תפקוד החלבון באמצעות הפלה מותנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ייצור קל יחסית של מוטנטים מותנים בהשוואה לשיטות קודמות. כדי להתחיל, עבור אל צ'ופ צ'ופ ובחר Fasta Target'Under Target, הדבק את 200 זוגות הבסיס משלושת החלקים הראשונים של מסגרת הקריאה הפתוחה של גן ו-200 זוגות בסיס מתחילת שלושת ה- UTR העיקריים של הגן.תחת In'select P.Falciparum' ובחר CRISPR/Cas9'under באמצעות'הבא', לחץ על חפש אתרי יעד'בחר רצף gRNA מהאפשרויות המוצגות, תוך מתן עדיפות ל- gRNA היעיל ביותר הקרוב ביותר לאתר השינוי ויש לו את האתרים הכי מעט מחוץ ליעד. לרכוש את רצף gRNA ואת המשלים ההפוך שלה כמו אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד מטוהר אוליגוס. רצף gRNA המשמש למטרה PfH-sp70x ניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט.הוסיפו 40 מיקרוגרם כל אחד מדנ"א pMK-U6, pUF1-Cas9 ו-pHA-glmS לצינור צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מילימטר. מוסיפים עשירית מנפח הדנ"א של שלושה נתרן אצטט טוחן במים לצינור ומערבבים אותו היטב באמצעות מערבולת. לאחר מכן, להוסיף 2.5 פעמים את הנפח של 100 אחוז אתנול לצינור ומערבבים אותו היטב באמצעות מערבולת לפחות 30 שניות.מניחים את הצינור על קרח או במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור ב 18, 300 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant מהצינור מבלי להפריע גלולה.מוסיפים פי שלושה מהנפח של 70 אחוז אתנול לצינור ומערבבים אותו בקצרה באמצעות מערבולת. צנטריפוגה הצינור ב 18, 300 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שוב, בזהירות להסיר את supernatant מהצינור מבלי להפריע גלולה.השאירו את הצינור פתוח ואפשרו לכדור להתייבש במשך 15 דקות. לאחסן את ה-DNA זירז במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהוא נחוץ עבור transfection. כדי לבצע חילוף של RBCs, הכן מאגר ציטומיקס 1X וכן RPMI לא שלם ומלא כמתואר בפרוטוקול הטקסט.המסנן מעקר את המאגר באמצעות מסנן 0.22 מיקרון. הוסף 380 מיקרוליטרים של ציטומיקס 1X ל- DNA ומערבולת להתמוסס. אפשר לדנ"א להתמוסס בציטומיקס 1X במשך 10 דקות, מערבולת כל שלוש דקות במשך 10 שניות.בצינור חרוט סטרילי, 15 מיליליטר, לשלב 300 microliters של RBCs אנושי מבודד RPMI שלם עם ארבעה מיליליטר של ציטומיקס 1X. צנטריפוגה RBCs ב 870 פעמים G במשך שלוש דקות. לאחר מכן הסר את העל-טבעי מהכדור של RBC.להשעות מחדש את גלולת RBC עם תערובת DNA-cytomix ולהעביר אותו 0.2 ס"מ אלקטרופולציה cuvette. חטט ב- RBCs באמצעות התנאים המפורטים בפרוטוקול הטקסט. לאחר אלקטרופורציה, להעביר את התוכן מן cuvette לצינור חרוט 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של RPMI מלא.צנטריפוגה הצינור ב 870 פעמים G במשך שלוש דקות ב 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, תכרית את העל-טבעי. עכשיו, להשעות מחדש את גלולה בארבעה מיליליטר של RPMI להשלים ולהעביר ל באר אחת בצלחת תרבות רקמות שש בארות.הוסף 400 microliters של תרבות schizont גבוהה RBCs שהועברו. לשמור על כל התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס תחת שלושה אחוז חמצן, שלושה אחוז CO2, ו 94 אחוז חנקן. למחרת, לשטוף את התרבות עם ארבעה מיליליטר של RPMI מלא.צנטריפוגה התרבות ב 870 פעמים G במשך שלוש דקות. שאף את העל-טבעי. להשעות מחדש את התרבות בארבעה מיליליטר של RPMI מלא.48 שעות מאוחר יותר, לשטוף את התרבות עם ארבעה מיליליטר של RPMI מלא. לאחר מכן, השהה מחדש את התרבות ב- RPMI מלא המכיל DSM1 מיקרומולארי אחד כדי לבחור עבור פלסמיד Cas9. לאחר נקודה זו, החלף את מדיום התרבות עם RPMI שלם טרי בתוספת DSM1 micromolar אחד כל 48 שעות.המשך לשטוף את התרבויות כל יום עם RPMI מלא עד טפילים אינם נראים עוד על ידי מריחת דם. כדי להפוך את כתם דם, פיפטה 150 microliters של תרבות לתוך צינור צנטריפוגה 0.6 מיליליטר. לאחר pelleting את התאים על ידי צנטריפוגה ב 1, 700 פעמים G במשך 30 שניות, שאף את העל טבעי.השתמש פיפטה כדי להעביר את התאים גלולה לשקופית זכוכית. באמצעות מגלשת זכוכית שנייה המוחזקת בזווית של 45 מעלות למגלשה הראשונה, מורחים את טיפת הדם. הכתם את השקופית באמצעות ערכת כתמים מסחרית זמינה בהתאם לפרוטוקול היצרן.הצג את הטפילים באמצעות 100 פעמים מטרת טבילת שמן. החל מחמישה ימים לאחר transfection, להסיר שני מיליליטר של התרבות עם RBCs מושעה מחדש במדיום התרבות. מוסיפים בחזרה שני מיליליטר של מדיום טרי ודם בשני אחוז המטוקריט.מוסיפים דם טרי באופן זה פעם בשבוע עד שהטפיל מופיע שוב, כפי שנקבע על ידי מריחת דם דקה. בצע דילול סדרתי של תרבות הטפילים כדי להשיג ריכוז סופי של 0.5 טפילים לכל 200 מיקרוליטרים. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של התרבות המדולללת ל בארות של צלחת תרבות רקמות בת 96 בארות.שומרים על צלחת השיבוט עד שניתן לזהות טפילים בארות. כל 48 שעות, החלף את המדיום בצלחת 96 היטב עם בינוני טרי. פעם בשבוע, החל מחמישה ימים לאחר תחילת צלחת השיבוט, להסיר 100 microliters מכל באר ולהוסיף בחזרה 100 microliters של מדיום טרי בתוספת דם.כדי לזהות בארות המכילות טפילים, מניחים את צלחת 96 באר בזווית של 45 מעלות במשך כ 20 דקות, המאפשר לדם להתיישב בזווית בתוך הצלחת. לאחר מכן, מניחים את צלחת 96 באר על תיבת אור. שים לב כי בארות המכילות טפילים מכילים מדיה כי הוא צהוב בצבע, לעומת התקשורת הוורודה של בארות ללא טפילים, בשל חומציות של המדיום על ידי הטפילים.באמצעות פיפטה סרולוגית, להעביר את התוכן של בארות המכילות טפילים לצלחת תרבות רקמות 24 באר כדי לאפשר הרחבה של הטפיל. באמצעות ניתוח PCR, לבדוק אלה קווי טפיל שיבוט לשילוב נכון. התוצאות של בדיקה immunofluorescence מוצגים כאן, המדגים את התיוג HA בהצלחה של PfH-sp70x.טפילי PfH-sp70x glmS תוקנו והוכתמו ב-DAPI כסמן גרעין, כמו גם נוגדנים ל-HA. חלבון עשיר בהיסטידין הקשור לממברנה אחד, סמן של ייצוא חלבונים ל- RBC המארח. ניתוח כתם מערבי של רמת החלבון PfH-sp70x לאחר הטיפול עם גלוקוזאמין מוצג כאן. כצפוי, רמת החלבון יורדת במהלך הטיפול.טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הטפיל לחקור שאלות בסיסיות בביולוגיה של טפיל המלריה. חשוב לזכור כי P.Falciparum הוא פתוגן המועבר בדם וציוד מגן אישי מתאים צריך להיות משוחק בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

מיפוי QTL ו CRISPR / Cas9 עריכה לזהות ג &#39;ין ההתנגדות התרופה ב<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-מתווכת עריכת גנום ב- Ascomycete ההאנטילה אומנסיס נימה

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...